一种改良的质粒DNA的快速提取方法技术方法

目的:建立一种确实有效的更实用的小量质粒DNA的提取方法.方法:将一含有目的质粒的大肠杆菌扩增后采用改良后的方法提取质粒DNA,然后采用紫外分光光度计测定含量,并且进行酶切.结果:每毫升原细菌培养物质粒DNA的产量明显增高,且酶切效果极好.结论:改良后的质粒DNA提取法具有速度快、收获量多、纯度高、经济又方便等优点,适合于应用与推广.     

用于慢病毒包装的高纯度质粒 DNA 的大量制备和应用

目的：建立简便易行、成本低廉和安全可靠的高纯度质粒大量制备方法,探讨其在分子生物学研究中的应用。方法：培养含目的质粒的菌株,运用改良后的碱裂解法大量提取质粒DNA并进行纯化,微量核酸仪测定质粒DNA的产量及纯度;采用琼脂糖凝胶电泳、限制性核酸内切酶酶切、转染哺乳动物细胞和慢病毒包装,鉴定质粒DNA的质量及转染效率。结果：本质粒提取方法获得质粒DNA产量为2．5mg／L菌液,OD260/OD280=1．91;以超螺旋质粒DNA为主;限制性核酸内切酶可完全酶切;哺乳动物细胞转染效率在85％以上;可用于慢病毒包装。结论：本方法抽提质粒DNA操作简单、经济实用,可替代质粒大量提取试剂盒获得高产优质的质粒DNA,充分满足了分子生物学实验的要求。     

恶性疟疾重组质粒pPF14DNA探针的制备

采用基因克隆技术，将恶性疟原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ｐＰＦ１４质粒转化大肠杆菌ＨＢ１０１，经扩增后碱裂解法提取质粒ＤＮＡ，核酸内切酶酶切图谱分析鉴定后，低熔点胶法回收而获得高纯度和高回收率的插入片段（ｐＰＦ１４ＤＮＡ），经３２Ｐ标记后具较高敏感性与特异性，该探针制备方法具简便、稳定、省时的优点。本文对各制备程序进行了探讨。     

快速高效提取白色念珠菌DNA

目的建立两种简便的白色念珠菌ＤＮＡ提取方法，即纯ＤＮＡ提取法和快速ＤＮＡ提取法。方法以原生质体提取法为基础进行改良，两种方法均用Ｌｙｔｉｃａｓｅ破壁。结果与结论纯ＮＤＡ提取法提取ＤＮＡ耗时６～７ｈ，产量较高，每１０~（１０）个菌细胞可提取４μｇＤＮＡ，且纯度高，ＯＤ_（２６０）ＯＤ_（２８０）＞１．７，对核酸限制性内切酶敏感，适用于各种分子生物学方面的研究。快速ＤＮＡ提取法全过程仅需３～４ｈ，每１０~（１０）个菌细胞提取１μｇＤＮＡ，ＯＤ_（２６０）：ＯＤ_（２８０）＝１．４，不能进行核酸限制性内切酶酶切，但可用于作ＰＣＲ扩增。     

一种制备质粒DNA的改良碱裂解法

目的介绍一种快速获取高纯度质粒DNA的方法。方法使用替代试剂，建立改良的碱裂解法进行质粒DNA提取，并用琼脂糖电泳验证所得的质粒的质量，紫外测量估算产量及纯度。限制性酶切验证其用度。结果琼脂糖电泳显示质粒DNA条带明亮，以超螺旋方式为主。A260／280为1．903，含量为320μg／mL，酶切后得到约500bp的目的片段。结论改良碱裂解法操作简单、实用，所得样品纯度高，达到了分子生物学常规实验的要求。     

微波炉加热质粒DNA快速提取法

介绍一种以微波炉加热快速提取质粒的方法，所提取的ＤＮＡ纯度，重复性均好，操作简便，整个提取过程不超过２０ｍｉｎ，省时省力，适用于规模筛选重组克隆子，也可直接用于转化、酶切及ＤＮＡ序列测定。     

一种简捷的质粒DNA提取及纯化方法

介绍一种快速获取高纯度质粒ＤＮＡ方法,在碱裂解法快速获取质粒ＤＮＡ粗制品的基础上,利用一种不溶解蛋白质而溶解ＤＮＡ的溶液ＴＥＳ纯化质粒ＤＮＡ,同时对本法所提取的质粒的ＤＮＡ的回收率、纯度及可能的用途进行验证。此法简易,所得样品纯度高,可以直接用于转化、酶切和基因克隆。     

