胚胎体外共培养研究的进展

共培养是模拟早期胚胎在体内发育环境，延长体外发育时间，提高囊胚获得率的方法。因其可提高体外受精—胚胎移植(IVF—ET)的成功率，特别是提高反复种植失败(IF)者的妊娠率。尽管有不少争议，近年仍有较多与共培养有关的研究。对共培养系统的改进、应用、作用机制的探讨作介绍。     

人分泌早期子宫内膜共培养体系对早期鼠胚凋亡的影响

目的研究人分泌早期子宫内膜共培养体系对早期鼠胚凋亡的影响。方法将2一细胞期鼠胚与子宫内膜(A冻融、B传代)共培养以及单一培养液培养(C组)。72h后对桑椹期鼠胚用TUNNEL法进行凋亡检测。结果共培养组鼠胚的凋亡率明显低于单一培养组，且不受内膜细胞传代及冻融的影响；共培养组优质胚胎数均高于对照组，而共培养组之间无明显差异。结论共培养人分泌早期子宫内膜能减少早期鼠胚的凋亡，提高胚胎体外发育的质量，延长体外培养时间。     

人无血清输卵管上皮细胞模型与小鼠胚胎共培养的研究

目的了解２细胞期小鼠胚胎与人输卵管上皮细胞体外无血清共培养中的发育状况。方法配制无血清培养液,予小鼠超排卵并取２细胞期胚胎,将９０个２细胞期小鼠胚胎与人输卵管上皮细胞在无血清培养液中进行体外共培养,另以９０个同期胚胎在无辅助细胞的培养液中培养作对照,每日在显微镜下观察小鼠胚胎发育情况。结果共培养的胚胎有８２％发育到桑椹胚,７７％形成囊胚,６３％胚胎孵化。对照者仅４５％发育到桑椹胚,１３％到初级囊胚,无孵化胚胎。共培养胚胎发育速度快,碎片率明显低于对照者。结论人输卵管上皮细胞与小鼠胚胎共培养可以促进胚胎体外发育,并提高胚胎发育质量。     

人子宫内膜细胞共培养体系对早期鼠胚体外发育的影响

目的:研究人子宫内膜共培养体系对早期鼠胚体外发育的影响及移植后的妊娠情况。方法:将2-细胞小鼠胚胎与人子宫内膜细胞进行体外共培养,对照组为无营养细胞的单纯培养液,每日在显微镜下观察胚胎的发育情况。将培养到囊胚期的胚胎移植回小鼠的子宫腔,观察着床情况。结果:共培养体系中68.3％的2-细胞胚胎发育至桑椹胚期,50.8％发育至囊胚期,囊胚的孵化率为36.7％,胚胎的着床率为25.0％。而对照组只有24.8％的2-细胞胚胎发育至桑椹胚期,11.4％到达囊胚期,且其中大部分为早期囊胚即停止发育。另外对照组细胞碎片出现早且多,卵裂球不均匀,胚形态差,移植后胚胎的着床率仅为3.1％。结论:人子宫内膜细胞共培养体系可以促进小鼠胚胎的体外发育,改善胚胎的质量,提高着床率。     

hCG共培养自体PBMCs宫腔灌注治疗反复种植失败及相关机制的研究

目的:探讨人绒毛膜促性腺激素(hCG)共培养自体外周血单个核细胞(PBMCs)宫腔灌注对反复种植失败(RIF)患者妊娠结局的影响及宫腔内相关细胞因子的改变。方法:选择在我院生殖中心行冻融胚胎移植(FET)的RIF患者65例,接受移植前自体PBMCs宫腔灌注治疗及取宫腔液的患者28例为实验组,于排卵前抽取自体外周血分离PBMCs,与hCG混合共培养于移植前3天行宫腔灌注;另外37例为对照组,两组患者行常规FET,随访妊娠结局;Bio-plex悬液芯片分析系统检测灌注前、后宫腔液相关细胞因子。结果:两组患者年龄、不孕年限、体质量指数(BMI)、基础性激素水平(FSH、LH、E_2)、既往移植周期数、平均内膜厚度和移植胚胎数比较,差异均无统计学意义(P0.05)。实验组与对照组比较临床妊娠率(42.86%vs 16.22%)和胚胎种植率(25.86%vs 9.21%),实验组均高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。宫腔灌注后宫腔液中Eotaxin表达水平升高,而INF-γ表达降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论:宫腔灌注hCG共培养PBMCs是一项针对RIF患者安全有效的治疗方法,可以提高此类患者FET周期的临床妊娠率,改善RIF患者宫腔局部细胞因子的表达,促进胚胎种植。     

