大肠杆菌偏嗜性Osteostat胞外段编码基因的克隆

目的采用基因工程的手段研制人Osteostat胞外蛋白，通过大肠杆菌偏嗜性人Osteostat胞外段编码基因的克隆，为重组蛋白的研发作初步准备。方法按照氨基酸密码子的简并性原则将人Osteostat胞外段编码系列全部替换成大肠杆菌偏嗜性密码子，并将其分成三段扩增，再通过重叠延伸PCR将三个片段连接起来。然后，将回收的人Osteostat基因片段和pQE-30Xa表达载体相连，转化大肠杆菌感受态细胞，进行初步的诱导表达，表达产物行SDS-PAGE分析。结果通过重叠延伸PCR获得了大肠杆菌偏嗜性的编码序列，通过测序验证了其序列的正确性。对重组表达载体转化菌进行诱导表达，SDS-PAGE分析证实获得预期分子量的目标蛋白。结论大肠杆菌偏嗜性的人Osteostat胞外段编码基因表达载体的构建为重组蛋白的研发打下基础。     

大肠杆菌偏嗜性密码子组成的人降钙素(hCT)编码序列的克隆

目的：克隆适于在大肠杆菌(Escherichia coli，E．coli)中表达的人降钙素(hCT)基因，为提高其表达水平奠定基础。方法：根据大肠杆菌密码子频率表，在不改变hCT。氨基酸组成的前提下，设计并合成适于在大肠杆菌中表达的编码hCT的DNA序列，经PCR扩增后，与质粒载体pGEM^R-Teasy进行连接。连接产物转化感受态JM109大肠杆菌，筛选阳性菌落，经扩大培养后，对所含重组质粒进行鉴定。结果：经酶切鉴定及DNA序列分析证实，hCT编码DNA序列成功地克隆人pGEM^R-Teasy载体中，其序列与设计的完全一致。结论：完成了大肠杆菌偏嗜性人降钙素基因的克隆，为下一步hCT表达载体的构建及在大肠杆菌中进行表达的研究奠定了基础。     

NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phbB的克隆和在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中克隆和表达NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶基因。方法：通过PCR方法克隆来源于Alcali-genes eutrophus菌的NADPH依赖性的乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phbB，将其克隆在大肠杆菌表达质粒pET28a中，进行PCR和DNA序列测定验证，并通过IPTG诱导表达。结果：通过PCR和DNA核酸序列分析，证实获得的基因片段为phbB全编码序列，phbB被克隆在大肠杆菌表达质粒pET28a中，重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导获得表达。结论：获得了Al-caligenes eutrophus菌的NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶基因，将其克隆在pET28a中，经诱导获得PhbB的表达，为进一步研究PhbB的理化性质和酶动力学性质奠定了坚实的基础。     

抗preS1分子高效单克隆抗体的制备及其在血清LHBs检测中的应用

目的 制备可用于血清LHBs检测的针对preS1高效单克隆抗体并进行初步临床应用研究.方法 对乙肝preS1区段基因(B基因型,adr血清亚型)全长序列(1～119 aa)进行密码子偏嗜性改造后,克隆入质粒pET32a构建原核表达重组质粒并转化入大肠杆菌BL21 (DE3),采用离子交换、HIS亲和层析柱以及肠激酶(E...     

猪干扰素-γ基因的合成及其在大肠杆菌中的表达

目的:构建猪干扰素-γ基因(PoIFN-γ)的融合表达质粒,并在原核系统表达,为猪γ干扰素生物药剂或疫苗佐剂的开发奠定基础.方法:选择大肠杆菌偏爱密码子,分成20个长约48 bp且相互配对的寡核苷酸片段,采用重叠PCR方法人工合成了猪干扰素-γ成熟蛋白编码基因,并经测序证实后克隆至原核表达载体pQE30中.经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,不同温度下以IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析.结果:限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了PoIFN-γ基因,成功构建了重组质粒pQE30/PoIFN-γ,SDS-PAGE分析显示目的蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中获得高表达,表达量占总菌体蛋白的84.5%.结论:应用重叠PCR合成PoIFN-γ基因并在大肠杆菌中得到了高效表达.     

