赖型钩体重组质粒pDJH_2亚克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

为了探讨ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂ０１７株钩体ＤＮＡ片段可否作为钩体重组疫苗广谱保护性抗原的候选，采用重组ＤＮＡ技术，将ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂＤＮＡ片段分别与ｐＴ７－７，ｐＲＳＥＴ系列重组，转化入大肠杆菌进行亚克隆，ＩＰＴＧ诱导表达。结果显示：阳性亚克隆ｐＤＪｔ．ｐＤＪｒＢ１能在大肠杆菌中高效表达；对其进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可见６８ｋｄ和２３ｋｄ处出现新带，与钩体０１７株外膜同分子量蛋白带位置一致，免疫印迹（特异性抗０１７株外膜抗血清）在６８ｋｄ和２３ｋｄ处分别有印迹；用ｐＤＪｔ亚克隆重组质粒主动免疫豚鼠，可抵抗强毒力株攻击，表现出免疫保护作用。本实验结果提示：（１）ｐＤＪＨ２１．９ｋｂ重组ＤＮＡ片段能以不同质粒为载体，在不同大肠杆菌株中高效表达；（２）该重组ＤＮＡ片段表达产物——６８ｋｄ和２３ｋｄ蛋白，可能是赖型钩体０１７株外膜的保护性抗原。     

钩体017株基因库pDJH2与L.alstoni重组DNA探针同源性及pDJH…

用地高辛标记含完整ＯｍｐＬ１结构基因之Ｌ．ａｌｓｔｏｎｉ２．５ｋｂＥｃｏＲ１重组ＤＮＡ探针与我们构建的赖型钩体０１７株基因库重组质粒ｐＤＪＨ２进行ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交。此赖型０１７株钩体重ＤＮＡ经ＩＰＴＧ诱导后能在大肠菌中表达，以及其表达产物的保护性动物试验结果，在所查国内外文献中尚属首次报道。     

赖型钩体重组质粒pDJH2亚克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

为了探讨ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂ０１７株钩体ＤＮＡ片段可否作为本重疫苗广谱保护性抗原的候选，采用重组ＤＮＡ技术，将ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂＤＮＡ片段分别一ＰＴ７－７，ｐＲＳＥＴ系列重组，转化为大肠杆菌进行亚克隆，ＩＰＴＧ诱导表达，结果显示：阳性亚克隆ｐＤＪｔ，ｐＤＪｒＢ能在大肠杆菌中一致，免疫印迹在６８ｋｄ处分别有印迹，用ｐＤＪｔ亚克隆重组质粒主动免疫豚鼠，可抵抗强和株攻击，表现出免疫保护作用本实验结     

以λgt11作载体构建赖型钩体基因文库及其重组质粒pDL121的克隆和在E.coli表达的研究

为探讨赖型钩体抗原基因特点及其表达产物作为疫苗的可行性，采用问号赖型０１７株钩体经ＨｈａⅠ和ＡｌｕⅠ限制性内切核酸酶部分消化，行ＥｃｏＲⅠ限制酶切位点甲基化，加上ＥｃｏＲⅠ接头与去磷酸化的λｇｔ１１ＤＮＡ－ＥｃｏＲⅠ臂连接，体外包装后转染Ｅ．ｃｏｌｉＹ１０９０，建成含２．１×１０６重组子的问号赖型０１７株钩体基因文库。用抗赖型钩体兔血清从上述基因文库中筛选出一个强阳性克隆，λＤＬ１２，亚克隆入ｐＵＣ１８质粒，获重组质粒，ｐＤＬ１２１。ＥｃｏＲⅠ酶切证实该重组质粒含有１ｋｂ的外源插入片段。ｐＤＬ１２１经ＩＰＴＧ诱导后，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现２３ｋｄ特异条带。免疫印迹表明该蛋白带可被抗赖型钩体兔血清识别。     

应用重组DNA探针检测不同毒力钩端螺旋体

应用质粒载体ｐＵＣ１８构建赖型钩端螺旋体０１７株的基因库。筛选出重组质粒ｐＤＪ６和ｐＤＪ８，插入片段分别是１．９ｋｂ和２．２ｋｂ。地高辛随机引物标记１．９ｋｂ片段制备探针，对５个血清型６株钩体ＤＮＡ进行杂交。结果显示，重组探针与致病钩体ＤＮＡ出现明显杂交信号，与非致病钩体，人白细胞ＤＮＡ及大肠杆菌ＪＭ１０３株ＤＮＡ杂交信号不明显。此特异性重组探针可作为鉴定、识别致病性钩体和进行钩体属、种分类的一种手段。     

血小板生成素突变体融合蛋白表达及纯化研究

目的：用大肠杆菌融合蛋白表达载体ｐＭＡＬ－ｃ２构建人血小板生成素突变体融合蛋白表达质粒ｐＭＡＬ－ＴＯＰＭ，方法：采用基因重组和表达，ＳＤＳ－聚丙烯酰胺胶电泳和蛋白纯化技术。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明，ＩＰＴＧ诱导５ｈ后大肠杆菌ＪＭ１０９表达到最高水平，约占大肠杆菌菌体总体蛋白的３６．６％，除了大肠杆菌ＲＲ１不表达以外，大肠杆菌ＤＨ５αＨ１０１均有较高水平的表达，表达产物血小板生成素突变体融合蛋     