短时受精改变受精卵透明带结构?——一项前瞻性随机自身对照研究

目的:探讨不同精、卵共培养时间(6h、18h)对受精卵透明带(zona pellucida,ZP)和胚胎质量的影响。方法:21个周期258枚卵子随机分成6h(A组)和18h(B组)精、卵共培养作为自身对照,受精后20h偏振光显微镜摄像,分析A、B组间正常受精卵ZP厚度(ZP thichness,ZPT)、ZP密度(ZP density,ZPD)和胚胎质量的差异。结果:A组中正常受精卵ZP内层、全层厚度和内层密度分别为8.3±1.3μm,19.0±2.6μm和2.09±0.50nm,显著低于B组(8.9±1.5μm,19.6±2.7μm,2.2±0.7nm)(P<0.05);A组发育为可移植胚胎的受精卵ZPD(2.07±0.49nm)显著低于B组(2.26±0.72nm),而发育为不可移植胚胎的受精卵外层ZPTA组(9.1±2.5μm)高于B组(7.7±1.4μm),P<0.05;受精率、可移植胚胎率及优质胚胎率A组与B组间无统计学差异,但A组移植胚胎所占比率高(76.67%vs23.33%,P<0.05)。结论:短时受精使透明带变薄,这可能有利于胚胎的发育。     

巨噬细胞对卵巢癌细胞SKOV3生物学功能的影响

目的:研究巨噬细胞对卵巢癌细胞株SKOV3生物学功能的影响。方法:(1)体外采用IL-4和佛波醇酯(PMA)分别诱导M2和M1型巨噬细胞,流式细胞仪鉴定分型;(2)Tranwell小室建立巨噬细胞与卵巢癌细胞SKOV3体外非接触式共培养模型。比较共培养后,SKOV3的增殖和凋亡、迁移和侵袭的变化。MTT法检测增殖;流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染检测凋亡;Transwell检测侵袭和迁移。结果:(1)IL-4诱导的巨噬细胞高表达CD163,为M2型,PMA诱导组高表达HLA-DR,为M1型。SKOV3和普通巨噬细胞共培养后,巨噬细胞CD163高表达。(2)SKOV3的增殖和凋亡:M2共培养组SK-OV3的增殖活性显著高于M1共培养组和普通共培养组(P<0.05)。M2共培养组SKOV3的凋亡率显著低于M1共培养组和普通共培养组(P<0.05)。(3)SKOV3的迁移和侵袭:M2共培养组SKOV3的侵袭能力显著强于M1共培养组和普通共培养组(P<0.01)。M2共培养组SKOV3的迁移能力显著强于M1共培养组和普通共培养组(P<0.05)。结论:共培养卵巢癌细胞使巨噬细胞M2表型极化。M2型巨噬细胞促进卵巢癌细胞增殖,提高侵袭、迁移能力,减少凋亡,而M1型起相反作用。     

子宫内膜异位症患者腹腔液中正常T淋巴细胞表达和分泌调节活化因子水平的变化及意义

目的 探讨子宫内膜异位症(内异症)患者腹腔液中正常T淋巴细胞表达和分泌调节活化因子(RANTES)分泌水平的变化及其对单核巨噬细胞趋化的影响.方法 建立内异症异位病灶主要细胞--子宫内膜基质细胞(ESC)、腹膜间皮细胞(HPMC)及单核巨噬细胞系U937不同组合的直接接触(E-H-U、E-H、E-U、H-U)及间接接触共培养体系(U/E-H、H/E-U、E/H-U),然后收集共培养上清液,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测RANTES分泌水平的变化.利用趋化实验观察ESC、HPMC及ESC-HPMC共培养对单核巨噬细胞的趋化作用.结果 ESC、HPMC、U937单独培养时,RANTES的分泌水平分别为(5.0±0.5)、(4.0±0.3)、(254±40)ng/L;与单独培养比较,共培养明显促进RANTES的分泌,其中E-H-U培养为(2250±96) ng/L,E-U培养为(243±192) ng/L,H-U培养为(1251±73) ng/L,E-H培养为(50±40) ng/L,3种细胞直接共培养较两种细胞直接共培养时,RANTES分泌水平明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01);间接共培养时,RANTES的分泌水平分别为(1519±96) ng/L(E/H-U培养)、(912±93) ng/L(U/E-H培养)、(1201±93)ng/L(H/E-U培养).ESC、HPMC及ESC-HPMC共培养可促进单核巨噬细胞的趋化,迁移细胞数分别为(6.0±0.3)、(6.2±0.3)、(10.0±0.3)×103个.结论 内异症病灶主要细胞间存在着复杂的相互作用机制,并可促进趋化因子RANTES的分泌,从而促进腹腔内单核巨噬细胞的趋化和募集.     

