吡喹酮处理日本血吸虫成虫蛋白质组学分析

目的 利用蛋白质组学的方法鉴定吡喹酮处理前后日本血吸虫成虫蛋白质组,比较处理前后差异表达的蛋白质,探讨吡喹酮抗血吸虫机制。 方法 日本血吸虫合抱成虫分别暴露于吡喹酮（处理组,30 μg/ml）和二甲基亚砜（对照组）中,18 h后收集虫体,提取总蛋白。采用二维-纳喷雾-液相色谱联合串联质谱（2D-nano-LC-MS/MS）鉴定吡喹酮处理组与对照组的蛋白质。数据库查询确定蛋白质的功能,统计分析其中差异表达的蛋白质。 结果 吡喹酮处理后明显上调的血吸虫成虫蛋白为12个,明显下调4个。上调蛋白中有10个功能明确,分别归属于细胞骨架蛋白家族的肌动蛋白、肌球蛋白、副肌球蛋白、微管蛋白、原肌球蛋白和膜联蛋白,应激蛋白家族的热休克蛋白70、热休克蛋白60和硫氧还原蛋白过氧化物酶和信号转导蛋白14-3-3。下调蛋白为参与转录调控的蛋白,即多聚合蛋白和髓磷脂基因表达因子。 结论 吡喹酮处理后日本血吸虫成虫蛋白质组具有差异,提示吡喹酮处理后促进或抑制了特定基因的表达。     

日本血吸虫成虫呕吐物的生化及免疫学特性分析

目的：分析日本血吸虫成虫呕吐物与感染血清的免疫反应性，寻找特异性的血吸虫病诊断抗原。方法：采用SDS-PAGE和免疫印迹分析呕吐物的免疫反应性，过碘酸钠氧化处理以鉴定呕吐物的抗原决定簇的性质。结果：日本血吸虫成虫呕吐物中存在能被血吸虫感染血清识别的特异抗原子1/32、47、60/62kDa蛋白及67kDa蛋白；31/32kDa蛋白和67kDa蛋白的抗原表位为蛋白，而47kDa蛋白和60/62kDa蛋白的抗原表位为糖基。结论：日本血吸虫成虫呕吐物中存在血吸虫感染血清识别的特异抗原，其中31/32kDa蛋白已报告可用于血吸虫病诊断，47kDa蛋白和60/62kDa蛋白含糖基表位并具有潜在的诊断价值。     

水蛭热刺激分泌物与日本血吸虫成虫可溶性物质的免疫交叉反应性分析

目的分析水蛭热刺激分泌物(Wp-hs)与日本血吸虫成虫可溶性物质(Sj-Ds)间的共同组分,探讨两者之间免疫交叉反应的物质基础。方法通过升高温度刺激水蛭虫体产生Wp-hs,同时收集室温放置的水蛭分泌物作为对照,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析Wp-hs与Sj-Ds之间的共同蛋白组分;将这些共同蛋白组分分别与日本血吸虫病患者混合血清、兔抗Wp-hs免疫血清、健康人混合血清进行斑点酶联免疫吸附试验和免疫印迹试验,找出具有免疫交叉反应活性的共同蛋白组分。结果Wp-hs与Sj-Ds之间存在着分子量(12.6~85.4kDa)相近的蛋白条带。Wp-hs抗原在21.6~95.4kDa分子量范围内与日本血吸虫病患者混合血清反应尤为明显,且不与正常人血清反应;Sj-Ds(40.1~89.0kDa)与兔抗Wp-hs免疫血清能较好的结合。结论Wp-hs与Sj-Ds之间至少存在3种具有免疫活性的共同蛋白组分。     

