霍乱弧菌LAMP快速检测方法的建立及应用

目的 建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测霍乱弧菌.方法 针对霍乱弧菌外膜蛋白的ompW基因设计特异引物,优化反应条件,建立霍乱弧菌的LAMP检测方法.通过对47株细菌及模拟污染现场,检测该方法的灵敏度、特异度和实用性.结果 活菌计数方法表明建立的LAMP方法检测霍乱弧菌的灵敏度为1.6×10~2 cfu/ml.在人工污染霍乱弧菌的粪便及海水标本中检测的敏感度为1.6×10~3 cfu/ml,在牛奶标本中敏感度为1.6×10~4 cfu/ml.检测21株霍乱弧菌均为阳性,26株非霍乱菌则全部阴性,特异度为100%.结论 建立的LAMP方法检测霍乱弧菌灵敏度、特异度高,可用于霍乱现场监测和流行病学调查.

Abstract：

Objective To establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for rapid diagnosis of Vibrio cholerae. Method Based on the ompW nucleic sequence of Vibrio cholerae, a pair of primers was designed for LAMP. The reaction conditions were optimized, and the specificity, sensitivity, and practicability of LAMP were tested using 47 baterial strains and simulated contaminated sites. Results The results of viable bacterium count showed that LAMP was capable of detecting Vibrio cholerae at a level as low as 1.6×10~2 cfu/ml. The minimal detectable concentration was 1.6×10~3 cfu/ml for simulated contaminated samples such as feces and seawater, and 1.6×10~4 cfu/ml for contaminated milk. All the 21 strains of Vibrio cholerae yielded positive results in LAMP, and the 26 strains of other bacteria all showed negative results, with a detection specificity of 100%. Conclusion The established LAMP method has high specificity and sensitivity for detecting Vibrio cholerae and is applicable in field monitoring and epidemiological study of Vibrio cholerae.     

LAMP快速检测沙门菌invA基因的方法建立与应用

目的：建立一种环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）,反应快速检测沙门茵的方法。方法：根据美国国立卫生研究院基因序列数据库（GenBank）上的鼠伤寒沙门菌的特异invA和fimA（登录号：M90846和M18283）基因序列,设计特异引物,提取标本DNA,然后以LAMP技术扩增invA基因,PCR方法扩增厅棚基因,采用琼脂糖电泳观察结果。结果：91份血培养阳性报警瓶,LAMP和PCR法检测出阳性18份,与最终培养结果一致;30份粪便标本,LAMP和PCR法检测出阳性5份,培养阳性3份,LAMP测限达到10^2CFU／mL。结论：LAMP是一种简便、快速、特异和敏感的检测临床和环境标本中沙门菌的有效方法。     

快速检测单核细胞增生李斯特菌LAMP方法的建立

目的:建立一种检测单核细胞增生李斯特菌核酸的快速、特异的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification,LAMP)方法。方法:针对单核细胞增生李斯特菌的李斯特菌溶血素hlyA基因设计4条LAMP引物,在水浴箱内65℃保温约60 min,完成对单核细胞增生李斯特菌的扩增,扩增产物经肉眼、SYBR Green I染色和电泳鉴定。利用LAMP和PCR方法同时检测1株单核细胞增生李斯特菌和10株非单核细胞增生李斯特菌(对照组)来验证LAMP方法的特异性。用LAMP和PCR方法分别检测一系列稀释后的单核细胞增生李斯特菌菌液,比较两者的敏感性。结果:经肉眼、加染料和电泳均能观察到1株单核细胞增生李斯特菌LAMP扩增阳性反应,10株非单核细胞增生李斯特菌没有出现LAMP扩增。LAMP敏感度比PCR高,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌的检测下限为3 cfu/ml,PCR检测下限>300 cfu/ml。LAMP检测速度比PCR更快,只需要60 min。结论:建立了一种检测单核细胞增生李斯特菌的快速、特异的LAMP方法。     

