脂质体RNA负载慢性粒细胞白血病来源树突状细胞的性能比较

目的研究人慢性粒细胞白血病(CML)总RNA经过脂质体负载后体外转染自体慢性粒细胞白血病 树突状细胞（CML-DC）,并诱导特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）免疫反应。方法CML患者骨髓单个核细胞（CML-BMMNC）在rhIL-4、rhGM-CSF、rhTNF-α细胞因子联合培养诱导出CML-DC。采用Trizol法提取CML-BMMNC的总RNA;反复冻融法制备CML BMMNC抗原。于CML-DC培养第5天,加入脂质体转染的CML总RNA、CML总RNA、CML肿瘤冻融抗原及不加抗原。倒置显微镜观察DC形态学变化;流式细胞仪器检测免疫表型变化;染色体G显带技术检测其染色体核型及逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Bcr-abl融合基因的表达;用MTT法检测CTL作用。结果CML BMMNC诱导成CML-DC, CD_1α、CD₈₃表型表达较诱导前明显上调,形态学有典型的DC形态,且均存在Bcr-abl基因带和Ph₁染色体,提示CML-DC为白血病源性。总RNA经脂质体转染CML-DC、CML肿瘤冻融抗原负载CML-DC、总RNA不经脂质体转染CML-DC、未负载抗原CML-DC分别致敏的CTL及IL-2培养的T淋巴细胞在效：靶比为20∶1时的杀伤效率依次降低。结论CML BMMNC来源的 DC既具有CML白血病源性,又具有DC细胞的特性,能诱导特异性CTL杀伤作用;总RNA经脂质体转染的CML-DC诱导的CTL杀伤性对CML细胞的杀伤作用最强。     

流感疫苗对慢性粒细胞白血病源性树突状细胞功能影响的研究

 目的 探讨流感疫苗对白血病源性树突状细胞（DC）功能的影响。方法 分离慢性粒细胞白血病（CML）患者骨髓单个核细胞,加入GM-CSF和IL-4诱导培养7 d,将所得细胞分为4组：完整失活流感疫苗（WIV）组;裂解流感疫苗（SIV）组;TNF-α组;对照组,用不同培养方法再培育24 h后,流式细胞仪分析DC免疫表型,ELISA法检测上清液中IL-12浓度。结果 CML源性DC细胞表面分子表达、上清液中IL-12浓度在WIV及SIV组较TNF-α和对照组显著增高,差异有统计学意义（P＜0.05）;其中WIV组高于SIV组（P＜0.05）,而TNF-α组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 流感疫苗具有刺激CML源DC成熟的功能。     

DC与CIK共培养后对白血病细胞杀伤活性的研究

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与同源树突状细胞(DC)共培养后CIK细胞的增殖活性、表型的变化,及其对K562、HL-60白血病细胞细胞毒作用的影响。方法采集健康供者的外周血单个核细胞(MNC),置于37℃,5%CO2培养箱培养2 h,收集非贴壁细胞用于诱导培养CIK细胞,贴壁细胞诱导分化出成熟DC,将成熟DC和CIK细胞按1 5的比例混合培养3天,用MTT法检测DC-CIK共培养细胞杀伤K562和HL-60白血病细胞株的活性。结果DC-CIK共培养后增殖速度明显快于单纯CIK细胞组(P<0.05);培养第14天,CIK中CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞的比率分别为58.6%±7.3和26.5%±6.2,DC-CIK的CD3+CD8+、CD3+CD56+的比率分别为72.5%±4.2和38.4%±6.1,表达差异显著(P<0.05);在2.5∶1~20∶1的效靶比范围内,DC-CIK对K562、HL-60细胞的杀伤活性较单纯CIK细胞组的杀伤活性要高(P<0.05)。结论DC与CIK共培养细胞是增殖活性和细胞毒活性均高于CIK细胞的免疫活性细胞。     