以λgt11作载体构建赖型钩体基因文库及其重组质粒pDL121的…

为探讨赖型钩体抗原基因特点及其表达产物作为疫苗的可行性，采用问号赖型０１７株钩体经Ｈｈａ Ｉ和Ａｌｕ Ｉ限制性内切核酸酶部分消化，行ＥｃｏＲ Ｉ限制酶切位点甲基化，加上ＥｃｏＲＩ接头与去磷酸化的λｇｔ１１ＤＮＡ－ＥｃｏＲ１臂连接，体外包装后转染Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０，建成含２．１×１０＾４重组子的问号赖型０１７株钩体基因文库。用抗赖型钩体兔血清从上述基因文库中筛选出中阳性克隆，λＤＬ１２，亚克隆     

结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B基因的克隆及表达

目的 对分支杆菌的一种分泌蛋白Ａｇ８５Ｂ的基因进行克隆、表达,为结核病进行诊断打下基础。方法 以结核杆菌Ｈ３７Ｒｖ株基因组ＤＮＡ为模板,以ＰＣＲ法对基因ａｇ８５ｂ进行扩增,产物与载体质粒ｐＥＴ２４ｂ构建表达Ａｇ８５Ｂ的重组质粒,将此重组质粒先转化入大肠杆菌ＤＨ５ａ内,抽提质粒,酶切检验,再转化入表达宿主大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）菌株内,对转化菌株以ＩＰＴＧ进行诱导后,破菌,离心,上清进行ＳＤＳ－     

卡介苗基因组的克隆

以质粒ｐＧＣ１９为载体克隆了卡介苗（即卡介菌，ＢＣＧ）ＤＮＡ。Ｓａｕ３Ａ１部分酶解ＢＣＧ ＤＮＡ，通过琼脂糖电泳分离２￣９ｋｂＤＮＡ片段。ＢａｍＨ１酶切质粒ｐＵＣ１９，碱性磷酸酶去磷酸化，２￣９ｋｂＤＮＡ片段与ｐＵＣ１９载体用Ｔ４连接酶连接转化大肠杆菌ＨＢ１０１，在含氨苄青霉素（Ａｍｐ）、５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷的ＬＢ平板上获得Ａｍｐ白色转化子。随机挑选１２个转化子快速提取重组子     

大鼠肾皮质受体相关蛋白克隆基因重组表达质粒的构建及分子生 …

运用ＤＮＡ重组技术，将用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆的大鼠肾皮质受体相关蛋白３１９个氨基酸的核苷酸序列导入载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ和表达载体ｐＧＥＸ中，分别构建了重组质粒ｐＢＳＫ９ＲＡＰ和ｐＧＥＸ－９ＲＨ７，转化入大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ和ＤＨ５α中，经ＩＰＴＧ，ｘ＝ｇａｌ抗生素筛选阳性克隆，扩增后，重组质粒用限制性内切酶图谱分析及ＤＮＡ测序分析，证明插入了方向正确，表达阅读框架正确。     

钩端螺旋体重组DNA探针对致病性黄疸出血群钩体DNA的杂交识别

作者从建立的黄疸出血群钩端螺旋体(下称钩体)DNA基因库中筛选出重组DNA克隆PLIps01(15kb)和PLIEc34(4kb)制备成~(32)P放射性探针。以该二探针对致病性黄疸出血群所属血清型的13个菌株钩体DNA进行Southern印迹分析,结果表明,该二DNA探什对黄疸出血群各株钩体DNA具有强烈的特异性结合,能识别出简洁的DNA带型,并能区分不同血清型以至菌株的DNA带型差别。作者认为,钩体DNA重组探什结合Southern印迹分析是一种灵敏而特异的检测分析方法,可作为诊断、鉴定和分析钩体的工具。     

赖型钩端螺旋体重组DNApCX7的特异性鉴定和限制性内切酶谱分析

本实验将赖型钩端螺旋体（简称钩体）ＤＮＡ基因库的克隆ｐＣＸ７制备成￣（３２）Ｐ－重组ＤＮＡ探针，对８个不同血清群的１７株问号状钩体、双曲钩体ＰａｔｏｃⅠ株以及细螺旋体３０５５株ＤＮＡ进行打点杂交；同时用１５种ＤＮＡ片断进行限制性内切酶谱分析。结果表明，该重组ＤＮＡ具有问号状钩体种（Ｓｐｅｃｉｅｓ）特异性，但与不同问号状钩体之间的同源性程度有差别；限制性内切酶谱分析发现ｐＣＸ７重组ＤＮＡ片段长约１．７ｋｂ，具有１个Ｂｇ１Ⅱ识别位点和３个ＢｓｔＢ１识别位点。     

