应用变性高效液相色谱筛查颅内静脉系统血栓形成AT-Ⅲ基因突变及多态性

目的 应用变性高效液相色谱(DHPLC)方法筛查生育期女性颅内静脉系统血栓形成(CVT)AT-Ⅲ基因的突变及多态性.方法 标本来自于2006年6月～2007年12月南方医院生育期女性CVT患者,及52例严格配伍的健康女性外周静脉血.提取所有受试者全血DNA.PCR扩增后应用变性高效液相色谱(DHPLC)技术分析抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)基因的启动子区,第1～6外显子及其侧翼序列的基因变异情况.结果 DHPLC技术分析发现病例组出现6种异常峰形,经测序证实1例致病突变为Exon6 G13328A的杂合突变,1例新发现的同义突变Exon4+243 G>A;SNP位点6个,其中4个SNP库已报道的SNP位点.2个新发现的SNP位点,对照组发现一种异常峰型(三峰).结论 DHPLC是一种自动、快速、高通量的基因突变及SNP位点的筛查方法,AT-Ⅲ基因突变可能是导致生育期非妊娠女性CVT的遗传因素之一,功能性SNP位点也可能参与了该人群VTE的发生.

Abstract：

Objective To identify antithrombin Ⅲ(AT- Ⅲ) gene mutation and polymorphisms in pregnant women and parturients with cerebral venous thrombosis (CVT) using denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC). Methods The genomic DNA was extracted from the blood samples of 50 pregnant women and parturients with CVT and 52 matched healthy women for molecular analysis using a PCR/DHPLC assay followed by DNA sequence analysis. Ten primer pairs were designed for amplifying the AT-Ⅲ promoter region and exons 1-6 including the exon/intron boundaries. A rapid screening assay based on DHPLC was established to screen the mutation and polymorphisms of AT- Ⅲ gene. Results Six abnormal peaks were detected in 40 of the patients by DHPLC. Direct DNA sequencing was performed on representative samples detected by DHPLC profiling. One pathogenic heterozygous G13328A missense mutation in exon 6, and a novel silent mutation in exon 4+243 G>A were identified. Six single nucleotide polymorphism (SNP) sites were found, including 4 previously reported ones in the SNP library and two were novel SNP sites. An abnormal peak was detected in the control group by DHPLC. Conclusion DHPLC allows automated and rapid high-throughput detection of AT-Ⅲ gene mutation and polymorphisms in the clinical setting and prenatal diagnosis. Our findings suggested that AT-Ⅲ gene mutation, as well as its polymorphisms, contributes to the occurrence of CVT in pregnant women and parturients.     

AT-Ⅲ基因突变及多态性与颅内静脉系统血栓形成的相关性

目的探讨AT-Ⅲ基因突变及多态性与女性颅内静脉系统血栓形成(cerebral venous thrombosis,CVST)的相关性。方法采集南方医院生育期女性CVST住院患者50例及严格配伍的健康女性52例外周静脉血。采用ELISA法及发色底物法分别检测AT-Ⅲ抗原水平(AT-Ⅲ:Ag)、AT-Ⅲ血浆活性水平(AT-Ⅲ:A)。提取所有受试者全血DNA,PCR扩增后应用变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)技术分析抗凝血酶-Ⅲ(antithrombin,AT-Ⅲ)基因的启动子区,第1～6外显子及其侧翼序列的基因变异情况。结果病例组与对照组比较,AT-Ⅲ抗原含量水平相当(F=0.754,P=0.472),AT-Ⅲ活性明显降低(P<0.001)。DHPLC筛查发现突变位点1个已报道的致病突变Intron1 5+5 G>A突变,SNP位点5个,其中4个为SNP库已报道的SNP位点,1个为新发现的SNP位点。对照组亦发现4个为SNP库已报道的SNP位点。结论AT-Ⅲ基因突变可能是导致生育期女性CVST的遗传因素之一,功能性SN...     