进展期胃癌术后自身CIK细胞和树突状细胞联合治疗的临床观察

目的：评估进展期胃癌术后用CIK细胞联合树突状细胞（DC）治疗的疗效.方法：将110例进展期胃癌术后患者随机分为两组.1）细胞免疫治疗组52例：常规诱导培养患者自身CIK和DC，再将培养的自身CIK细胞回输，DC给予患者腹股沟、腋下浅表淋巴结内和淋巴结附近皮下注射以及静脉回输 患者1个疗程接受CIK细胞总数在1.1～8.0×10^10之间，DC总数在3～7×10^7之间.每周回输CIK细胞2次，8～12次为1个疗程，3～6个月后行第2次治疗 每例患者每个疗程接受3～5次成熟DC注射.2）化疗组58例：全部采用CF＋5-FU＋ADM＋DDP方案，3例治疗2个周期，6例治疗3个周期，49例治疗4个周期以上.结果：细胞免疫治疗组（Ⅰ b、Ⅱ和Ⅲa）中，3年生存率为86.8%（33/38），5年生存率为78.9%（30/38），化疗组分别为65.1%（28/43）、53.5%（23/43），细胞免疫治疗组生存率明显高于化疗组.细胞免疫治疗后患者食欲增加、疼痛减轻、睡眠改善、体重增加较化疗组明显.CEA增高患者治疗后恢复正常高于化疗组.结论：进展期胃癌术后的自身CIK细胞和树突状细胞（DC）联合治疗组（Ⅰ b、Ⅱ和Ⅲa）3、5年生存率明显高于化疗组，细胞免疫治疗能改善患者细胞免疫功能和临床体征，无不良反应，对进展期胃癌术后防止复发是一种安全有效的治疗方法.[第一段]     

CIK细胞抗白血病的研究进展

细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer,CIK)是由多种细胞因子诱导而成的对多种肿瘤具有杀伤活性的细胞毒性T细胞,且是一种非主要组织相溶性复合体(MHC)限制的免疫效应细胞,同时表达CD3和CD56,其增殖能力强、杀瘤活性高、副作用小,是目前白血病细胞免疫疗法中最具前景的细胞之一。文章综述了CIK细胞的特点、抗白血病机制和科研及临床的应用现状。     

DC-CIK对急性髓细胞白血病干细胞的杀伤作用

目的:研究树突状细胞(dendritic cell,DC)联合同源细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK)对急性髓细胞白血病细胞株KG-1a中白血病干细胞(leukemic stem cell,LSC)的体外杀伤和诱导凋亡作用。方法:分离健康人外周血单个核细胞,贴壁细胞用GM-CSF和IL-4诱导培养DC,悬浮细胞用IL-2、IL-1、IFN-γ和CD3 mAb诱导培养CIK。将KG-1a细胞冻融物作为抗原负载DC(即Ag-DC),与CIK共培养作为实验组(Ag-DC-CIK),无抗原负载的DC与CIK共培养作为对照组(DC-CIK),单独CIK作为空白对照组,与KG-1a共育后流式细胞术检测各组细胞中CD34+CD38-CD123+白血病干细胞的比例。DC-CIK与KG-1a细胞共培养,流式细胞术检测各组细胞中KG-1a细胞与CD34+CD38-CD123+细胞的凋亡率。结果:外周血单个核细胞成功诱导DC。CIK组、DC-CIK组及Ag-DC-CIK组中CD3+CD56+细胞比例为(17.36±4.44)%、(28.22±3.66)%和(36.16±5.88)%,依次升高(P<0.05)。与对照组相比,Ag-DC-CIK组与DC-CIK组细胞中CD34+CD38-CD123+细胞比例显著降低[(8.78±0.62)%vs(3.95±0.53)%、(3.03±0.62)%,P<0.01〗。DC-CIK可诱导KG-1a细胞凋亡,凋亡率由(2.34±0.74)%上升至(12.27±1.01)%,但对其中CD34+CD38-CD123+细胞无明显的诱导凋亡作用。结论:DC联合CIK能杀伤急性髓细胞白血病干细胞,但无明显的诱导凋亡作用。     

慢性粒细胞性白血病瘤苗的研究

慢性粒细胞性白血病（GML)是一种致死性的骨髓增殖异常性疾病,其特征是存在特异性染色体异位,形成BCR-ABL融合基因,编码异常的融合蛋白P210^BCR-ABL。自体骨髓移植和干扰素治疗仅能延长CML患的生存期,迄今治愈CML的最有效的方法是异基因造血干细胞移植(Allo-SCT)。然而由于受干细胞来源及患年龄等因素限制,仅有少部分患能进行此治疗。目前,人们越来越重视免疫治疗、特别是T细胞介导的特异性免疫效应在CML治疗中的作用。异基因T细胞对Allo-SCT后CML复发能产生强力的保护作用;给Allo-SCT后复发的CML患输注同一供的淋巴细胞,可诱导疾病的再次缓解,这是细胞免疫介导的移植物抗白血病(GVL)作用的最直接证据。诱导和提高特异性T细胞免疫反应是根治CML的方向之一。     

