miR-195重组腺病毒表达载体构建及在细胞中的表达

目的:利用AdEasy系统构建miR-195的腺病毒表达载体,为研究miR-195的功能提供条件.方法:将miRNA-195前体序列从已构建的pcDNA-miR-195载体中克隆进穿梭载体pAdTrack-CMV,通过与骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中高效同源重组,获得完整的重组腺病毒质粒.利用HEK293细胞包装并扩增重组腺病毒Ad-195.Ad-195感染肺癌细胞A549后,利用miRNA的定量RT-PCR技术检测Ad-195在细胞中表达miR-195情况.随后荧光素酶报告基因实验证明,Ad-195表达的miR-195能够作用于BCL2基因上预测的miR-195靶位点.结果:实时定量PCR检测显示,Ad-195感染肺癌细胞A549后,miR-195表达水平有显著的上调.结论:miR-195的腺病毒表达载体构建成功,能够用于在细胞内过表达具有生物学功能的miR-195.     

脑红蛋白重组腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的：为进一步研究脑红蛋白（NGB）的生理功能并为基因治疗缺血性脑损伤提供有效的表达载体，应用细菌内同源重组方法分别构建含NGB及绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒表达载体，并对其进行鉴定。方法：用电转方法将腺病毒基因组质粒pAdEasy-1导入BJ5183细菌，制备BJ5183-pAdEasy-l细菌，再以后者作为电感受态细菌，与线性化质粒pShuttle-CMV-NGB进行同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-NGB，转染293细胞。制备含脑红蛋白基因的重组腺病毒。结果：通过PCR、序列测定和Western印迹杂交鉴定，确认该重组腺病毒表达载体可正确表达脑红蛋白。结论：成功地构建了表达NGB基因的重组腺病毒载体，为深入开展脑红蛋白的功能研究以及用于缺血性脑损伤疾病的基因治疗奠定了基础。     

携带人鞘氨醇激酶及突变体基因重组腺病毒载体的制备及表达

目的制备携带人野生型鞘氨醇激酶基因(SPK^wt)及其突变体(SPK^DN)的腺病毒载体,为研究SPK的生物学功能提供高效基因转移载体。方法将野生型和突变体SPK基因亚克隆至穿梭载体pshuttle-cmv,重组的穿梭质粒经Pme线性化后,电转化E.coli BJ-AD-1感受态,获得带有目的基因的腺病毒重组子质粒;重组子经Pac I线性化后,以脂质体介导转染293包装细胞,获得重组腺病毒载体;分别行PCR鉴定重组腺病毒是否携带目的基因,Western blot鉴定目的基因是否表达,酶活性检测判断野生型基因和突变体基因表达活性。结果重组腺病毒带有目的基因,可以感染内皮细胞并正确表达,酶活性分析表明野生型SPK基因增强SPK活性,突变体SPK基因抑制SPK活性。结论成功构建了携带SPK野生型及其突受体的重组腺病毒,为研究SPK的功能提供了物质基础。     

RGD修饰携带tumstatin及eGFP新型腺病毒载体的构建及其表达研究

目的 构建RGD修饰表达绿色荧光蛋白(eGFP)和肿瘤抑素(tumstatin)的新型腺病毒载体.方法 PCR扩增tumstatin基因,经克隆后构建pAd5-CMV/tumstatin穿梭载体.重叠PCR方法将RGD序列插入到Ad5纤维蛋白的HI环中,获得pMfiber-RGD穿梭载体.穿梭载体与腺病毒骨架载体线性化后共转化E.coli BJ5183,构建pAd-RGD-eGFP骨架载体.最后,使用磷酸钙法将pAd5-CMV/tumstatin穿梭载体和pAd-RGD-eGFP骨架载体共转化HEK293细胞.7～10d后收集细胞裂解物得到Ad-RGD-tumstatin/eGFP病毒.将经过修饰的Ad-RGD-tumstatin/eGFP和未修饰的Ad-WT-tumstatin/eGFP病毒分别感染脑胶质瘤U87MG细胞(病毒剂量分别为1、10、100Vp/细胞),通过观察其荧光强度评估其感染效率.以上两种病毒分别感染HeLa细胞,并分别采用RTPCR及Western blotting检测tumstatin细胞mRNA及培养上清中蛋白的表达水平.结果 病毒感染48h后,可观察到修饰后的腺病毒Ad-RGD-tumstatin/eGFP对U87MG细胞的感染效率明显高于未修饰的腺病毒Ad-WT-tumstatin/eGFP.RT-PCR及Westem blotting可检测剑感染Ad-RGD-tumstatin/eGFP后的HeLa细胞中tumstatin的转录和表达.结论 成功构建经RGD修饰并表达tumstatin和eOFP基因的新型腺病毒载体,为进一步研究tumstatin在低表达柯萨奇一腺病毒受体的肿瘤中的作用奠定了良好基础.     