AT-Ⅲ基因突变及多态性与颅内静脉系统血栓形成相关性研究

目的 探讨AT-Ⅲ基因突变及多态性与女性颅内静脉系统血栓形成(cerebral venous thrombosis, CVST)的相关性。方法 采集南方医院生育期女性CVST住院患者50例及严格配伍的健康女性52例外周静脉血。采用ELISA 法及发色底物法分别检测AT-Ⅲ抗原水平（AT-Ⅲ: Ag）、AT-Ⅲ血浆活性水平（AT-Ⅲ:A）。提取所有受试者全血DNA,PCR扩增后应用变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)技术分析抗凝血酶-Ⅲ( antithrombin,AT-Ⅲ)基因的启动子区,第1～6外显子及其侧翼序列的基因变异情况。结果 病例组与对照组比较,AT-Ⅲ抗原含量水平相当（F=0.754,P=0.472）,AT-Ⅲ活性明显降低（P＜0.001）。DHPLC筛查发现突变位点1个已报道的致病突变Intron1 5'+5 G>A突变,SNP位点5个,其中4个为SNP库已报道的SNP位点,1个为新发现的SNP位点。对照组亦发现4个为SNP库已报道的SNP位点。结论 AT-Ⅲ基因突变可能是导致生育期女性CVST的遗传因素之一,功能性SNP位点也可能参与了该人群CVST的发生。     

利用变性高效液相色谱方法进行HCM家系MYH7基因突变筛查研究

目的:研究利用变性高效液相色谱技术(DHPLC)检测家族性肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)的主要致病基因β-肌球蛋白重链(beta-myosin heavy chain gene,MYH7)突变情况.方法:采用DHPLC结合DNA测序方法对3个新疆地区HCM家系成员的MYH7基因8、14外显子及附近上下游序列进行检测分析.结果:在其中一个家系中发现MYH7基因14外显子中存在Thr441Met突变,该突变在中国人中是首次发现.另外两个家系也发现有不同位点的突变.结论:MYH7基因在HCM家系中具有较高的突变率,不同突变基因型以及基因突变携带个体在临床表型上有所差异.运用变性高效液相色谱技术,能够快速有效地进行基因突变筛查,有利于对HCM家族成员的诊断、患病风险预测及疾病早期预防和治疗.     

变性高效液相色谱分析法在人类基因组单核苷酸多态性检测中的应用

目的:检测白种人和汉族人RDH8基因序列中单核苷酸多态性(SNP)位点,探讨变性高效液相色谱分析法(DHPLC)在基因组研究中的效能.方法:建立8个由白种人和汉族人基因组DNA组成的混合样品池,并进行PCR扩增.其产物以DHPLC检测,发现杂合子信号后,对单独DNA样本进行DHPLC检测及直接测序确定其突变类型.以DHPLC结合DNA样本混合技术在150个汉族人和20个欧洲白种人样本中测定SNP的基因频率.结果:在RDH8基因中共检测到17个SNP,其中12个为新发现的,5个为已报道的;11个SNP在筛查阶段发现,6个在基因频率检测阶段发现;2个仅在白种人样本中检测到,3个SNP的MAF在两种人种间有较明显的差异;汉族人基因频率检测确定了7个常见SNP.结论:DHPLC能有效地用于基因组SNP的检测,结合DNA混合技术,更能提高其检测效力,有效地应用于基因频率的测定.     

颅内静脉系统血栓形成的研究

颅内静脉系统血栓(CVT)是脑血管病的一种特殊类型。分为静脉窦血栓形成和脑静脉血栓形成，按病变性质又可分为非炎性和炎性两类，是由于各种原因导致脑静脉系统形成血栓，引起阻塞，造成脑静脉回流和脑脊液吸收障碍，产生脑组织淤血、水肿及颅内压增高，从而表现一系列相关症状与体征。临床上颅内静脉系统血栓形成较脑动脉血栓形成少见，     

应用变性高效液相色谱技术筛查一个正常血钾性周期性麻痹家系的SCN4A基因突变

目的 应用变性高效液相色谱(DHPLC)技术筛查一发生Met1592Val替换的正常血钾性周期性麻痹(normoKPP)家系的SCN4A基因,证实该突变为疾病相关突变,并总结其在此家系的临床表型特点。方法 总结一normoKPP家系14例患者的临床特点,应用DHPLC技术筛查SCN4A基因全部24个外显子,并对发现异常洗脱峰者进行测序。结果 该家系具有典型的normoKPP临床特征,无肌强直表现及早显、性别偏移现象,病程呈良性过程,发病早晚与症状严重程度及预后无相关。DHPLC筛查发现在外显子1及24存在杂合二倍体,测序及连锁分析证实位于外显子1的突变为良性多态性,外显子24的Met1592Val替换为疾病相关突变。结论 国人存在Met1592Val突变,此突变可导致normoKPP。normoKPP与高钾性周期性麻痹临床表现相似,两者可存在共同突变。     