日本血吸虫成虫蛋白质的性别差异性研究

目的　研究日本血吸虫成虫蛋白质表达的性别差异性。方法　利用双向电泳技术对日本血吸虫中国大陆株雌雄虫体蛋白质进行电泳分析。结果　在 43kDa ,pI 5 .6 0～ 5 90处 ,雄虫有一条长度和宽度均超过雌虫并由多个斑点连在一起组成的条带 ,并有 3个较雌虫大的斑点 ;雌虫有 7个特异性斑点 ,且有一处较雄虫深的着色区。结论　血吸虫成虫蛋白质表达有性别差异性。     

日本血吸虫虫卵分泌物小 RNA的高通量测序

目的 通过对日本血吸虫虫卵分泌物（ ｅｇｇ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ,ＥＳＰ） 的小 ＲＮＡ 进行高通量测序,分析、鉴定已知 ｍｉＲＮＡ 的表达水平。 方法 提取日本血吸虫虫卵 ＥＳＰ ｍｉＲＮＡ 进行高通量测序;通过对数据分析包括统计长度分布与比对注释,鉴定已知 ｍｉＲＮＡ 的表达水平。 结果 将构建文库中日本血吸虫虫卵ＥＳＰ 表达的 ｍｉＲＮＡ 与最新 ｍｉＲＢａｓｅ 数据库中的 ｍｉＲＮＡ 比对,发现在鉴定的 １２ 个 ｍｉＲＮＡｓ 中,ｓｊａ － ｍｉＲ －３４８８ 为表达量最高的 ｍｉＲＮＡ,其次为 ｓｊａ － ｍｉＲ － ３６ － ３ｐ 和 ｓｊａ － ｍｉＲ － ７１ａ,上述三种 ｍｉＲＮＡ 表达量占比９１ ８％ 。 结论 日本血吸虫虫卵 ＥＳＰ 三个 ｍｉＲＮＡｓ（ ｓｊａ － ｍｉＲ － ３４８８、ｓｊａ － ｍｉＲ － ３６ － ３ｐ 和 ｓｊａ － ｍｉＲ － ７１ａ）的鉴定为下一步探寻血吸虫病诊疗新靶标奠定了基础。     

血吸虫成虫排泄分泌抗原的组成及免疫反应性分析

目的分析日本血吸虫成虫排泄分泌抗原的组成及其与血吸虫感染兔疗前、疗后配对血清的免疫反应特征。方法采用7cm（pH5～8）的IPG和12%SDS-PAGE对血吸虫成虫排泄分泌抗原的组成进行双向凝胶电泳分析,并用免疫印迹试验检测排泄分泌抗原各蛋白点与疗前、疗后血清的反应性;采用PDQuest8.0图像分析软件对二维图像斑点进行分析,寻找差异反应蛋白点。结果血吸虫成虫排泄分泌抗原双向凝胶电泳图谱主要由215个蛋白斑点组成,其中16个斑点大、染色深,可能为高丰度的循环抗原;免疫印迹显示可被感染6周兔血清识别,但不能被治疗12周兔血清识别的蛋白斑点有84个,与感染6周兔血清的反应强度比与治疗12周兔血清的反应强度高2倍的蛋白点有38个。结论血吸虫成虫排泄分泌抗原中存在高丰度的能被短程抗体识别的抗原分子。     