LAMP方法检测霍乱弧菌的研究

目的建立一种快速检测霍乱弧菌的方法。方法利用霍乱弧菌的hlyA基因设计特异性引物,建立LAMP检测方法,以及优化反应体系,并进行LAMP的特异性和灵敏度实验,同时与普通PCR和荧光定量PCR进行比较。结果成功建立霍乱弧菌的LAMP检测方法,得到最优的反应体系,在特异性实验中,霍乱弧菌均呈阳性,而副溶血弧菌、溶藻孤菌、最小孤菌、1梅氏孤菌等均为阴性;在灵敏度实验中,霍乱弧菌的最低检测限为6.2pg／tube,是普通PCR的1000倍。比荧光定量PCR低一个数量级。结论LAMP方法具有很高的特异性和灵敏度,可用于霍乱孤菌的检测。     

树鼩粪便中沙门氏菌LAMP检测方法建立及应用

目的建立树鼩粪便沙门氏菌的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对此方法进行初步应用。方法根据沙门氏菌种属特异性基因inv A(侵袭蛋白基因A)的保守序列,设计合成特异性LAMP引物。分别设定十个反应温度即57℃~66℃和十个反应时间即24~42 min进行优化,并测定本方法的特异性和灵敏度;同时进行普通PCR实验,作为本方法的验证和比较。用建立的LAMP法对91份野生来源的树鼩稀便样品进行检测。结果优化反应条件选出反应温度为62℃,反应时间34 min;该方法对沙门氏菌的灵敏度可达3.36×101CFU/m L,比普通PCR方法高10~100倍;对10种树鼩来源的肠道细菌进行LAMP检测,只有沙门氏菌属的肠炎沙门氏菌和乙型副伤寒沙门氏菌检测为阳性,其余为阴性;对91份野生树鼩粪便样品进行LAMP检测,阳性检出率为20.88%;LAMP法的所有反应可在40 min内完成。结果可通过肉眼观察颜色变化直接判定。结论所建立的LAMP方法具有便捷、快速、灵敏、特异等特点,可用于树鼩粪便中沙门氏菌的大规模快速检测。     

LAMP技术检测弓形虫感染方法的建立

目的建立一种快速、简便的检测弓形虫感染的环介导等温扩增方法(LAMP)。方法根据弓形虫RH株SAG1基因序列合成2对特异性LAMP引物,优化扩增体系与参数。通过与常规PCR方法的比较,评估优化后的LAMP反应的特异性和灵敏性。利用建立的LAMP初步检测人工感染弓形虫4 d后白兔与大鼠的肌肉组织。结果 LAMP法检测弓形虫基因组DNA的灵敏度是传统PCR方法的100倍。LAMP法检测与其他常见寄生原虫、寄生虫无非特异性阳性结果。LAMP法检测人工接种动物的肌肉组织,阳性率达到100%,对照组为0,差异有统计学意义(P0.01)。结论 LAMP法检测弓形虫感染快速简便、敏感性高、设备要求低,具有较好的应用前景。     

实验动物金黄色葡萄球菌LAMP检测方法的建立

目的 建立一种能够应用于实验动物金黄色葡萄球菌检测及鉴定的环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)方法.方法 本研究针对金黄色葡萄球菌特异的nuc基因设计4条引物,对反应条件进行优化.结果 通过优化,该方法60℃、40 min、Mg2+浓度8 mmol/L、dNTP浓度2.0 mmol/L、甜菜碱浓度0.8mmol/L时,对金黄色葡萄球菌检测限为2 cfu,且与其它常见实验动物致病菌无交叉反应.反应结果可通过添加荧光染料SYBRF green Ⅰ直接肉眼观察.结论 本研究建立的金黄色葡萄球菌LAMP方法具有快速、灵敏、操作简单、设备要求低的特点,适用于基层、大批量样本、快速检测的要求.     