丁酸钠对大鼠小肠上皮细胞株-6细胞增殖和凋亡的影响

目的　观察丁酸钠对大鼠小肠上皮细胞株-6(intestinal epithelium cell line No.6,IEC-6)细胞增殖和凋亡的作用. 方法　不同浓度丁酸钠(低浓度2 mmol/L,中浓度8 mmol/L,高浓度14、20 mmol/L)处理IEC-6细胞,细胞计数试剂盒CCK-8法检测细胞增殖情况,分光光度法检测细胞内Caspase-3活性程度,流式细胞术检测细胞凋亡率. 结果 (1)加入丁酸钠(2、8、14、20mmol/L)共培养24 h后,2、8 mmol/L丁酸钠组细胞增殖速度比对照组快,差异有统计学意义(P<0.01);48 h后,14、20 mmol/L丁酸钠组细胞增殖较对照组明显受抑制,差异有统计学意义(P<0.01);72 h后,8、14、20 mmol/L丁酸钠组增殖亦明显受抑制,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).(2)加入丁酸钠(2、8、14 mmol/L)共培养12 h后,8、14 mmol/L丁酸钠组与对照组比较Caspase-3活性明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);24 h后,2、8、14 mmol/L丁酸钠组与对照组比较Caspase-3活性均升高,差异有统计学意义(P<0.05);48 h后,8、14 mmol/L丁酸钠组与对照组比较Caspase-3活性亦升高,差异有统计学意义(P<0.05).(3)加入丁酸钠(2、8、14 mmol/L)共培养12、24、48 h后,8、14 mmol/L丁酸钠组与对照组比较IEC-6细胞凋亡率均有升高,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 中、高浓度丁酸钠有诱导IEC-6细胞凋亡,抑制IEC-6细胞增殖作用,而低浓度丁酸钠没有这种作用.     

一种胚胎体外培养的新方法:滴中孔培养法

目的:建立并优化一种胚胎体外培养的新方法——滴中孔培养法。方法:用圆头玻璃管在培养皿上烫出多个圆孔,作为滴中孔培养的专用平皿;收集牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)并在滴中孔培养专用平皿中进行体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)和体外培养(IVC)。结果:①滴中孔培养法与群卵共培养的效果相似,而单卵培养明显降低了卵母细胞的发育能力(P<0.05)。②培养滴体积和培养密度对卵母细胞核成熟没有明显的影响,但显著影响胚胎的发育能力。在培养密度不变的情况下,培养滴体积太小显著削弱了胚胎的发育能力,而培养密度过小或者过大也削弱胚胎的发育能力(P<0.05)。结论:滴中孔培养法可以达到群卵共培养的效果。     

孕妇的饮酒和吸烟

吸烟对妊娠的影响虽有各种报告,但多数尚无明确的结论.目前比较一致的意见是:(1)低体重儿的发生率增高;(2)胎儿发育迟延;(3)流产率增高;(4)女婴出生率增高.有争议的是(1)母体重增加不良;(2)胚胎期缩短;(3)     

小鼠体外培养囊胚辅助孵化的初步研究

目的 :探索体外培养和辅助孵化技术对体外发育小鼠囊胚孵出率的影响。方法 :将昆明白种小鼠的 2～ 4-细胞胚于体外培养到囊胚 ,观察比较 :(1 )体外培养囊胚与体内发育囊胚的自然孵化率 ;(2 )体外培养囊胚经辅助孵化后与未行辅助孵化 (对照组 )的体外孵化率。结果 :(1 )体外培养囊胚与体内发育囊胚的自然孵化率分别为 75.4%和 96 .2 % ;有显著差异 (P<0 .0 0 1 )。 (2 )辅助孵化与对照组的体外孵化率分别为 97.7%和 74.0 % ,有明显差异 (P<0 .0 5)。结论 :体外培养对囊胚的孵化有不利影响 ;辅助孵化则能明显提高体外培养囊胚的孵出效率     