重组腺病毒介导的血管内皮生长因子165在大鼠骨髓基质细胞中的表达

目的 利用AdEasy腺病毒载体系统构建携带血管内皮生长因子165(VEGF165)的重组腺病毒(Ad-VEGF165),并观察Ad-VEGF165转染大鼠骨髓基质细胞(bMSCs)后VEGF165的表达情况. 方法 将PCR获取的VEGF165目的 基因插入到pAATrackCMV中,构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-VEGF165,经Pme I酶切线性化后,采用电穿孔法转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞中,挑选同源重组菌落.提取质粒并用Pac I酶切鉴定.线性化重组质粒pAdEasy-VEGF165转染293T细胞,包装成重组腺病毒颗粒.并扩增收集重组腺病毒,测定病毒滴度.体外培养大鼠骨髓基质细胞,Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞,转染后在荧光显微镜下观察.转染的骨髓基质细胞采用RT-PCR和ELISA法检测VFGF165的表达水平. 结果 经酶切鉴定,基因测序及绿色荧光观察证实成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒,并扩增出109pfu/ml的高滴度重组腺病毒.Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞后,RT PCR证明转染的骨髓基质细胞内有VEGF165mRNA表达.ELISA检测发现转染组上清液中VEGF165蛋白分泌量明显高于对照组(P＜0.01). 结论 pAdEasy-VEGF165转染对骨髓基质细胞的增殖能力无明显影响,而且骨髓基质细胞能够表达并分泌VFGF165为研究骨组织工程血管化局部基因治疗奠定了基础.     

NF-κBp65特异性siRNA重组腺病毒载体的构建

目的:构建核因子-κB(NF-κB)p65特异性小干涉核糖核酸(small interference RNA,siRNA)重组腺病毒载体。方法:设计特异性NF-κBp65siRNA的靶序列对应的双链DNA,插入腺病毒穿梭质粒,然后跟腺病毒骨架质粒共转染HEK-293A细胞,穿梭质粒和骨架质粒在细胞内整合包装重组腺病毒并用β-Gal染色鉴定。重组腺病毒扩增、纯化、滴度测定后,感染培养的大鼠关节软骨细胞,应用RT-PCR在mRNA水平观察NF-κBp65的表达。结果:β-Gal染色显示重组腺病毒载体构建成功,RT-PCR结果显示重组腺病毒有效抑制了目的基因NF-κBp65的表达。结论:特异性NF-κBp65 siRNA的重组腺病载体可以抑制目的基因的表达,可以用于体内抑制骨关节炎的实验研究。     

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

本研究通过反转录ＰＣＲ得到人ＧＭ-ＣＳＦ基因片段后，通过重组插入ｐＢＶ２２０载体质粒的ＥｃｏＲⅠ、ＢａｍＨⅠ之间，构建了重组表达质粒ｐｈＧＭ９１。借助计算机分析，优化了构建质粒的转译起始区，采取定点诱变以消除ＳＤ序列和ＡＴＧ区的强二级结构，提高了表达水平。将ＧＭ-ＣＳＦ基因进行序列测定，与文献报导完全一致，所对应的氨基酸序列与天然氨基酸序列一致。将带有表达质粒ｐｈＧＭ９１的ＤＨ５α菌在４２℃诱导，表达了预期的１５ＫＤ的蛋白，约占菌体总蛋白的２０％，并探讨了不同菌株对表达水平的影响。用ＭＴＴ法测定所表达的ＧＭ-ＣＳＦ生物活性，比活性可达到１×１０~７ＩＵ／ｍｇ，表明所表达的ＧＭ-ＣＳＦ具有生物学作用。     

人Toll样受体2胞外区基因重组腺病毒的制备及鉴定

目的 构建含有人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的重组腺病毒载体并进行鉴定.方法 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞(PBMC)中扩增TLR2胞外区全长基因,克隆人pMD18-T载体并经测序验证后,通过KpnⅠ和HindⅢ双酶切将目的 片段定向克隆至经相同处理的pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒中.将构建止确的重组质粒pAdTrack-CMV-TLR2用Pme Ⅰ酶切线性化后转化感受态AdEasier-1细菌,在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒.将鉴定正确的重组质粒pAd-TLR2经PacⅠ酶切线性化后,以脂质体法转染至293细胞中进行包装并扩增病毒.观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并测定病毒滴度,用PCR法鉴定重组腺病毒.结果 RT-PCR扩增得到的目的 基因片段与GenBank中的序列一致,经酶切鉴定及PCR检测证实携带人TLR2胞外区全长基因的重组腺病毒制备成功,获得高滴度(3×109pfu/ml)的重组腺病毒.结论 成功制备了表达人TLR2胞外区基因的重组腺病毒,为后续研究奠定了基础.     