O1群和O139群霍乱弧菌荧光PCR快速检测方法的建立

目的建立检测O1群和O139群霍乱弧菌的实时荧光聚合酶链反应（荧光PCR）方法,并进行优化和评价。方法根据O1群和O139群霍乱孤菌O抗原编码基因设计探针和引物,建立同时检测霍乱孤菌O1群和O139群的荧光PCR方法,并对体系中的引物、Mg^2＋、dNTP和Taq酶进行优化,然后对建立的方法进行特异性、灵敏性、重复性的评价,并进行224份河口水样本的检测。结果建立了检测O1群和O139群霍乱弧菌的双重荧光PCR方法。对非O1群和O139群霍乱孤菌无扩增反应,敏感度比常规分离培养高。结论以O抗原编码基因为目标检测片段建立了O1群和O139群霍乱孤菌双重荧光PCR检测方法,可用于疑似霍乱弧菌感染的样本常规分离前的快速筛查。     

霍乱弧菌毒力强弱及菌株同源性的快速检测

目的建立一套快速检测霍乱弧菌毒力强弱及不同菌株同源性的实验方法。方法设计4对引物进行多重PCR检测菌株毒力基因特征;采用随机扩增多态性DNA(RAPD)结合SPSS软件分析不同菌株的同源性。结果通过多重PCR同时检测菌株CtxA、TcpA、Ace、Zot4种主要的毒力基因,并快速判定其毒力强弱;RAPD产生的指纹图谱条带清晰、数目较多、片段大小分布均匀,结合SPSS软件分析可判断菌株间的同源性关系。结论多重PCR和RAPD结合SPSS软件分析可在4h内完成对霍乱弧菌毒力强弱及不同菌株间同源性的检测,有助于在疫情处理中判断病菌来源和及时采取适当的处理措施。     

胶体金免疫层析法快速检测霍乱弧菌的初步应用

目的 为检验胶体金免疫层析法(GICA)试纸条检测霍乱弧菌(VC)的灵敏性及其实际应用意义。方法 以VC菌株模拟标本检验GICA的检测灵敏度,并与培养法平行检测流行期间的霍乱标本进行比较。结果 GICA检测纸条检出VC的下限为10^5cfu/ml,比培养法灵敏度低,但已达到检测条原定技术指标;实际应用检出率比培养法稍低,其差异无显性意义。结论 应用GICA试纸条检测VC的方法具有快速、简便、特异和适合基层单位使用的优点。     

LAMP在下呼吸道感染病原菌快速检测中的临床应用

目的 利用环介导等温扩增检测（loop mediated isothermal amplification,LAMP）即呼吸道病原菌核酸联合检测法（13联）分析痰标本病原菌的检出情况,为临床诊疗提供病原学循证依据。方法 选取2022年1月至12月铜仁市人民医院收治的1642例下呼吸道感染患者作为研究对象,采集痰标本/肺泡灌洗液进行LAMP（13联）检测,分析呼吸道病原菌检出情况及其与性别、年龄、季节的关系。结果 13种呼吸道病原菌的总体检出率男性明显高于女性（P<0.01）。在不同年龄组中,3~6岁患者流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的检出率、6~18岁患者肺炎支原体的检出率、>60岁患者耐甲氧西林葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肺炎克雷伯菌的检出率均明显高于其他组（P<0.05）。在不同季节组中,肺炎链球菌和肺炎衣原体好发于春季,肺炎支原体在秋节感染率最高,差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论 LAMP可快速检测出病原菌,为下呼吸道感染的预防及临床诊疗提供病原学依据。     

研究建立快速检测血栓的方法

任何人在长途飞行过程中可在体内形成致命性血栓，该状况可以通过手术、吃药的手段控制。一直以来都没有简单快速的血栓诊断方法，患者往往是在血栓引起中风或心脏病的情况下才被检查出体内有血栓。目前，麻省理工大学的一个研究小组研发出一种通过使用纳米粒子检测尿液中的凝血酶浓度来检测血栓的方法。     

一种gRNA快速合成及检测方法的建立

目的 建立一种gRNA快速合成及检测的方法。方法 设计引物并利用PCR技术迅速扩增gRNA 的DNA模板片段,然后通过体外转录纯化得到gRNA;最后通过体外反应迅速对gRNA和Cas9酶切效率及特异性进行检测。结果 体外合成的gRNA特异性强,活性高,在靶点上成功切开DNA双链。结论 成功建立gRNA快速合成及检测的方法,为后续转染或显微注射筛选有活性gRNA节约了时间。     