子痫前期患者血清对滋养-平滑肌细胞共培养体系平滑肌细胞凋亡的影响

目的:探讨子痫前期血清对滋养-平滑肌细胞共培养体系滋养细胞侵袭力改变及对平滑肌细胞凋亡的影响.方法:采用组织块贴壁法培养人孕早期细胞滋养细胞(CTB)和人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC),传代后建立滋养细胞与HUASMC共培养模型并分别加入正常和子痫前期患者静脉血清培养24小时并设立相对应的单培养组;用不同的方法检测细胞滋养细胞的侵袭能力、HUASMC活力、HUASMC凋亡率、滋养细胞基质金属蛋白酶MMP-2mRNA、MMP-9mRNA、人脐静脉内皮细胞自杀相关因子(Fas)及HUASMC的Fas配体(Fasl)mRNA的表达;HUASMC的Fas蛋白的表达.结果:子痫前期患者血清能显著抑制共培养体系中的细胞滋养细胞的侵袭能力,上调HUASMC活力,降低HUASMC早期凋亡率,降低细胞滋养细胞MMP-2mRNA、MMP-9mRNA、FasmRNA及HUASMC的Fasl mRNA和Fas蛋白水平的表达.结论:子痫前期血清可能通过降调细胞滋养细胞MMP-2、MMP-9表达而影响滋养-平滑肌细胞共培养体系滋养细胞的侵袭能力,子痫前期血清培养滋养-平滑肌细胞共培养体的Fas/Fasl的表达异常可能与HUASMC凋亡下降有关.提示滋养细胞MMP-2、MMP-9、Fas/Fasl 系统的表达异常可能参与了子痫前期子宫螺旋动脉重铸障碍的病理过程.     

子痫前期血清对滋养-内皮细胞共培养体系滋养细胞侵袭力和内皮细胞凋亡的影响

目的:探讨子痫前期血清对滋养-内皮细胞共培养体系滋养细胞侵袭力改变及对内皮细胞凋亡的影响.方法:选择正常足月妊娠剖宫产孕妇10例(正常对照组),子痫前期患者20例(子痫前期组).采用组织块贴壁法培养人孕早期细胞滋养细胞(CTB),胰酶消化法培养正常妊娠人脐静脉内皮细胞(HUVEC),传代后建立滋养细胞与脐静脉内皮细胞共培养模型,并分别加入正常对照组和子痫前期组患者静脉血清培养24小时;Transwell小室检测细胞滋养细胞的侵袭能力;流式细胞学检测人脐静脉内皮细胞凋亡率;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞滋养细胞MMP-2、MMP-9mRNA及人脐静脉内皮细胞自杀相关因子(Fas)mRNA的表达.结果:子痫前期患者血清共培养体系的细胞滋养细胞的侵袭能力低于正常对照组(P<0.01);人脐静脉内皮细胞凋亡率明显低于正常对照组(P<0.05);MMP-2、MMP-9和FasmRNA的表达明显下降(P<0.05).结论:子痫前期血清可能通过降调细胞滋养细胞MMP-2、MMP-9表达而影响滋养-内皮细胞共培养体系滋养细胞的侵袭能力,并且其滋养-内皮细胞共培养体的内皮细胞Fas的表达异常可能与内皮细胞凋亡下降有关.提示滋养细胞MMP-2、MMP-9、Fas/Fasl的表达异常可能参与了子痫前期子宫螺旋动脉重铸障碍的病理过程.     

隐匿性高催乳素血症与不孕症

隐匿性高催乳素血症(OHP)是高催乳素血症的特殊类型.正常情况下,催乳素(PRL)受下丘脑释放的催乳素释放因子(PRF)和催乳素抑制因子(PIF)调控.OHP与不孕症密切相关.不孕症妇女中可通过促黄体生成激素释放激素(LHRH)、促甲状腺素释放激素(TRH)试验来诊断OHP.溴隐亭是治疗OHP的主要药物,能提高妊娠率,且对胎儿发育、胎盘均无影响.     

冻融技术的安全性回顾分析——复苏胚胎与新鲜胚胎的对比研究

目的:探讨冷冻对胚胎的安全性.方法:回顾性分析2004年1月1日至2006年5月31日在同济医院生殖医学中心行体外受精后,新鲜周期胚胎移植(2160周期)和复苏周期胚胎移植(735周期)的妊娠及妊娠结局,胎儿、新生儿情况及预后.结果:新鲜周期胚胎移植的种植率、临床妊娠率明显高于复苏周期,周辫取消率明显低于复苏周期,早期及晚期流产率、活产率、异位妊娠率无明显差异.新鲜周期与复苏周期比较新生儿出生体重、孕周、发育缺陷率、疾病率、胎儿畸形率、死胎率、新生儿期及婴儿期死亡率差异均无显著性.结论:胚胎冷冻技术对部分细胞可能有损伤,但并不增加新生儿发育缺陷率及死亡率.     