人Survivin基因重组腺病毒载体的构建及其表达

目的　构建含有人Survivin基因的重组腺病毒载体,为转染树突状细胞(DC)构建DC疫苗和基因治疗奠定基础。方法　自行设计一对分别含有KpnⅠ和XholⅠ酶切位点的Survivin基因上下游引物,以质粒pCITE/Survivin为模板,通过PCR扩增获得Survivin基因全序列。片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack CMV,获得重组质粒pAdTrack CMV Survivin。通过KpnⅠ和XholⅠ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pAdTrack Survivin转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy 1 的BJ5183菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。同时将病毒上清转染成纤维细胞,通过观察GFP的表达以及Western blot分析观察Survivin蛋白表达。结果　成功构建了含有人Survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为1 65×108pfu/L。Western blot检测可见16 5kD的Survivin蛋白表达。结论　该重组腺病毒载体的构建及成功转染到成纤维细胞内表达为下一步以人Survivin作为靶抗原的基因治疗奠定了基础。     

同源异形盒Gax基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的:构建同源异形盒Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,并对其是否重组成功进行鉴定。方法:采用两步CaC l2转化法的DNA细菌内同源重组技术,PCR扩增小鼠Gax基因,将Gax基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,转染含有5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1(33.5 kb)的B J5183细菌,经细菌内同源重组产生携带Gax基因的重组腺病毒载体pAd-Gax,经限制性内切酶BstⅨ和PacⅠ鉴定正确后,用脂质体法转染293细胞,包装产生携带Gax基因的重组腺病毒Ad-Gax。利用GFP的表达鉴定Ad-Gax。结果:构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1010pfu/L。结论:成功地构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

重组腺病毒Ad-huVEGF121的制备

目的：构建能够用于骨缺血研究的能表达huVEGF121的重组腺病毒载体。方法：将huVEGF121克隆至穿梭质粒，线性化后转染含骨架质粒的BJ5183菌，构建重组腺病毒质粒。酶切及PCR法鉴定；将其线性化后转染293细胞，通过观察绿色荧光监测病毒产生，免疫组化检测VEGF121表达。结果：成功的将hu—VEGF121克隆至穿梭质粒pTrack—CMV，正确构建了重组腺病毒质粒，感染293细胞得到大量病毒。结论：成功构建了huVEGF121重组腺病毒，为缺血性骨病的进一步研究奠定了基础。     

重组人survivin腺病毒的构建与鉴定

目的构建人survivin基因shRNA重组腺病毒载体,为缺氧性肺动脉高压（Hypoxic pulmonary hypertension, HPH）的基因治疗研究提供实验基础。方法构建survivin-siRNA表达质粒,测序鉴定正确后,将survivin-siRNA表达质粒与含有腺病毒右臂的骨架质粒pBHGE3共转染至人293A细胞,包装成腺病毒Ad-survivin并扩增,TCID50法测定病毒滴度。将人肺动脉平滑肌细胞缺氧培养24 h,并将细胞分为空白对照组（Con组）,阴性对照组（Ad-LacZ组）,不同Ad-survivin序列的干扰组（sh1组、sh2组、sh3组）。Ad-survivin感染缺氧人肺动脉平滑肌细胞,Western blot检测survivin蛋白,验证重组腺病毒干扰效果。结果①将shRNA片段与pAd-U6-CMV连接后的质粒进行测序,结果提示目的基因片段插入成功;②TCID50法测定病毒Ad-survivin-shRNA1、Ad-survivin-shRNA2和Ad-survivin-shRNA3的滴度分别是1×1010,1.2×1010,1×1010;③sh2组缺氧人肺动脉平滑肌细胞内survivin蛋白表达明显低于其他4组(P＜0.05)。结论本研究成功构建人survivin腺病毒载体,为研究survivin基因在缺氧性肺动脉高压中的作用提供了实验基础。     

一种热稳定人成纤维细胞生长因子突变体原核表达及活性鉴定

目的原核系统可溶性地表达一种热稳定性的人角质细胞生长因子-2（human keratinocyte growth factor-2,hKGF-2）并鉴定其生物活性。方法通过重叠PCR方法进行定点突变,从人胎肝cDNA文库中获得编码人KGF-2突变体的核酸序列并克隆至原核表达载体pBV220进行诱导、表达和纯化。分别检测重组KGF-2及其突变体重组蛋白的生物活性和室温条件下的稳定性。结果 KGF-2及其突变体具有相同的促Hep-2细胞的增殖能力。室温状态下48 h内,rhKGF-2出现明显降解现象而rhKGF-2突变体几乎没有出现降解,表现出强的热稳定性。结论 KGF-2突变体具有天然KGF-2的生物活性,但其热稳定性明显优于天然KGF-2蛋白,为进一步研究KGF-2的结构和功能奠定了一定的基础。     