生物素交联补骨脂素标记HPV基因探针的制备

对含ＨＰＶ１６和ＨＰＶ１８ＤＮＡ质粒的大肠杆菌进行培养、扩增，提取大量质粒ＤＮＡ，纯化、酶切、回收ＨＰＶＤＮＡ片段，用国产生物素交联补骨脂素标记，再经纯化鉴定。制备的ＨＰＶＤＮＡ探针用亲合素辣根过氧化物酶显色，敏感性可达ｌｐｇ。检测靶核苷酸的敏感性可达５ｐｇ。该探针用于原位杂交检测１０例食管癌组织及相应癌旁粘膜组织中的ＨＰＶＤＮＡ，也取得良好结果。结果提示：用生物素交联补骨脂素标记基因探针是一种简单的方法，且效果良好，适于研究和临床检测。     

诱生性一氧化氮合酶cRNA探针的制备及敏感性检测

目的 制备地高辛标记的大鼠诱生性一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）ｃＲＮＡ探针。方法 首先对携带大鼠ｉＮＯＳ ｃＤＮＡ的ＰＭＯＳ Ｂｌｕｅ质粒进行转化扩增。然后提取扩增的质粒ＤＮＡ并用Ｂａｍ ＨⅠ内切酶酶切处理使其线性化。以线性化的ｃＤＮＡ为模板,在Ｔ７ＲＮＡ聚合酶的作用下,体外转录带有地高辛的ｉＮＯＳ ｃＲＮＡ探针。     

日本血吸虫中国大陆株安徽品系基因组文库的构建

以日本血吸虫中国大陆株安徽品系为材料，采用酚－氯仿抽提，纯化基因组ＤＮＡ。经ＢａｍＨＩ酶切后，与质粒ＰＵＣ＾１８重组，转化入大肠杆菌ＪＭ１０３，转化率为１０＾４。并对重组质粒ＤＮＡ进行酶切鉴定。     

人碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达质粒的构建

目的：构建人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因真核表达质粒,为深入研究ｈｂＦＧＦ在组织修复中的分子调节机制及临床应用提供物质基础。方法：含ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ的ｐＵＣ１８－ｈｂＦＧＦ质粒于大肠杆菌ＪＭ１０９内扩增;提取及纯化ｐＵＣ１８－ｈｂＦＧＦ质粒;经ＤＮＡ序列分析所含ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ;限制性酶切ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ片段,连接酶连接到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｎｅｏ内,克隆出真核表达质     

EB病毒3种全基因的扩增,克隆及表达

目的：扩增克隆及表达ＥＢ病毒（ＥＢＶ）３种（ＤＮＡ酶、甙激酶及ＨＢＲＦ１）全基因片段。方法：以Ｂ９５－８细胞株ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增３种目的基因。酶切鉴定后分别与高效表达载体ＰＢＶ２２１连接，用大肠杆菌ＪＭ１０３或ＨＢ１０１作为围论的宿主菌。抗氨苄青霉素培养形成单菌落后放大培养，根据重组质粒的电泳 行为粗筛，再双酶切。结果：各种阳性菌经３０℃→４２℃变温诱导培养，超声破碎后其上清液经十二烷基磺酸     

生物素交联补骨脂素标记HPV基因探针的制备

对含ＨＰＶ１６和ＰＶ１８ＤＮＡ质粒的大肠村菌进行培养、扩增，提取大鼠质粒ＤＮＡ，纯化、酶切、回收ＨＰＶＤＮＡ片段，用国产生物素交联补骨脂素标记，再经纯化鉴定，制备的ＨＰＶＤＮＡ探针用亲合素－辣根过化物酶显色，敏感性可达１ｐｇ。检测靶核苷酸的敏感性可达５ｐｇ。该探针用于原位杂交检测１０例食管癌组织及相应癌旁粘膜组织中的ＨＰＶＤＮＡ，也取得良好结果，结果提示：用生物素交联补骨脂素标记基因探针是一种简单     