重组人骨形成蛋白2基因在大肠杆菌中的克隆

目的：在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因,方法：由人成骨细胞中提取细胞总RNA,利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA;将获得基因片段重组到pCI质粒中,转化到大肠杆菌Top10后挑选克隆,利用限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定重组质粒。结果：质粒DNA酶切分析及核酸序列分析证实,获得的基因片段为人BMP2全编码序列,结论：克隆获得人骨形成蛋白2基因,为表达骨形成蛋白2奠定了基础。     

猪干扰素-γ基因在大肠杆菌中的克隆表达及其活性测定

目的在大肠杆菌中高效表达重组猪干扰素γ(porcineinterferongamma,poIFN-γ),并对其抗病毒活性进行初步研究。方法选择大肠杆菌偏爱密码子人工合成了猪干扰素-γ成熟蛋白编码基因,克隆至原核表达载体pQE30中,IPTG诱导表达,表达产物经变性、复性、纯化后,测定其抗病毒活性。结果目的蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中获得高表达,表达量占总菌体蛋白的84.5%,纯化后的纯度达到95%以上,在PK15细胞上抗滤泡性口炎病毒比活性为6.2×105U/mg。结论PoIFN-γ基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达产物具有抗病毒活性。     

人脑源性神经营养因子基因克隆及序列分析

目的：克隆人脑源性神经营养因子（hBDNF)基因并进行序列分析。方法：提取健康成人末梢血白细胞基因组DNA作为模板,应用PCR技术和T－载体克隆法克隆hBDNF基因,筛选阳性克隆,酶切鉴定,并进行序列测定和分析。结果：DNA序列测定的结果与GenBank提供的已知序列（M61181）比较,所克隆的hBDNF基因从超始密码子ATG到终止密码子TAG全长共744bp,序列完全相同,结论：自人基因组DNA中克隆hBDNF基因,为进一步开展阿尔茨海默病（AD）的基因治疗积累了资料。     

HMGB1 B盒编码序列的克隆和大肠杆菌表达

目的：克隆小鼠高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)B盒编码序列并在大肠杆菌中表达GST—B盒融合蛋白．方法：从新生小鼠肺组织提取总RNA,经RT—PCR获得HMGB1 B盒编码序列．将酶切后PCR产物克隆到pGEX-4T-2载体的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ位点之间,经双酶切鉴定后测序证实．用pGEX-4T-2-B转化BI21(DE3)感受态细胞,在30℃经IPTG诱导表达5h后进行SDS-PAGE分析．结果：测序结果证实成功获得了小鼠HMGB1 B盒编码序列,其序列与GenBank中报道序列完全一致．SDS-PAGE分析表明,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了GST-B盒蛋白,表达量约占菌体总蛋白的30％,结论：成功克隆小鼠HMGB1 B盒编码序列并在大肠杆菌中获得了高效表达。     

SARS病毒M蛋白编码基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：克隆SARS冠状病毒膜蛋白M胞外区编码序列，并将其置于大肠杆菌作融合表达。方法：从GenBank获得SARS病毒BJ01株膜蛋白M编码基因序列，人工合成其氨基端129-base-pair(bp)双向单链DNA序列，在5’和3’端分别引入BamHⅠ、Ⅰ酶切位点，退火后形成双链DNA，常规法将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，构建含M蛋白编码基因的重组原核表达质粒。重组质粒经酶切鉴定，核酸序列测定和分析后转化大肠杆菌(E．co如)BL21感受态细胞，以异丙基硫代一B—D一半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果：核酸序列测定与分析的结果表明，克隆的129bp基因序列与基因数据库中所登记的BJ01毒株序列呈现100％同源性。IPTG诱导后的菌体，经SDs-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，显示有一个大小为30．1ku的融合表达蛋白产生。结论：M蛋白氨基端胞外区129bp编码基因在E.coli中获得正确表达。     