重组腺病毒和质粒对心肌缺血治疗效果的比较

目的：研究不同载体对基因治疗效果的影响。方法：采用本实验室建立的犬心肌缺血动物模型，通过冠状动脉造影和TTC染色两种方法比较了携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒Ad-HGF和质粒puDKH对心肌缺血的治疗效果；并且在体外采用绿色荧光蛋白报告基因测定了不同载体对原代心肌细胞的转染率。结果：重组腺病毒Ad-HGF对心肌细胞的转染率和心肌缺血的治疗效果均发于重组质粒puDKH.结论：导入系统是影响基因治疗效果的关键因素之一。     

构建Egr-1启动子调控Smad7基因的重组腺病毒及启动子活性研究

目的　构建含Egr 1启动子和Smad7cDNA的重组复制缺陷型腺病毒并研究射线诱导Egr 1基因启动子调控Smad7体外表达的时间和剂量效应 ,为下一步的基因治疗奠定基础。方法以Adeno XTM表达试剂盒为基础 ,应用分子克隆技术 ,将穿梭质粒pShuttle的CMV启动子替换为Egr 1启动子 ,将Smad7cDNA亚克隆至穿梭质粒内 ,与腺病毒DNA重组 ,在HEK2 93细胞中进行包装、扩增 ,纯化测定病毒滴度。通过Westernblot检测X射线照射激活Egr 1启动子调控Smad7体外表达的时间和剂量效应。结果　经酶切、PCR及测序鉴定证实成功构建了含Egr 1启动子和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒pAdES。病毒滴度为 3 0× 10 1 1 TCID50 ml。感染重组腺病毒的靶细胞经不同剂量的深部X射线照射后Smad7蛋白表达量存在一定的时间、剂量差异 :实验组Smad7蛋白表达量在照射后 1h即已升高 ,2～ 7h之间维持在一个较高水平 ,尔后表达量开始下降 ;实验组中Smad7蛋白表达量随着吸收剂量的增加而增加 ,在 8～ 15Gy之间维持一个较高的表达水平。而对照组Smad7蛋白表达量无明显的时间和剂量效应。结论　成功构建了含Egr 1启动子和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒pAdES ,重组于腺病毒内的Egr 1启动子经射线激活后具有调控下游Smad7表达的活性。     

负载肝素酶复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

目的包装负载人肝素酶(hpa)全长cDNA的复制缺陷型腺病毒载体(Adhpa)。方法将肝素酶正义腺病毒穿梭质粒pDC315hpa与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1,3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装Adhpa,并大量扩增,收集纯化。对纯化后的Adhpa进行滴度测定、感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定。结果包装成功的腺病毒载体具有良好的感染性,纯化浓缩后的病毒滴度可达5×1010pfu/ml。电镜证实病毒浓缩液中存在病毒颗粒,并可见病毒在HEK293细胞中复制。PCR双引物鉴定Adhpa可扩增出Ad及hpa特异片段,而对照则不能扩增出hpa片段。结论成功包装了负盘。     

重组腺病毒介导反义c-myc诱导HL-60细胞粒系分化的作用

目的：研究重组反义c-myc腺病毒（Ad-AS-c-myc）诱导人急性早幼粒HL-60细胞系粒系分化及作用分子机制。方法：采用重组腺病毒Lac-Z（Ad-LacZ）及Ad-As-c-myc联合硫酸鱼精蛋白转染HL-60细胞，X-gal染色判断转染效率。采用形态学、RT-PCR、流式细胞仪、四唑氮蓝（NBT）还原试验、非特异酯酶染色等方法进行研究。结果：Ad-AS-c-myc能抑制HL-60细胞C-myc基因在转录水平的表达。被转染HL-60细胞在形态上趋向成熟粒细胞，Ad-AS-c-myc使HL-60细胞周期G0／G1阻滞，过氧化物酶、非特异性酯酶活性增强。结论：Ad-AS-c-myc对HL-60细胞具有诱导粒系分化作用。其生物学作用与HL-60细胞c-myc的表达受抑、HL-60细胞出现一些成熟粒细胞的生理功能有关。     

多聚阳离子对重组腺病毒载体体外转染血液肿瘤细胞效率的影响

目的：检测多聚阳离子复合物（Polycation）对腺病毒载体转染血液肿瘤细胞效率的影响。方法：重组LacZ腺病毒（Ad-Lacz）联合Polycation分别转染HL-60、K562、Jurkat及Raji细胞，观察阳性细胞百分率。结果：Ad-LacZ单独转染肿瘤细胞时转染率较低。联合Polycation共同转染可明显提高腺病毒载体的转染率。结论：多聚阳离子复合物可做为提高Ad-LacZ转染HL-60、K562、Jurkat及Raji细胞的辅助工具。