输卵管上皮细胞共培养技术对受精卵体外发育的影响及临床应用价值

目前 IVF-ET的成功率仍较低 ,主要是由于胚胎过早移植入宫腔所致。输卵管上皮细胞共培养体系可以延长胚胎的体外培养时间 ,提高发育至囊胚期的胚胎数 ,从而提高IVF-ET成功率 ,减少多胎妊娠。     

盐酸克仑特罗对小鼠胚胎体外发育的影响

目的:探讨盐酸克仑特罗对小鼠1-细胞胚胎和2-细胞胚胎体外发育的影响。方法:获取小鼠1-细胞和2-细胞胚胎,分别与盐酸克仑特罗10 ng/mL,3 ng/mL和1 ng/mL的3个剂量组共培养,观察胚胎各阶段的发育情况并计算胚胎的发育率。结果:1ng/mL和3ng/mL组的1-细胞小鼠胚胎,从4-细胞期到囊胚阶段的发育率与对照组相比差异显著(P<0.05),3 ng/mL组显现出比1ng/mL组更强的抑制作用(P<0.01),10 ng/mL组,2-细胞期就与对照组有差异(P<0.05,其中 4-细胞至囊胚阶段P<0.01),囊胚率只有2.4％。10 g/mL组及3 ng/mL组的2-细胞小鼠胚胎,分别从4-细胞期和8-细胞期与对照组相比差异显著(P<0.05),1 ng/mL组的各个阶段胚胎发育率与对照组相比未见统计学差异(P>0.05)。培养液中含有盐酸克仑特罗使胚胎的粗颗粒增多,部分印裂球碎裂、退化。结论:盐酸克仑特罗对小鼠胚胎的体外发育有毒性作用并呈一定的剂量效应。盐酸克仑特罗使1-细胞小鼠胚胎被抑制在2-细胞期,对处于晚2-细胞期胚胎的影响明显降低。     

原核分级对胚胎质量及妊娠结局的影响

目的 探讨原核分级对胚胎质量及妊娠结局的影响.方法 回顾性分析2006年3月至7月在沈阳东方医疗集团菁华医院治疗的95例患者,95个治疗周期:59例体外受精(IVF)周期,34例卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)周期,2例IVF+ICSI周期.在IVF或ICSI后17～19h观察受精情况,将正常受精的合子分为两组:正常发育的O型(OA/OB)合子和非正常发育的P型(P1,P2,P3,P4,P5)合子.每个合子均单独培养,追踪胚胎质量,取卵后3d进行胚胎移植.结果 95例患者平均妊娠率为34.74%(33/95),平均种植率为18.46%(43/233).O型合子的卵裂率、优质胚胎率分别为(98.70±6.92)%、(45.35±39.49)%;P型合子的卵裂率、优质胚胎率分别为(98.74±6.00)%、(47.52±32.30)%,两组间卵裂率和优质胚胎率均无统计学意义(P＞0.05).移植3组(O型合子、P型合子、0+P型合子)的妊娠率分别为27.27%、30.77%、37.93%;种植率分别为16.00%、14.75%、20.41%,3组间妊娠率和种植率均无统计学意义(P＞0.05).结论 在设定的合子分级中,认为正常发育的O型合子和非正常发育的P型合子,他们在胚胎质量、临床妊娠率和种植率等方面无明显差异.     

二甲双胍辅助克罗米芬用于多囊卵巢综合征促卵泡发育的效果观察

目的:探讨二甲双胍辅助克罗米芬对多囊卵巢综合征(PCOS)患者促卵泡发育的效果。方法:选择PCOS患者150例,随机分为A、B、C3组,A组(50例)口服克罗米芬;B组(50例)口服二甲双胍;C组(50例)口服克罗米芬和二甲双胍。3组用药时间均为12周,比较用药前后空腹血胰岛素和血睾酮及卵泡发育率的变化。结果:B组和C组患者治疗后血胰岛素及睾酮均下降,治疗前后比较,差异有显著性(P <0.05),C组治疗后卵泡发育率为89%,明显高于A组的59%和B组的34%,差异也有显著性(P <0.05)。结论:二甲双胍能有效降低PCOS患者的胰岛素抵抗,与克罗米芬合用能提高卵泡发育率。