补体通过激活足细胞ERK信号通路上调PD-L1表达

目的:探讨补体损害足细胞的可能机制。方法:将足细胞分为对照组、补体刺激组、补体+ERK抑制剂组,免疫蛋白印迹法检测足细胞PD-L1、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)表达,并用细胞迁移实验检测足细胞功能。结果:补体刺激组足细胞ERK/p-ERK表达上调(P<0.05),PD-L1表达上调(P<0.05),加入ERK抑制剂后足细胞PD-L1表达下调,伴迁移减少。结论:补体通过激活ERK/p-ERK信号通路上调PD-L1表达,导致足细胞损害。     

阻断PD-L1通路对膀胱肿瘤患者外周血树突状细胞免疫功能的影响

目的 研究阻断膀胱肿瘤患者外周血树突状细胞(dendritic cell,DC)PD-L1通路对其免疫功能的影响. 方法 通过rhGM-CSF、rhIL-4在体外诱导膀胱肿瘤患者和正常人外周血DC,PD-L1单克隆抗体处理后,流式细胞仪检测CD1a 、HLA和CD83的表达;噻唑盐比色法和酶联免疫吸附法检测其刺激淋巴细胞增殖和分泌IL-10和IL-12能力的变化. 结果 阻断PD-L1通路对DC成熟无明显影响,但可以使膀胱肿瘤患者DC刺激淋巴细胞增殖能力增强(4.00±1.28和1.49±0.45),并增强IL-12[(108.30±21.89)ng/L和(37.17±14.89)ng/L]、减少IL-10[(108.90±21.77)ng/L和(214.99±54.99)ng/L]的分泌(P＜0.05). 结论 阻断PD-L1通路可使膀胱肿瘤患者外周血DC的免疫活性增强,提示可尝试通过PD-L1通路调节膀胱肿瘤患者的免疫功能,为防治膀胱肿瘤复发提供新途径.     

RNA干扰阻断OX40/OX40L共刺激通路对CD4+CD25+T调节细胞的影响

目的 探讨慢病毒介导的RNA干扰技术诱导小鼠树突状细胞OX40L基因沉默对调节性T细胞的影响. 方法 设计针对小鼠OX40L基因的RNA于扰序列,通过外源筛靶筛选出干扰效果最佳的序列.以293T为包装细胞,制备含OX40L的siRNA序列的慢病毒载体OX40L-RNAi-LV和阴性对照载体NC-GFP-LV.采用磁式分选器分离培养骨髓来源的小鼠树突状细胞(DCs),以MOI为25进行转染,分别将转染OX40L-RNAi-LV(实验组)、转染NC-GFP-LV(阴性对照组)和未转染(空白对照组)的DCs与磁式分选器分选得到的CD4+CD25+T调节细胞共培养,6 d后通过流式细胞仪检测T调节细胞的增殖和凋亡情况. 结果外源筛靶筛选出干扰效果最佳的RNA干扰序列(靶序列为GCTCATACAAGAATGAGTA),OX40L蛋白表达的抑制率为73.1%.感染复数为25时,慢病毒载体感染DCs的效率为86.4%.DCs与CD4+CD25+T调节细胞共培养后,实验组的凋亡细胞比例为8.7%,显著低于阴性对照组(20.1%)和空白对照组(19.8%),F=244.22,P=0.000;而增殖细胞前体频率为38.3%,明显高于阴性对照组(24.5%)和空白对照组(22.9%),F=95.40,P=0.000.结论 小鼠OX40L的siRNA慢病毒载体可以有效降低树突状细胞OX40L的表达,对体外培养的CD4+CD25+T调节细胞具有显著地促进增殖、减少凋亡的作用.     