中国大陆日本血吸虫地理株间成虫蛋白质组分的差异

目的分离、鉴定中国大陆日本血吸虫不同地理株间成虫差异表达蛋白。方法分别收集、制备日本血吸虫不同地理株成虫可溶性蛋白,经固相pH梯度双向凝胶电泳分离,凝胶银染,并用PDQuest8.0凝胶图像分析软件进行比较分析,筛选出差异表达蛋白点并采用基质辅助激光解析离子飞行时间质谱仪进行鉴定。结果湖南株、江西株和江苏株雄虫分别检出698±10、650±19、629±23个蛋白点,雌虫分别检出670±12、682±22、625±28个蛋白点,约90%蛋白点分子量处于20～90kD范围内,蛋白等电点在5～8之间。不同地理株雌虫与雄虫分别两两比较,雄虫发现14个差异点,雌虫发现18个差异点。对其中7个雄虫差异表达蛋白及3个雌虫差异表达蛋白经MALDI-TOF-MS鉴定分析,获得其肽质量指纹图谱、等电点、分子量等相关信息。7个雄虫差异表达蛋白分别为:SJCHGC00821蛋白、SJCHGC00475蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶、谷胱甘肽转移酶片段、谷胱甘肽-S-转移酶、D-核酮糖-5-磷酸-3-表异构酶、G蛋白α亚基AgGq1,3个雌虫表达蛋白分别为:预测蛋白、GAF型传感器信号转导组氨酸激酶、组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶前体。结论中国大陆日本血吸虫不同地理株虫体间蛋白质存在差异,部分蛋白表达差异与虫体对吡喹酮敏感性密切相关。     

日本血吸虫成虫RNA的快速分离纯化

应用异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法提取日本血吸虫ＲＮＡ，在１ｈ左右即可提取纯度高，完整性较好的ＲＮＡ。该方法简单易行，既经济又省时，对来源不易的少量组织尤为有效。通过对血吸虫成虫ＲＮＡ变性琼脂糖凝胶电泳，观察到日本血吸虫大亚基ｒＲＮＡ存在休丙缺口现象，随核糖体小亚基ＲＮＡ一道电泳迁移。     

日本血吸虫成虫核糖核酸提取方法的研究

本文应用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法从日本血吸虫成虫提取核糖核酸(RNA),并与胍盐/热酚法、胍盐/氯化铯超速离心法的提取结果进行比较。3种方法所分离的RNA,在纯度及完整性上均较满意,但其得率以异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法为高,此法简单易行,既经济又省时,对来源不易的少量组织,尤为相宜。     

绦虫排泄分泌物与宿主免疫效应的相关研究进展

绦虫是常见的人兽共感染寄生虫。绦虫排泄分泌物(ESP)是绦虫在感染过程中分泌/排泄并直接暴露于宿主免疫系统的产物,是最可能引起宿主免疫效应变化的原因之一。近年来大量研究显示,该物质可诱导和调控宿主的免疫应答,与绦虫感染密切相关。绦虫ESP可诱导宿主产生正向免疫效应来控制感染,亦可诱导宿主产生负向免疫效应,从而逃避宿主的免疫攻击,建立长期感染。本文对绦虫ESP与宿主免疫效应的相关研究作一简要综述。     

日本血吸虫分泌蛋白和外膜蛋白的原核表达与鉴定

目的 目的 原核表达和鉴定含有编码日本血吸虫分泌蛋白、 外膜蛋白基因的重组质粒, 为高通量筛选日本血吸虫病 疫苗或诊断抗原奠定基础。方法 方法 将前期构建的28个含有分泌蛋白、 外膜蛋白编码基因序列的pET32 （+） 重组质粒通过 化学法转到大肠杆菌 （E. coli） BL21 （DE3） 菌株中进行培养, 加入异丙基?β?D?硫代半乳糖苷 （IPTG） 进行诱导表达。对诱 导表达后的细菌进行超声破壁, 以12% SDS?PAGE分别对菌液、 上清及沉淀进行检测, 判断目的蛋白的大小和表达分布 情况。利用蛋白芯片结合抗His标签荧光抗体对重组融合蛋白表达情况做进一步鉴定。结果 结果 在IPTG终浓度0.1 mmol/L、 37 ℃、 200 r/min和4 h的诱导条件下, 含有编码分泌蛋白、 外膜蛋白序列的重组质粒能够在E. coli BL21 （DE3） 中高效表 达。SDS?PAGE显示28个融合蛋白具有不同程度的表达, 其中2个分布在上清中, 26个分布在沉淀中, 条带大小与预测 大小一致。蛋白芯片成功检测到His抗体荧光信号, 进一步证实了目的蛋白的表达情况。结论 结论 利用E. coli成功表达了 一批编码日本血吸虫分泌蛋白、 外膜蛋白的融合蛋白, 为后续疫苗和免疫诊断研究奠定了基础。     