TaqMan 探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用

目的： 在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体。方法：选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288 bp。回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒。构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较。结果：支原体PCR产物大小约为288 bp,质粒质量浓度为13.9 mg/L,A260/Ａ280 (Ratio)为1
.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝/ μL。10 μmol/L的引物浓度和10 μmol/L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件。检测灵敏度为4.250×101 拷贝。拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式：Ct= －2.916×log拷贝数+40.02。特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好。准确性检测中变异系数小,表明稳定性好。组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好。样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法。结论：支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好。     

量子点快速检测弓形虫IgG抗体方法的建立及初步应用

目的 建立一种简便、快速的人弓形虫(Toxoplasma,TOXO)IgG抗体检测新方法,并在临床初步应用.方法 应用TOXO抗原包被羧基磁珠作为固相载体,量子点标记羊抗人IgG作为检测抗体,建它TOXO IgG检测方法,同时优化检测条件;对255份临床血清标本进行了检测,并与意大利DiaSorin TOXO IgG ELISA试剂进行比较.结果 检测最佳条件为:抗原包被浓度100 μg/ml,量子点标记二抗工作浓度为1∶200,待测血清稀释度为1∶100.本方法的诊断敏感性、特异性分别为93.3%、96.7%,与进口试剂盒的总符合率为96.5%.结论 基于量子点标记及免疫磁珠技术检测TOXOIgG,操作简便、快速,具有较高的特异性、敏感性和有较好的临床应用价值.     

LAMP快速检测日本血吸虫感染性钉螺的研究

目的：建立一种快速检测日本血吸虫感染性钉螺的方法。方法采用环介导等温扩增技术（LAMP ）以日本血吸虫的特异基因为靶序列,利用Primer Explorer V3软件设计扩增靶基因的4条LAMP引物,酚氯仿法提取感染性钉螺中的日本血吸虫DNA ,取适量模板DNA加入LAMP反应体系进行对日本血吸虫靶基因扩增,经肉眼观察、SYBR Green I染色电泳及测DNA序列来判定扩增产物。在99个阴性钉螺中各加入1个阳性钉螺,其中每个阳性钉螺分别感染日本血吸虫毛蚴数量分别为10、8、6、4、2、1条。结果感染性钉螺检测管经显色呈绿色为阳性,阴性钉螺呈棕色;日本血吸虫的特异基因经LAMP扩增后电泳呈现LAMP特征性梯状条带,阴性钉螺及感染肝吸虫不出现LAMP特征性梯状条带;扩增产物经酶切及序列分析显示为目的基因;在100个钉螺中只要有2条日本血吸虫毛蚴感染便可检出。结论环介导等温扩增技术（LAMP）可快速有效检测日本血吸虫感染性钉螺,有望为疫区日本血吸虫感染性钉螺高效快速检测提供一种新方法。     

快速胶乳凝集试验检测O1群霍乱弧菌

为建立一种快速、简便的Ｏ１群霍乱弧菌检测方法，用Ｏ１群霍乱弧菌多价单克隆抗体致敏胶乳，建立起快速胶乳凝集试验（ＬＡＴ），检测粪便标本６小时培养物中的霍乱弧菌。结果：ＬＡＴ检测的敏感性为５×１０５菌细胞／ｍｌ，检测过程小于５分钟。９６例标本的测定结果与培养法相比较，ＬＡＴ的特异性、敏感诊断符合率分别为９０．４％、１００％、９４．８％。ＬＡＴ简便、快速，可作为一种新的霍乱弧菌快速诊断方法。     

微生物快速检测方法及应用进展

随着人们生活水平不断提高,各种安全问题越来越受到人们的重视,微生物的污染问题也相应地备受关注。在食品和环境等各个方面都有微生物污染的可能,一旦污染,微生物将大量繁殖而导致食源性疾病或环境污染甚至医院内感染。特别是近年来随着环境污染的加剧和生态平衡的不断破坏,导致感染的致病菌的种类越来越多,病原微生物对人类的威胁越来越大。传统的检验方法,     

霍乱弧菌系列胶体金标记免疫层析快速检测试剂条的应用

今年，我们试用了江苏省疾控中心推广使用的霍乱弧菌系列胶体金标记免疫层析快速检测试剂条(下称金标法)，并与国标法进行了分析比较，报告如下。