来源于未缓解白血病患者的DC-CIK细胞对白血病细胞的杀伤活性

目的：体外诱导培养缓解期及未缓解期急性白血病患者来源的树突状细胞（dendritic cell, DC)联合细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer, CIK)细胞,比较两者的增殖能力、免疫表型及对白血病细胞的杀伤活性。方法: 提取2013年4月25日至2014年1月17日河北医科大学第二医院血液科收治的复发难治未缓解期白血病患者（7例）和缓解期患者（7例）的外周血单个核细胞,分别按常规方法诱导产生DC-CIK细胞,在培养过程中检测细胞增殖倍数,流式细胞术检测CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞比例,细胞涂片法和流式细胞术检测培养前后CD34+白血病细胞比例,CCK-8法检测两组DC-CIK细胞对K562细胞及患者单个核细胞的杀伤活性。结果: 缓解组和未缓解组来源的DC-CIK细胞均以相似的速度快速增殖,CD3+CD8+和CD3+CD56+细胞比例均随培养时间延长显著升高（ P <0.05）,但两组间差异没有统计学意义（ P >0.05）。培养第15天时,非缓解组DC-CIK细胞涂片检测未见CD34+原始白血病细胞,流式细胞术检测显示CD34+细胞比例较培养前显著降低\[（0.1±0.05）% vs (8.3±3.1)%, P <0.05\]。效靶比在5 ∶1~20 ∶1范围内时,缓解组与未缓解组DC-CIK细胞对K562细胞的杀伤率差异没有统计学意义（ P >0.05）,但未缓解组DC-CIK对患者单个核细胞的杀伤率显著高于缓解组（ P <0.05）,并且显著高于未缓解组对K562细胞的杀伤率（ P <0.05）。结论:未缓解期白血病患者来源的DC-CIK细胞在增殖活性、CD3+CD8+和CD3+CD56+表达水平和对K562细胞的非特异性杀伤活性方面与缓解期患者来源的DC-CIK细胞均相似,但对患者单个核细胞的杀伤具有更强的特异性。     

DC-CIK细胞清除微小残留白血病的临床研究

目的： 观察异体树突状细胞（dendritic cell,DC）与细胞因子诱导的杀伤（cytokine-induced killer,CIK）细胞联合化疗清除微小残留白血病（minimal residual leukemia,MRL）的临床效果和安全性。 方法： 选择48例2009年1月至2011年6月石家庄平安医院收治的达到形态学完全缓解（complete remission,CR）但未达到分子学完全缓解（molecular CR,CRm）的急性白血病患者或MRL阳性白血病患者,依患者意愿分为联合组和化疗组,各24例,两组的一般资料和疾病程度相当;联合组应用DC-CIK细胞治疗和巩固化疗,化疗组仅应用巩固化疗。采集健康供者（患者的父母或子女）单个核细胞,制备DC-CIK细胞,每位患者输注4~6次,每次间隔15 d。Real-time PCR检测患者白血病特异基因或相关基因表达,流式细胞术检测患者MRL免疫表型组合、外周血淋巴细胞亚群的变化,记录治疗的不良反应发生情况。 结果： 随访至2012年6月。与化疗组相比,联合组CRm率显著提高\[45.8% (11/24) vs 8.3% (2/24); χ2=8.55, P<0.01\], 四色流式细胞微小残留白血病免疫表型组合（four-color combination flow cytometric immunophenotype of minimal residual leukemia,CFIM）转阴率显著提高（66.7% vs 25.0%; χ2=839,P<0.01）,MRL清除显著提高（66.7% vs 250%; χ2=8.39,P<0.01）,3年以上持续完全缓解（continued complete remission,CCR）率也明显更高（79.2% vs 45.8%; χ2=569,P<0.05）。联合组治疗后患者淋巴细胞CD4+/CD8+比值较治疗前显著上升（1.3±0.4 vs 0.8±0.4,P<0.05）。DC-CIK细胞输注未见严重不良反应。 结论： DC-CIK细胞联合化疗能够抑制白血病相关基因,促进CFIM转阴、提高MRL清除率、改善患者免疫功能、延长缓解期,DC-CIK输注无严重不良反应。     