用变性高效液相色谱法检测遗传性因子XⅢA链基因突变

目的:观察变性高效液相色谱(DHPLC)法检测凝血因子XIIIA链基因突变的实用价值。方法:用聚合酶链反应(PCR)扩增正常样品和有XIIIA基因603-606delAAGA突变患者的XIIIA链基因外显子5;用单链构象多态性(SSCP)及DHPLC检测分析扩增的外显子5。结果:SSCP显示患者有异常的区带,患者的DHPLC结果出现异常洗脱峰,与SSCP的结果一致。结果表明DHPLC能检测FXIII因子A链基因突变。结论:DHPLC技术是一种筛查基因突变的快速、简单、可靠的方法。     

变性高效液相色谱结合混和样品池法检测ACE基因多态性

血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)基因多态性与冠心病、高血压等常见心血管疾病的关系是目前研究的热点所在.变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)能够在使DNA部分变性的温度下,利用空间构向的不同区分不完全匹配的杂合DNA双链.DHPLC被广泛地应用于未知单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的检测工作.     

变性高效液相色谱法筛选XRCC4基因突变

目的应用变性高效液相色谱技术（DHPLC）-异源双链分析对鼻咽癌患者XRCC4基因突变进行筛查与鉴定,研究鼻咽癌患者XRCC4的基因突变情况,探讨DHPLC在筛查相关基因突变、预测放疗敏感性方面的应用。方法采用聚合酶链反应（PCR）和DHPLC筛查88例鼻咽癌患者XRCC4基因的突变。结果对DHPLC图形异常的PCR扩增片断进行DNA测序鉴定突变位点及性质,检测出28例XRCC4基因8号外显子第377位C变成T,导致126号密码子的ser→phe,导致氨基酸残基的替代变化（丝氨酸→苯丙氨酸）。结论用PCR—DHPLC筛查结合测序分析检测XRCC4突变是一种高效、经济、简便、可靠的方法。     

颅内静脉系统血栓形成的早期诊断及治疗

目的 探讨颅内静脉系统血栓形成的早期诊断及治疗方法。方法 分析8例颅内静脉系统血栓形成的病因、症状、体征、头颅CT和MR捡查、脑电图、脑脊液及血液流变学的特点。结果 病因多为产褥期及感染，常表现为颅内高压征及局灶神经功能缺损，头颅CT和MR检查可确诊。结论 对于临床有颅内高压和局灶神经功能缺损表现，尤其是产褥期或有感染者，应警惕颅内静脉系统血栓形成，需行头颅CT和MR捡查确诊，并尽早抗凝治疗。     

颅内静脉系统血栓形成的早期诊断及治疗

目的探讨颅内静脉系统血栓形成的早期诊断及治疗方法。方法分析8例颅内静脉系统血栓形成的病因、症状、体征、头颅CT和MR检查、脑电图、脑脊液及血液流变学的特点。结果病因多为产褥期及感染,常表现为颅内高压征及局灶神经功能缺损,头颅CT和MR检查可确诊。结论对于临床有颅内高压和局灶神经功能缺损表现,尤其是产褥期或有感染者,应警惕颅内静脉系统血栓形成,需行头颅CT和MR检查确诊,并尽早抗凝治疗。     

应用部分变性高效液相色谱技术检测胃癌组织、血清中基因突变的研究

目的:探讨部分变性高效液相色谱(DHPLC)在检测胃癌组织、血浆中基因突变中的应用.方法:应用DHPLC对39例胃癌组织及血清中p53基因突变进行检测,并测序验证.结果:本研究中p53基因的突变率为21%(8/39);其中肠型胃癌突变率40%(6/15)明显高于弥漫型胃癌8.33%(2/24)(P＜0.01);发现既往未见报道突变3例.血清标本中50%(4/8)可扩增出目的片段,但均未检出突变.结论:DHPLC是一项较好的检测胃癌组织中基因突变的筛查方法,在血清中的应用仍需探讨.     