大鼠肺动脉平滑肌细胞信号转导及转录激活因子亚型Ⅱ基因的克隆及序列分析

目的：克隆大鼠肺动脉平滑肌细胞信号传导与转录活化因子亚型Ⅱ基因（STAT2）并对此序列进行同源性分析。方法：单纯胶原酶法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞，采用RT－PCR克隆大鼠肺动脉平滑肌细胞信号传导与转录活化因子亚型Ⅱ基因（STAT2）cDNA编码序列，应用PCR、四色荧光和双脱氧终止法测序；并对克隆序列进行同源性分析。结果：应用RT－PCR克隆出大鼠肺动脉平滑肌细胞STAT2 cDNA编码序列。大鼠肺动脉平滑肌细胞STAT2 cDNA编码序列与Genbank中小鼠STAT2 cDNA相应序列具有高度同源性。结论：正常培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞表达信号传导与转录活化因子亚型Ⅱ基因（STAT2）。而克隆STAT2有利于探索大鼠血管性疾病信号转导的机制和防治。     

GST-PPARγC1原核表达载体的构建、表达及抗GST-PPARγC1多克隆抗体的制备

目的 在大肠杆菌中表达过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1(PPARγC1)与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白，并制备抗PPARγC1的多克隆抗体。方法 从肝癌细胞系HepG2提取总RNA，用RT-PCR扩增出PPARγC1 cDNA的编码序列，克隆入表达载体pGEX-4T-1中，重组载体在酶切鉴定后，在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-PPARγC1蛋白，SDS-PAGE分析表达产物，通过亲和层吸法纯化表达的GST-PPARγC1融合蛋白，并以此为抗原制备多克隆抗体。Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果 经测序、酶切鉴定证明，PPARγC1基因已正确插入到pGEX-4T-1中，经IPTG诱导后，表达出相对分子量为44000的融合蛋白。Western blotting鉴定所制备的多克隆抗体可以与PPARγC1特异性结合。结论 PPARγC1片段在大肠杆菌中的成功表达及制备得到的多克隆抗体，为检测PPARγC1及其在其他组织中的表达提供了一种检测途径。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的密码使用偏嗜性与tRNA基因

目的 检索分析铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的遗传密码使用偏嗜性及其tRNA基因的关系。方法 利用生物信息学软件和网上生物信息学工具，检索分析PaP3的遗传密码使用偏嗜性；并与铜绿假单胞菌PAO1的遗传密码使用偏嗜性进行对比分析；检索PaP3基因组中tRNA基因并分析其与遗传密码使用偏嗜性的关系。结果 传密码偏嗜性分析发现噬菌体PaP3和铜绿假单胞菌优势码一致的氨基酸有F－uuc,I-auc,V-guc,A-gcc,Y-uac,H-cac,N-aac,K-aag和T-acc；PaP3单独具有偏嗜性密码的氨基酸有A－gcu,G-ggu,T－acu和V-gua；铜绿假单胞菌PAO1单独具有偏嗜性密码的氨基酸有L－cug,V-gug,P-ccg,V-gcg,Q-cag,D-gac,E-gag,C-ugc,R-cgc,S-agc和G-ggc。tRNA基因查询发现了PaP3基因组中存在三段tRNA编码序列，分别编码tRNA^Asp,tRNA^Pro；它们的反密码子分别为“gtt”，“gtc”和“tgg”，分析结果没有表明这三个tRNA基因与优势转运氨基酸有关。结论 铜绿假单胞菌PAO1的遗传密码偏嗜性更为明显，而PaP3的遗传密码偏嗜性相对较弱，两者在遗传密码偏嗜性方面并未表现出一致性；噬菌体编码的tRNA基因与遗传密码偏嗜性之间有直接联系。     

耐热植酸酶基因phyA的克隆及新型表达载体的构建

目的 克隆烟曲霉耐热植酸酶基因，构建分泌性的真核表达质粒，以获取耐热的基因工程植酸酶。方法 提取烟曲霉菌的基因组，以此为模板PCR扩增成熟肽编码序列，双酶切后与包含黑曲霉葡萄糖淀粉酶启动子和基因片断的真核表达栽体pYG1．2相连接，转化入大肠杆菌DH5a，从转化菌株中提取质粒进行序列测定和分析。结果 PCR扩增出1326bp的植酸酶编码序列，插入pYG1．2质粒中，构建了重组质粒，重复实验结果表明，该植酸酶基因序列与已报道的烟曲霉植酸酶序列有2个碱基的差异，编码的蛋白质序列有99．8％的同源性。结论 成功构建了用于黑曲霉菌真核表达耐热植酸酶的重组质粒。     