慢性HBV感染者HBV特异性CD8＋ T细胞Tim-3和PD-1的表达水平及其与IFN-γ产生的相关性研究

目的：研究免疫球蛋白黏蛋白分子-3（Tim-3）和程序性死亡受体-1分子（PD-1）在慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者外周血HBV特异性CD8＋ T细胞表面的表达模式,了解其与γ-干扰素（IFN-γ）产生的关系,并探讨其临床意义。方法采用流式细胞术检测主要组织相容性复合体-2（HLA-A2）阳性的78例临床类型不同的慢性HBV感染患者HBV特异性CD8＋ T细胞表面分子Tim-3和PD-1的表达,ELISA方法检测外周血单个核细胞（PBMC）培养上清液中IFN-γ的水平。结果慢性HBV感染者Tim-3＋/PD-1＋HBV特异性CD8＋ T细胞比例占总的HBV特异性CD8＋ T细胞的58%,Tim-3-/PD-1＋细胞比例为24%,Tim-3-/PD-1-比例16%,Tim-3＋/PD-1-比例最低为2%。临床病情越严重的临床类型中,Tim-3＋/PD-1＋HBV特异性CD8＋ T细胞比例越高,慢性乙型肝炎轻中度组为（52.05±18.68）%,重度肝炎组为（59.66±19.25）%,重型肝炎组最高为（68.72±17.21）%;各组与非活动性携带者组比较,P值分别为0.007、0.009、0.000。重型组与轻中度组比较,P =0.018。Tim-3＋/PD-1＋在HBV特异性CD8＋ T细胞的表达与细胞培养上清液IFN-γ的水平呈负相关性（r =-0.466,P ＜0.001）。结论在HBV特异性CD8＋ T细胞中,Tim-3和PD-1共同表达是其主要表达模式,Tim-3和PD-1的高表达可能负性调控IFN-γ的产生,从而影响慢性HBV感染的疾病进展和结局。     

杜仲对UUO模型大鼠肾纤维化TGF-β1／Smad信号通路的影响

目的：研究杜仲对单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠肾组织转化生长因子-β1（TGF-β1）、Smad2、Smad7表达的影响。方法：将32只大鼠随机分为4组,每组8只,即假手术组、模型组、厄贝沙坦组和杜仲组。厄贝沙坦组给予厄贝沙坦10mg·kg^-1·d^-1、杜仲组给予杜仲6g·kg^-1·d^-1治疗,均术前2d开始给药。术后2周处死大鼠,收集血清测定尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）,光镜下观察Masson和HE染色肾间质的病理改变,并应用免疫组织化学方法检测肾组织TGF-β1和Smad2、Smad7蛋白的表达。结果：模型组与两治疗纽大鼠血清Scr、BUN上升,与假手术组比较差异有统计学意义（P〈0．05）;模型组、杜仲组、厄贝沙坦组肾间质纤维化程度均较假手术组明显增高（P〈0．05）;模型组TGF-β1、Smad2的表达增加,与假手术组相比差异有统计学意义（P〈0．01）;杜仲组与模型组相比,TGF-β1、Smad2的表达下降,而Smad7的表达增高,差异有统计学意义（P〈0．05）;杜仲组与厄贝沙坦组各指标比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论：杜仲能通过下调TGF-β1、Smad2的表达及增加Smad7的表达而抑制单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化,机制与杜仲可以部分调节TGF-β1／Smad信号转导通路有关,其改善肾纤维化作用与厄贝沙坦无明显差异。     

miRNA-155对调节性T细胞表型和功能的影响

目的 探讨微小核糖核酸(miRNA)-155对调节性T细胞(Treg)的两种亚型诱导性Treg(iTreg)和天然性Treg(nTreg)的影响。 方法 采用健康成人外周血分离获取的外周血单个核细胞(PBMC),利用磁性细胞分选法分别获取幼稚T细胞和nTreg。培养阶段将细胞分为3组:对照组(幼稚T细胞加入白细胞介素-2培养)、iTreg组(幼稚T细胞加入白细胞介素-2和转化生长因子-β培养)和nTreg组(nTreg加入白细胞介素-2培养)。每组再分为3个亚组:未处理亚组、scramble亚组和miRNA-155拮抗剂亚组(每亚组3个孔)。采用低密度芯片分析方法检测3组中的未处理亚组细胞中miRNA-155的基因表达水平。采用流式细胞术检测3组中各亚组细胞的表面标志物CD25、Foxp3、CD127水平。采用流式细胞术检测3组中各亚组细胞的CD4⁺ CD25⁺Foxp3⁺SOCS1⁺ Treg比例;采用流式细胞术检测3组中各亚组细胞的Treg抑制功能。 结果 与对照组和iTreg组比较,nTreg组细胞的miRNA-155表达水平明显降低,差异有统计学意义(均为P<0.05)。与对照组和iTreg组比较,nTreg组的SOCS1表达水平明显升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。加入miRNA-155拮抗剂后并未导致Foxp3、CD127和CD25等Treg重要表面标志物发生明显的变化。与对照组和iTreg组比较,nTreg组的SOCS1表达水平明显升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。iTreg组中的未处理亚组细胞miRNA-155表达水平较低,而拮抗剂抑制其表达之后(miRNA-155拮抗剂亚组),能够使其SOCS1表达升高。iTreg组中,与未处理亚组比较,miRNA-155拮抗剂亚组的Treg抑制功能在1:8、1:16、1:32的比例时,显示出了更强的抑制功能(均为P<0.05)。 结论 体外拮抗miRNA-155对nTreg的抑制功能无明显影响,但是能够增加iTreg的SOCS1表达水平和体外抑制功能。     