慢性髓细胞白血病细胞诱导分化成为树突状细胞的实验研究

目的:将慢性髓性白血病患者的白血病细胞体外诱导分化成为树突状细胞。方法:从8例慢性髓性白血病患者的骨髓或外周血中获取非贴壁细胞,利用细胞因子(rhGM蛳CSF、rhIL蛳4、rhTNF蛳α)联合培养,每3 d补充新的细胞因子,其中rhTNF蛳α为第9天添加,第12天收获细胞。培养前后分别用光镜、倒置显微镜、电镜观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞表面标志,MTT法检测收获细胞激发混合淋巴细胞反应的能力。结果:8例CML标本分化成为具有典型树突状形态的细胞,流式细胞仪检测白血病细胞的HLA蛳DR由(16.16±10.70)%增至(39.94±20.79)%,CD86由(3.53±1.75)%增至(8.83±6.11)%,CD1a由(8.78±4.90)%增至(19.17±8.51)%,差异有统计学意义(P <0.01)。在混合淋巴细胞反应中具有强烈激发同种T淋巴细胞增生的能力。结论:慢性髓性白血病细胞可以诱导分化成为具有DC形态、表型、功能的细胞。     

脐血、健康人及慢粒患者外周血来源的DC介导的抗白血病免疫效应研究

目的：观察脐血、健康人及慢性柱细胞性白血病(CML)患者外周血3种不同来源的树突状细胞(DC)及其抗白血病效应。方法：分离3种来源的单个核细胞(MNC)并在细胞因子(GM-CSF IL-4 TNF-α)作用下诱导培养DC。观察DC形态，流式细胞技术检测DC免疫表型(CD1α、CD80、CD83、HLA-DR)；将所得DC经CML细胞可溶性抗原负载后和其同源T细胞混合诱导抗原特异性CTL，MTT法检测其杀伤活性。结果：3种来源MNC在细胞因子作用下均可获得形态典型的DC，且高表达CD1α、CD80、CD83、HLA-DR，经抗原负载后的DC诱导的CTL对CML靶细胞的杀伤活性也较强。结论：脐血、健康人及CML患者外周血均为理想的DC来源；有较好的诱导CTL杀伤白血病细胞效应；应用DC瘤苗免疫治疗白血病必将成为一种崭新的肿瘤免疫治疗方法，有十分诱人的发展前景。     

树突状细胞对LPAK抗人肝癌细胞的促进作用

目的观察人血树突状细胞（DC）联合LPAK细胞（L）体外抗人肝癌BEL-7402细胞（B）的杀伤效应,并对死亡细胞进行形态学分析.材料和方法LD组为DC＋L＋B,L组为L＋B,二组均采用L：B为5：1和10：1两种放靶比,应用TUNEL法及杀伤细胞检测技术,比较LD和L组的抗肿瘤效应。结果人血DC联合LPAK细胞与单用LPAK细胞的抗肿瘤活性比较,LD组＞L组（P＜0.01）,但二者均能诱导BEL-7402细胞调亡;调亡的肿瘤细胞是TUNEL阳性,在LD组较L组明显增多。结论DC能明显增强LPAK细胞对人肝癌细胞的杀伤活性,但不改变LPAK细胞诱导肿瘤细胞调亡的死亡模式。     

格列卫治疗20例慢性粒细胞白血病临床观察

目的：评价格列卫治疗慢性粒细胞白血病(CML)的效果和不良副作用。方法：CML慢性期(CP)患者口服格列卫400mg/d。CML加速期、急变期(BC)患者口服格列卫400mg-600mg/d。结果：11例CML-CP患者均取得血液学完全缓解(HCR)。9例CML-AP和CML-BC患者4例取得HCR(37％)。7例CML-CP患者在3个月～6个月内4例取得遗传学完全缓解(56％)。CML—CP患者Ⅲ级白细胞(WBC)减少1例,血小板(BPC)减少2例。CML-AP和CML-BC患者,4例发生Ⅲ级-Ⅳ级WBC减少和BPC减少。而非血液学不良副作用,无Ⅲ级或Ⅳ级以上的毒副作用。结论：格列卫治疗CML-CP具有较高的HCR和细胞遗传学反应,CML-BC患者亦可取得较好的血液学反应。格列卫不良副作用发生率低．尤其CML-CP患者为安全。而CML-AP和CML-BC患者治疗期间,需加强支持治疗。     