微卫星DNA监控近交系小鼠的重组近交系培育研究

目的采用微卫星DNA技术监控近交系小鼠仔代基因状况，有选择性地进行交配繁殖，以达到快速培育新的重组近交系动物。方法利用PCR扩增微卫星DNA技术对近交系C57和BALB／c小鼠所交配繁殖的仔代鼠进行了微卫星DNA多态性分析，与母代C57小鼠相似系数高的与中的进行定向交配繁殖。结果F2代小鼠多态性位点为14个，纯合基因率为53．3％；到F10代时基因纯合位点达29个，纯合基因位点率为96．7％。每代相似系数具有不断上升的趋势，上升率为3％一10％。采用皮肤移植方法验证了F10代小鼠为近交系。结论建立了一种新的快速培育重组近交系动物的方法，打破了传统近交系的培育方法，为今后研究分析动物间的血缘关系和遗传距离奠定了基础。     

重组DNA技术及其在医学领域中的应用

重组DNA技术属于遗传工程分子水平的遗传操作,是一种按照人的意志定向改变生物遗传性状的技术。广义的遗传工程包括细胞水平的遗传操作(称为细胞工程)和分子水平的遗传操作(称为重组DNA技术)。狭义的遗传工程就是重组DNA技术。重组DNA技术,是在体外重新组合DNA分子(脱氧核糖核酸),并使其在适当的细胞中增殖的遗传操作,这种操作可将特定的基因组合到载体上,并使其在受体细胞中增殖和表达。因此,它不受亲缘关系限制,为分子遗传学和育种学以及医学遗传学研究开辟了崭新途径。1 重组DNA技术基本过程1.1 用人工方法取得或合成目的基因 基因是含特定遗传信息的核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位,基因可被分离出来。例如,从大肠杆菌中可将乳精发酵基因分离出来。先利用两种有差异的亲缘关系相近的温和噬菌体分别感染两类大肠杆菌,噬菌体的DNA可与大肠杆菌的染色体发生整合。整合位置恰好都在含乳糖发酵基因DNA片段,但方向相反,整合到大肠杆菌中的噬菌体DNA得到复制,用紫外线刺激大肠杆菌,使带乳糖发酵基因的噬菌体,DNA可以从大肠杆菌染色体中脱出,形成带乳糖发酵基因的噬菌体。两种亲缘关系相近的温和噬菌体,通过加热使其DNA片段双链分开,形成单链DNA。进一步将两种噬菌体DNA单链混合在     

EBV—LMP1反义基因真核表达载体的构建及序列鉴定

目的：构建ＥＢ病毒ＬＰＭ１反义基因的真核表达载体。方法：通过ＰＣＲ方法,扩增ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因的第一外显子片段,使之反向克隆到质粒ｐｃＤＮＡ３．１的多克隆位点中。经限制性酶切、ＰＣＲ扩增和测序鉴定重组载体。结果：酶切产物和ＰＣＲ产物的凝胶电泳显示４００ｂｐ左右的目的基因片段,测序结果显示与已知ＬＭＰ１基因序列一致。结论成功构建了ＬＭＰ１反义基因的真核表达载体。     

恶性疟疾重组质粒pPF14DNA探针的制备

采用基因克隆技术，将恶性疟原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ｐＰＦ１４质粒转化大肠杆菌ＨＢ１０１，经扩增后碱裂解法提取质粒ＤＮＡ，核酸内切酶酶切图谱分析鉴定后，低熔点胶法回收而获得高纯度和高回收率的插入片段（ｐＰＦ１４ＤＮＡ），经３２Ｐ标记后具较高敏感性与特异性，该探针制备方法具简便、稳定、省时的优点。本文对各制备程序进行了探讨。     

Recombinant DNA produced somatropin in the treatment of prepubertal growth hormone deficient children.

The safety and efficacy of recombinant DNA produced human growth hormone in the treatment of growth failure in prepubertal children with idiopathic or organic deficiency of pituitary GH has been assessed. Five patients entered this clinical trial. They had never been treated with hGH, anabolic steroids or any medicine that affected GH and all of them were healthy without any chronic disease; except patient 1, who took a surgical operation for cerebellar astrocytoma at the age of 3. Each patient was treated with subcutaneous injection of recombinant somatropin (SAIZEN) at a dosage of 0.2 IU/Kg +/- 10% three times per week in the evening for 1 year. Typical catch up growth was observed. The height increased by between 6.3 and 15.1 cm and their mean growth velocity of 3.7 cm/yr prior to therapy increased to 11.1 cm/yr during one year of treatment. The annual change in bone age during the treatment with SAIZEN was 2.0 +/- 0.6 years in four patients, except patient 2 who showed different bone age (right hand 3.5 years, left hand 6.0 years). Anti-hGH antibodies were observed in patient 1, but the binding capacity was low (1:10), and no clinical symptoms or growth attenuation occurred. No side effects or laboratory abnormalities were noted throughout the clinical trial. In conclusion, recombinant somatropin has a growth promoting effect and low immunogenicity, and it is shown to be safe and effective during the first year of therapy in children with GH deficiency.