基于协同刺激分子表达量建立慢性HBV感染患者T淋巴细胞免疫功能评价新体系的研究

目的 探讨慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者外周血T淋巴细胞CD28、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）、程序性死亡分子-1（PD-1）和T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（Tim-3）的表达及意义.方法 连续收集2012年10月至2013年6月在苏州大学附属第一医院住院的慢性HBV感染患者102例,其中慢性乙型肝炎（CHB） 42例,乙型肝炎肝硬化30例,肝癌30例.另选30名健康体检者作为对照组.采用流式细胞术和定量聚合酶链反应（PCR）技术测定所有研究对象外周血T淋巴细胞表面CD28、CTLA-4、PD-1和Tim-3的表达量,并采用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组间的差异.采用Spearman秩相关分析外周血T淋巴细胞表面CD28、CTLA-4、PD-1和Tim-3的表达量与HBV DNA载量、乙型肝炎e抗原（HBeAg）和丙氨酸转氨酶（ALT）之间的相关性.结果 慢性HBV感染患者CD4＋ CD28＋、CD8＋ CD28＋和CD4＋ CTLA-4＋的表达均低于健康对照人群,其中肝癌组的CD4＋ CD28＋表达量低于CHB组（t=2.373,P＜0.05）,肝硬化和肝癌组的CD8＋CD28＋表达量低于CHB组（t=4.324和4.088,P＜0.01）.CHB组CD8＋ PD-1＋、CD4＋ Tim-3＋和CD8＋ Tim-3＋的表达量高于肝硬化、肝癌以及健康对照组（t=3.051,3.130,3.121,3.254和3.723,P＜0.01）.相关性分析显示,CD8＋T淋巴细胞PD-1表达量与ALT水平、HBV DNA载量呈正相关（r=0.516和0.582,P＜0.01）;CD8＋T淋巴细胞Tim-3的表达量与ALT水平、HBV DNA载量也呈正相关（r=0.578和0.556,P＜0.01）.此外,CD8＋T淋巴细胞PD-1与Tim-3的表达量也呈一定的正相关（r =0.506,P＜0.01）.结论 HBV感染患者外周血T淋巴细胞表面分子异常表达与其免疫功能紊乱和疾病慢性化的发生和发展相关.     

lncRNA FER1L4调控Wnt/β-catenin信号通路对甲状腺癌细胞恶性生物学行为的影响

目的：探讨lncRNA FER1L4调控Wnt/β-cate nin信号通路对甲状腺癌细胞恶性生物学行为的影响。方法：检测人甲状腺滤泡上皮正常细胞和甲状腺癌细胞中FER1L4的表达水平。将SW579细胞分为control组、s i-NC组、s i-FER1L4组、Li Cl+s i-FER1L4组;检测各转染组细胞FER1L4的表达水平,细胞增殖,细胞凋亡率,细胞迁移和侵袭;检测细胞Cleaved caspase3、β-catenin、c-Myc和Cyclin D1蛋白表达水平。结果：SW579细胞中FER1L4表达水平最显著;干扰FER1L4后,其细胞活力、增殖率、迁移和侵袭个数、β-catenin、c-Myc和Cyclin D1蛋白表达显著降低,细胞凋亡率和Cleaved caspase3表达显著升高（P<0.05）;与si-FER1L4组相比,Li Cl+si-FER1L4组细胞活力、增殖率、迁移和侵袭个数、β-catenin、c-Myc和Cyclin D1蛋白表达显著升高,细胞凋亡率和Cleaved cas pas e3表达显著降低（P<0.05）。结论：干扰FER...     