P6BMP2的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中克隆和表达骨形态发生蛋白2（BMP2）的变体P6BMP2并初步纯化。方法：根据P6肽的氨基酸序列,按照大肠杆菌偏爱密码子将P6肽的核酸序列设计在5’端引物,通过PCR方法合成P6BMP2基因,并将其克隆到大肠杆菌表达质粒pALEX中,经NcoⅠ、XhoⅠ双酶切和DNA序列测定验证。结果：通过双酶切和DNA序列分析,证实获得的基因片段与我们期望的相符合,重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导获得表达。表达产物经超声破碎和Heparin Sepharose^TM 6Fast Flow亲和层析纯化,获得重组蛋白。结论：构建了P6BMP2的表达质粒,获得P6BMP2的表达并建立了纯化方式,为P6BMP2的深入研究和应用奠定了坚实的基础。     

IV型胶原片段阻滞原的基因克隆及原核表达研究

目的 克隆中国人阻滞原基因并高效表达。方法 利用高保真聚合酶链反应（HF-PCR）从胎肝细胞QSD胞克隆Ⅳ型胶原α1链NC1结构域编码序列，即阻滞原基因。并进行序列分析。将阻滞原基因克隆入表达载体pQE-31，转化大肠杆菌M15[pREP4]并用IPTG诱导蛋白表达，蛋白电泳鉴定重组阻滞原蛋白。结果 从胎肝细胞克隆的人阻滞原基因长687bp，编码229个氨基酸。大肠杆菌表达的重组阻滞原N-末端与载体编码的组氨酸标签形成融合蛋白；SDS-PAGE分析显示，经IPTG诱导后可出现28kd的目的蛋白条带。最高可占总菌体蛋白的32%，结论 该法可成功克隆阻滞原基因。将有助于肿瘤血管抑制疗法的深入研究。     

人CD137分子基因克隆及其在COS-7细胞中表达的研究

目的：克隆人CD17分子的编码序列，将其重组人真核表达载体，并表达于COS－7细胞，方法：从活化的T细胞cDNA文库中以PCR方法克隆编码人CD137的编码序列，对其序列进行测定。将测定正确的CD137编码序列克隆入真核表达载体PCI－neo，构建重组表达载体。采用质体法转染COS－7细胞，用流式细胞仪检测CD137分子的表达。结果：PCR方法扩增出一800bp左右的基因片段，插入PCI－neo构建重组表达载体后，经序列测定证实扩增的片段为人CD137编码序列，将重组子转染COS－7细胞，流式细胞仪检测显示有27．11％的细胞表达人CD137分子。结论：成功地克隆并在COS－7细胞中表达了CD137分子。     

人表皮生长因子cDNA序列分析及其在大肠杆菌中的表达

应用逆转录聚合酶链反应从人脐静内皮细胞ＲＮＡ中扩增了表皮生长因子的ｃＤＮＡ，采用基因重组技术克隆到ｐＧＥＭ－３ｚｆ载体中，经全自动荧光测序仪测定了其序列。在ＰＣＲ扩增引物上分别加有起始密码子和终止密码子，以利于原核表达。经亚克隆，ＥＧＦｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＢＶ２２０的Ｅｃｏ ＲＩ，ＳｍａⅠ位点上，在大肠杆菌ＤＨ５α中进行表达。     

抗凋亡基因bcl-2 cDNA表达型质粒的构建及序列分析

克隆抗凋亡基因bcl-2，并构建其表达型质粒；进行序列分析，为基因转染作准备。方法：应用PCR定向克隆技术，克隆SD大鼠鼠脑bcl-2全编码CDNA序列；应用双脱氧末端终止法进行重组质粒中bcl-2的cDNA序列分析；利用基因重组技术，将bcl-2全编码cDNA序列，导人pCMVT-Tag-1表达型质粒。结果：成功地克隆sD大鼠bcl-2全编码cDNA序列，并将其成功地导人pCMV-Tag-1表达型质粒；经序列分析，发现bcl-2全编码序列与Gene-Bank中的相应序列相比，有3个碱基出现差别，分别为171位a→g，233位a→c，530位g→a，均为同义突变。结论：为抗凋亡基因bcl-2对胰岛细胞的转染研究提供了实验基础。