颅内静脉系统血栓形成10例临床分析

颅内静脉窦血栓形成(Cerebral venous sinusthrombsis,CVT)是一种特殊类型的缺血性脑血管疾病.该病致病因素较多,临床表现多样,以往死亡率较高[1,2],误诊率较高,文献报导达50%[3].随着临床CT、MRI,MRV的广泛应用,脑静脉窦血栓形成的诊断率明显提高.现将我近2年收治的颅内静脉系统血栓形成10例报告如下.     

应用变性高效液相色谱对EPHX1基因进行分型

目的 基于变性高效液相色谱技术,建立一种快速检测环氧化物水解酶(EPHX1)基因多态位点rs4653436(G＞A)的基因分型方法.方法 标准酚-氯仿法提取275例健康人外周血基因组DNA,应用聚合酶链反应/变性高效液相色谱(PCR/DHPLC)方法检测rs4653436(G＞A)位点基因型.结果 275例无关个体中,基因型GG、GA和AA分别有176例、93例和6例,各占64.0%、33.8%和2.2%,G和A等位基因的频率分别为80.9%和19.1%.结论 变性高效液相色谱技术检测EPHX1 rs4653436基因型简便、准确,为研究rs4653436多态性与华法林用量个体差异的相关性打下基础.     

还原变性核糖核酸酶的高效液相色谱复性

目的:研究还原变性的核糖核酸酶(RNase)在高效疏水作用色谱(HPHIC)及高效离子交换色谱(HPIEC)上的复性及影响因素.方法:在二硫苏糖醇(DTT)存在的条件下用盐酸胍(GuHCl)和尿素(Urea)将RNase变性还原,先在溶液中加入氧化型谷胱苷肽(GSSG)进行氧化,然后在流动相中有低浓度变性剂存在的条件下,用HPHIC,HPIEC及稀释法对其进行复性并测定其生物活性及回收率.结果:HPHIC和HPIEC对RNase的复性效率均高于稀释法,两者的色谱固定相对RNase的复性均有所贡献.在色谱流动相中加入低浓度的变性剂可以提高复性效率,改变GSSG的浓度对复性效率也有影响.结论:用HPHIC,HPIEC对RNase进行复性,不仅复性效率高,而且快速、简便,具有很好的应用前景.     

变性高效液相色谱检测IRS-2基因3''''-非翻译区单核苷酸多态性

目的探讨变性高效液相色谱(DHPLC)在胰岛素受体底物-2(IRS-2)基因3′-非翻译区单核苷酸多态性(SNP)检测中的应用.方法采用聚合酶链式反应(PCR),DHPLC,单链构象多态性(SSCP)和DNA序列分析对30例正常对照和30例2型糖尿病患者IRS-2基因3′-非翻译区进行SNP和突变检测.结果PCR - DHPLC检测出4例PCR-SSCP分析未能发现的2型糖尿病患者IRS-2基因3′-非翻译区的SNP,并得到测序验证.结论DHPLC是一种快速、自动化程度高、操作简单、检测片段长、准确率高的SNP检测技术.它为进一步研究IRS-2基因3′-非翻译区的变异与2型糖尿病的关系奠定了基础.     

变性高效液相色谱法筛选鼻咽癌相关基因单核苷酸多态性

目的　利用变性高效液相色谱法（DHPLC）结合测序筛选和鉴定鼻咽癌基因的单核苷酸多态性（SNPs）。方法　PCR扩增30例鼻咽癌患者和28例正常对照者6p21.3区域基因PPP1R11、PP1R10、FLOT1、KIAA0170的4个外显子与1个内含子片断,采用DHPLC技术对扩增片断进行基因变异检测,将不同的类型PCR片断进行全序列测定并与参考序列对照分析。结果　在5个片断中初步鉴定出4个未见报道的新SNP位点,验证了4个已知的SNPs位点和基因型。结论　DHPLC预测结合全序列测序是一种高效、经济、简便、可靠的SNP筛选方法。