自体外周血造血干细胞移植对弥漫性大B细胞淋巴瘤患者PD-1、B7-H1表达及T细胞亚群的影响

目的研究自体外周血造血干细胞移植（auto-PBSCT）对弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者程序性死亡因子-1（PD-1）及其配体B7同系物1（B7-H1）表达及T细胞亚群的影响。方法选择浙江大学医学院附属第-医院血液科和温州市中心医院血液科2009年7月至2012年6月接受auto-PBSCT的27例DLBCL患者作为观察组,选择25例同期参加体检的健康人群作为对照组。流式细胞仪检测两组PD-1、B7-H1表达,并分析各组T细胞亚群。结果观察组移植后3个月PD-1阳性表达率低于初次诊断时[（4．6±1．0）％和（12．5±2．1）％],差异具有统计学意义（t=4．47,P〈0．05）。观察组两次检测结果均高于对照组,差异具有统计学意义（t=22．70和25．11,P均〈0．05）。观察组移植后3个月B7-H1阳性表达率低于初次诊断时[（5．7±1．4）％和（16．3±1．7）％],差异具有统计学意义（t=6．78,P〈0．05）。观察组两次B7-H1检测结果均高于对照组（t=25．15和38．06,P均〈0．05）。观察组移植后3个月CD3±T细胞百分比高于初次诊断时[（57±7）％和（44±4）％],差异具有统计学意义（t=6．29,P〈0．05）。观察组两次CD3±T细胞百分比检测结果均低于对照组（t=5．69和7．36,P均〈0．05）。观察组移植后3个月CD4＋T细胞百分比低于初次诊断时[（11±4）％和（29±3）％],差异具有统计学意义（t=5．47,P〈0．05）。观察组两次CD4＋T细胞百分比检测结果均低于对照组,差异具有统计学意义（t=4．61和7．11,P均〈0．05）。观察组移植后3个月CD8±T细胞百分比高于初次诊断时[（32．5±2．7）％和（16．4±3．2）％],差异具有统计学意义（t=9．73,P〈0．05）。与对照组相比,观察组初次诊断后CD8±T细胞百分比较低,而移植后3个月较高（t=10．62和14．71,P均〈0．05）。观察组初次诊断后CD4＋／CD8±比值高于移植后3个月（1．8±0．4和0．4±0．1）,差异具有统计学意义（t=8．57,P〈0．05）。移植后3个月CD4＋／CD8±比值明显低于对照组,差异具有统计学意义（t=11．73,P〈0．05）。结论DLBCL患者存在细胞免疫功能紊乱,auto-PBSCT可以影响DLBCL患者的PD-1、B7-H1表达及T细胞亚群百分比,在-定程度上纠正细胞免疫功能。     

纳米刀消融联合程序性死亡蛋白-1/程序性死亡蛋白配体-1治疗胰腺癌及其免疫学机制研究进展

胰腺癌特殊的肿瘤微环境不利于免疫治疗,而纳米刀消融可在一定程度上逆转免疫抑制,使其成为目前唯一适用于胰腺癌的消融治疗方法。动物研究结果证实,纳米刀消融联合程序性死亡蛋白-1（PD-1）/程序性死亡蛋白配体-1（PD-L1）治疗胰腺癌可延长患者生存时间。本文对纳米刀消融联合PD-1/PD-L1治疗胰腺癌及其免疫学机制研究进展进行综述。     