携带内皮型一氧化氮合酶基因重组腺病毒载体的构建

目的：构建带有内皮型一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）基因的重组腺病毒载体。方法：将ｅＮＯＳ　ｃＤＮＡ克隆于腺病毒穿梭质粒ｐＣＡ１４，得到重组质粒ｐＣＡ１４－ＣＭＶ－ｅＮＯＳ。采用磷酸钙ＤＮＡ沉淀法将质粒ｐＣＡ１４－ＣＭＶ－ｅＮＯＳ与腺病毒拯救质粒ｐＢＨＧ１０共转染２９３细胞，通过同源重组，生成带有ｅＮＯＳ基因的复制缺陷型重组腺病毒载体（ＡｄＣＭＶｅＮＯＳ）。ｅＮＯＳｃＤＮＡ重组进入腺病毒Ｅ１区并受ＣＭＶ启动子控制。结果：经形态学、病毒ＤＮＡ酶切、ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ等方法的鉴定，证实了载体构建的正确性。结论：带有ｅＮＯＳ基因的重组腺病毒载体的成功构建，为心血管等疾病的基因治疗打下了基础。     

组织型纤溶酶原激活物cDNA克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆组织型纤溶酶原激活物（t－ＰＡ）cＤＮＡ并构建含t－ＰＡ基因的腺病毒表达 载休划硫氰酸胍；－酚－氢仿一步法从Ｂｏｗｅｓ黑色素瘤细胞中提取总ＲＮＡ，并经反转录ＰＣＲ获得t－ＰＡcＤＮＡ。将质粒pＵＣ１９双酶切并纯化回收大片段，与纯化后的ＰＣＲ产物连接构成pＵＣ１９t－ＰＡ，转化大肠肝菌ＪＭ１０９，挑选白色克隆作酶切鉴定、测序，pＵＣ１９t－ＰＡ及腺病毒载体pＡdＭＶ（６．６７ｋｂ）分别双酶切前者回收１     

在西安地区HBeAg阴性患者中检出乙型肝炎病毒前C区基因突变株

作用ＨＢｅＡｇ阴性，抗ＨＢｅ阳性患血清提取ＨＢＶ ＤＮＡ作为模板，用前Ｃ区引物进行聚合酶链反应（ＰＣＲ），选择３份ＰＣＲ扩增阳性产物，用ＥｃｏＲＩ酶切获得长为３１２ｂｐ的基因片段。将其克至ＰＵＣ１８质粒中，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，提取质粒，经ＰＣＲ扩增及酶切鉴定后，用双脱氧末端标记法进行基因序列测定。结果发现，在２例患ＨＢＶ ＤＮＡ克隆中存在有前Ｃ区基因突变，即１８９６位的鸟嘌呤为腺嘌呤...     

大鼠GDNF真核表达载体的构建及其真在核细胞中的表达

目的：构建ｐｃＤＮＡ３／ＧＤＮＦ真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达．方法：将ＧＤＮＦ逆转录聚合酶链式反应产物克隆至ｐｃＤＮＡ３真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性．结果：酶切鉴定及测序分析表明重组ｐｃＤＮＡ３／ＧＤＮＦ表达质粒克隆成功,转染实验表明重组质粒能在真核动物细胞中表达出具有活性的ＧＤＮＦ蛋白．结论：以脂质体介导     

抗药性相关糜蛋白酶基因真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建抗药性相关基因真核表达载体。方法：采用PCR方法，以淡色库蚊抗药性品系cDNA文库为模板，扩增出抗药性品系中高表达糜蛋白酶(chymotrypsin)基因，经T／A克隆测序鉴定后，扩增、纯化质粒，经双酶切后纯化目的片段，克隆到真核荧光表达载体pEGFP—C3中。结果：PCR和酶切鉴定表明，构建成功真核荧光表达载体pEGEP—C3／chymotrypsino结论：PCR加双酶切鉴定的方法构建表达质粒，迅速省时，结果可靠。     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3／GRA1的构建及序列测定

目的：构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)真核表达质粒，为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法：采用PCR扩增出编码GRAl目的基因，用EcoR Ⅰ／XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切，将GRA1定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ／XhoⅠ位点；对重组质粒进行PCR，双酶切初步鉴定后做序列测定。结果：特异扩增出预计的GRAl片段，大小为573bp；扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中，经PCR，双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论：成功构建弓形虫GRAl真核表达质粒。     

以DNA测序及限制性酶切反应鉴定PCR产物特异性

目的：对ＰＣＲ产物进行特异性鉴定。方法：采用ＤＮＡ测序及限制性酶切反应方法。结果：ＤＮＡ测序可排除ＰＣＲ产物的假阳性，另一种简单易行的方法是，设计包含某一已知偏位性酶切位点的特异引物进行ＰＣＲ，通过酶切反应及电泳分析鉴定其特异性结论：此方法对ＰＣＲ产物特异性鉴定十分必要。