日本血吸虫三个新跨膜蛋白基因的克隆和分析

目的　克隆并分析日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)新的抗原基因 ,为血吸虫病防治提供有效的疫苗候选分子。方法　以旋毛虫感染鼠血清为探针 ,筛选Sj成虫cDNA文库 ,对获得的阳性克隆进行PCR鉴定及测序。通过互联网对测序获得的核苷酸序列进行同源性分析 ,并预测新基因编码蛋白质的结构与功能。结果　共筛选出 9个阳性克隆 ,其插入SjcDNA片段大小在 0 .6～ 2 .1kb之间。测序分析获 5个新基因 ,其中Sj Ts1,Sj Ts3及Sj Ts5 (登录号为AY0 0 5 816 ,AF2 990 80 ,AY0 2 4 35 2 )分别编码 83,83,2 33个氨基酸组成的跨膜蛋白。Sj Ts1蛋白含 1个潜在的跨膜区 ,2个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点和 1个N 肉豆蔻酸化位点。Sj Ts3蛋白含两个跨膜区 ,1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。Sj Ts5蛋白为具有 5个跨膜区的跨膜蛋白 ,含 1个N 糖基化位点、2个cAMP与cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和 1个N 肉豆蔻酸化位点。结论　Sj Ts1、Sj Ts3与Sj Ts5基因编码的蛋白质均为受磷酸化激活控制的跨膜蛋白 ,可能为潜在的血吸虫病疫苗候选分子     

日本血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白的基因克隆 表达与免疫原性分析

目的克隆并表达日本血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白(SLP),并对其免疫原性进行分析。方法根据华支睾吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白序列,采用tblastn法比对,在基因库中找出与之同源的日本血吸虫EST片段,并经过DNAStar、Sig-nalP3.0分析获得Sj-SLP基因序列,经PCR扩增从日本血吸虫cDNA中获得的目的基因克隆入原核表达载体pET15b,转化至大肠埃希菌BL21,异丙基巯基半乳糖诱导表达并纯化;采用Westernblot分析其抗原性;用纯化的SLP重组蛋白免疫兔,ELISA检测免疫原性。结果 PCR扩增获得Sj-SLP基因,约296bp,并成功地进行了原核表达,纯化的表达产物重组Sj-SLP(rSj-SLP)能被感染兔血清识别,而不能被正常兔血清识别。rSj-SLP免疫兔可产生1∶12800的特异性抗体。结论日本血吸虫存在鞘脂激活蛋白样蛋白,rSj-SLP具有较强的免疫原性和抗原性。     

日本血吸虫与曼氏血吸虫的致病差异

曼氏血吸虫和日本血吸虫是全球范围内两种主要的肠道血吸虫病病原体,所致基本病理均为虫卵引起的肝脏肉芽肿和纤维化,但两者在产卵方式以及肉芽肿的组成细胞等方面均存在明显差异。 目前,我国的血吸虫病研究主要以日本血吸虫病为对象,国外主要以曼氏血吸虫病为对象,而介绍两种血吸虫致病差异的综述较少。 为更好地理解两种血吸虫的致病差异,本文从血吸虫的基因组和进化路径、幼虫迁移、成虫寄生位置及产卵方式、局部组织病理、肉芽肿的形成机制以及肉芽肿的细胞组成等 6 个方面对日本血吸虫和曼氏血吸虫的致病差异进行了综述。     