慢性乙型肝炎患者不同免疫状态下外周血T淋巴细胞程序性死亡受体1表达与乙型肝炎病毒DNA载量及丙氨酸氨基转移酶水平的相关性

目的探讨慢性乙型肝炎（CHB）患者不同免疫状态下外周血T淋巴细胞程序性死亡受体1（PD-1）表达与乙型肝炎病毒（HBV）DNA载量及丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平的相关性。 方法选取2017年1月至2018年3月于内蒙古医科大学附属医院接受治疗的CHB患者118例,依据患者不同免疫状态分成3组,分别为HBV e抗原（HBeAg）阴性组（25例）、免疫活化组（67例）和免疫耐受组（26例）;同时选取同期在本院健康体检者50例作为对照组。全自动生化分析仪检测肝功能,ELISA法检测HBV核心抗体（HBcAb）、HBV表面抗原（HBsAg）、HBV e抗体（HBeAb）、HBeAg和HBV表面抗体（HBsAb）含量,荧光定量PCR检测患者HBV DNA载量,流式细胞仪检测血清表达PD-1的CD8⁺ T、CD4⁺ T淋巴细胞含量。 结果免疫活化组、HBeAg阴性组患者血清表达PD-1的CD8⁺ T、CD4⁺ T含量分别为（7.48 ± 1.76）%、（7.48 ± 1.76）%和（10.58 ± 1.95）%、（8.38 ± 1.85）%,均高于对照组[（3.22 ± 1.53）%、（4.05 ± 1.76）%]和免疫耐受组[（4.26 ± 1.89）%、（3.86 ± 1.89）%],差异均有统计学意义（F = 12.084、P = 0.015,F = 13.297、P = 0.032）;免疫活化组、HBeAg阴性组患者HBV DNA载量分别为（7.02 ± 1.13）log₁₀拷贝/ml和（5.77 ± 1.25）log₁₀拷贝/ml,低于免疫耐受组患者（8.18 ± 1.08）log₁₀拷贝/ml,差异有统计学意义（F = 11.652、P = 0.006）;免疫活化组、HBeAg阴性组患者血清ALT、总胆红素含量分别为（193.02 ± 7.39）IU/ml、（50.06 ± 2.18）mmol/L和（179.14 ± 7.62）IU/ml、（43.65 ± 2.27）mmol/L,均高于对照组[（12.71 ± 6.19）IU/ml、（13.07 ± 2.19）mmol/L]和免疫耐受组[（23.19 ± 6.82）IU/ml、（16.54 ± 2.30）mmol/L],差异均有统计学意义（F = 10.906、P = 0.027,F = 9.583、P = 0.019）;Pearson相关分析显示,免疫耐受组、免疫活化组及HBeAg阴性组患者血清内表达PD-1的CD8⁺ T、CD4⁺ T含量和血清ALT含量无相关性（r =－0.170、0.046、0.068、－0.231、0.048、0.005,P = 0.443、0.750、0.761、0.292、0.709、0.912）,与血清HBV DNA载量亦无相关性（r = －0.049、0.107、0.104、－0.301、0.019、0.279,P = 0.810、0.440、0.681、0.201、0.883、0.221）。 结论CHB患者机体免疫状态和血清内T细胞PD-1表达量相关,患者肝脏炎症受损对PD-1表达有重要影响,而HBV DNA载量非主要影响因素。     

Nanoparticle delivery of mycophenolic acid upregulates PD-L1 on dendritic cells to prolong murine allograft survival

Conventional immunosuppressive drug delivery requires high systemic drug levels to provide therapeutic benefit, but frequently results in toxic side effects. Novel drug delivery methods, such as FDA-approved poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles (NPs), are promising drug delivery platforms to reduce drug doses and minimize toxicity. Using murine models of skin transplantation, we investigated whether PLGA NPs would effectively deliver mycophenolic acid (MPA), a common clinical immunosuppressant, and avoid the toxicity of conventional drug delivery. We found that intermittent treatment with NPs encapsulated with MPA (NP-MPA) resulted in a significant extension of allograft survival than intermittent conventional MPA treatment even though the concentration of MPA within NP-MPA was a 1000-fold lower than conventional drug. Importantly, recipients who were administered NP-MPA intermittently avoided drug toxicity, whereas those treated with daily conventional drug manifested cytopenias. Dendritic cells (DCs) endocytosed NP-MPA to upregulate programmed death ligand-1 (PD-L1) and displayed a decreased ability to prime alloreactive T cells. Importantly, the ability of NP-MPA to promote allograft survival was partly PD-L1 dependent. Collectively, this study indicates that NPs are potent drug delivery tools that extend allograft survival without drug toxicity.