日本血吸虫SjGrpE蛋白的表达 纯化 及多克隆抗体制备

目的　分析日本血吸虫核苷酸交换因子（SjGrpE）蛋白生物学特性,表达与纯化重组SjGrpE蛋白并测定其免疫原性。方法　采用生物信息学方法预测SjGrpE蛋白的氨基酸组成、分子量、亲/疏水性、跨膜区、信号肽、定位、磷酸化位点、泛素化位点、糖基化位点、二级和三级结构及B细胞表位。以日本血吸虫cDNA为模板,PCR扩增SjGrpE基因,将其双酶切后连接到pET28a载体得到重组质粒pET28a?SjGrpE。将pET28a?SjGrpE转化大肠埃希菌BL21,用IPTG诱导目的蛋白表达,并用镍离子亲和层析法纯化蛋白。将重组SjGrpE蛋白免疫小鼠,分离血清并鉴定获得的抗多克隆抗体。结果　 SjGrpE蛋白分子量约为24.3 kDa,是一种亲水性蛋白,无跨膜区、无信号肽,定位在线粒体;该蛋白含有18个磷酸化位点和2个泛素化位点,无糖基化位点,含有5个B细胞表位。SjGrpE基因全长为660 bp,成功构建重组质粒pET28a?SjGrpE并纯化获得重组SjGrpE蛋白。重组SjGrpE蛋白能够刺激小鼠分泌高滴度抗体。结论　成功制备重组SjGrpE蛋白,该蛋白具有良好免疫原性,为后续研究其作为日本血吸虫病疫苗候选分子的价值奠定了基础。     

日本血吸虫SCP/TAPS基因家族的生物信息学分析和克隆表达

目的以黄蜂Vv Vesv5蛋白为检索源检索日本血吸虫EST数据库,对检索出的序列进行生物信息学分析,并挑选出有代表性的基因进行克隆表达,为日本血吸虫SCP/TAPS家族蛋白的功能研究打下一定的基础。方法利用生物信息学软件对检索出的日本血吸虫SCP/TAPS家族蛋白进行生物信息学分析,经PCR确定后,以AAW24579为代表进行进一步的研究,将其命名为SjVAL2。根据SjVAL2的序列设计引物,通过RT-PCR扩增出全长编码区域,克隆到原核表达载体pET-28a（＋）中,在大肠埃希菌中诱导表达并纯化,免疫印迹实验（Western-blotting）鉴定纯化的重组蛋白。结果日本血吸虫SCP/TAPS家族中至少有17个不同的蛋白成员存在,多序列比对分析发现它们初步可以分为3个不同的亚组。以日本血吸虫成虫cDNA为模板RT-PCR扩增出SjVAL2序列,PCR、双酶切及DNA测序均证实pET-28a（＋）-SjVAL2重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠埃希菌中获得高效表达,重组蛋白能识别日本血吸虫感染的小鼠血清,说明其具有免疫反应性。结论日本血吸虫SCP/TAPS家族中至少有17个不同的蛋白成员存在,其中SjVAL2基因可在原核表达系统中高效表达,为进一步研究该家族蛋白的功能打下基础。     

日本血吸虫分泌蛋白基因Sjsp16的克隆与表达

目的　克隆和表达日本血吸虫新的分泌蛋白Sjsp16的编码基因。　 方法　根据EST测序的结果设计引物 ,从含有Sjsp16基因的cDNA克隆中扩增得到该编码基因 ,亚克隆入原核表达载体 pET2 8中表达 ,然后用生物信息学的方法对蛋白结构功能进行预测。　结果　成功克隆和表达了日本血吸虫分泌蛋白基因Sjsp16,生物信息学分析提示该基因编码蛋白的N端带有一个信号肽序列 ,是一个分泌蛋白 ,含有一个ML功能结构域 ,具有 4种潜在的功能作用位点 ,即 1个N 糖基化位点、3个蛋白激酶C磷酸化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和 3个肉豆蔻酰化位点。　结论　Sjsp16基因编码蛋白为具有脂质识别和结合功能的分泌蛋白 ,可能为潜在的血吸虫病药物靶点或疫苗候选分子。