肝癌患者外周血树突状细胞的体外扩增、鉴定及内吞能力观察

目的　从肝癌患者外周血培养扩增树突状细胞,观察其形态、表型、内吞及递呈抗原能力,为树突状细胞在肝癌生物治疗中的应用奠定基础。方法　从肝癌患者外周血中分离单个核细胞,在 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ、 Ｉ Ｌ４ 的诱导下培养扩增树突状细胞。光学显微镜下观察其体外培养过程中的形态特征及变化,电镜观察其超微结构, Ｆ Ａ Ｃ Ｓ观察其表型特征, Ｍ Ｌ Ｒ检测其抗原递呈能力, Ｈ Ｒ Ｐ内吞实验检测其群体内吞能力。结果　肝癌患者外周血树突状细胞具典型的形态及表型特征,较巨噬细胞更强的激发同种混合淋巴细胞反应的能力。其群体的内吞能力约在培养第 ５ 天达高峰,之后有明显下降。结论　从肝癌患者外周血中可获取较大量的、高纯度的、具较强抗原递呈能力的树突状细胞,在其具有活跃的内吞能力时,以合适的肿瘤抗原致敏可望成为肝癌生物治疗的崭新手段。     

干扰素α-2b联合低剂量阿糖胞苷治疗慢性髓细胞白血病的临床研究

目的:探讨慢性髓细胞白血病(CML)患者使用干扰素α蛳2b(IFNα蛳2b)联合低剂量阿糖胞苷(LD Ara蛳C)治疗,其血液学和细胞遗传学的缓解率,寻找治疗CML的新途径。方法:采用IFNα蛳2b(300万U/d)+Ara蛳C(20mg·m2·d-1,每月用10 d)治疗CML慢性期(CP)患者30例,检测治疗后血液学缓解率和细胞遗传学缓解率,并与IFNα蛳2b+羟基脲(Hu)治疗组和单纯Hu治疗组作对照。结果:Hu+IFNα蛳2b+LD Ara蛳C治疗组治疗6个月的CHR率、总CHR率和Ph染色体阳性细胞下降病例百分数均显著高于IFNα蛳2b+Hu治疗组(P=0.004、P<0.005和P=0.009)和单纯Hu治疗组(P=0.006、P<0.005和P<0.005),CML急变发生率低于单纯Hu治疗组(P<0.005),而且发生急变的时间晚,5 a生存率明显高于IFNα蛳2b+Hu治疗组(P=0.014)和单纯Hu治疗组(P<0.005)。结论:CML(CP)患者采用IFNα蛳2b+LD Ara蛳C治疗可显著提高CML患者的CHR率,提高CML患者的细胞遗传学缓解率,延长CML患者的生存期。     

树突状细胞诱导的细胞毒T淋巴细胞抑制移植瘤细胞增殖

目的　研究树突状细胞（ Ｄ Ｃ）体外诱导的细胞免疫能否抑制裸鼠移植瘤肿瘤细胞增殖。方法　联合应用粒／巨细胞集落刺激因子（ Ｇ Ｍ  Ｃ Ｓ Ｆ）及白介素４（ Ｉ Ｌ４）直接从肝癌患者外周血中培养出 Ｄ Ｃ;以源于人肝癌细胞系 Ｈｅｐ Ｇ２ 细胞的肿瘤抗原粗提物刺激 Ｄ Ｃ; Ｄ Ｃ 激活同源的 Ｔ 淋巴细胞产生细胞 毒性 Ｔ 淋 巴细胞 （ Ｃ Ｔ Ｌ）; 建立 人肝癌 细胞 系 Ｈｅｐ Ｇ２ 裸鼠移植瘤模型; Ｃ Ｔ Ｌ 治疗人肝癌细胞系 Ｈｅｐ Ｇ２ 裸鼠移植瘤;检测移植瘤标本肿瘤细胞 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 表达水平。结果　 Ｄ Ｃ诱导的 Ｃ Ｔ Ｌ抑制 Ｈｅｐ Ｇ２ 裸鼠移植瘤细胞增殖从而抑制移植瘤生长。结论　经肿瘤抗原激活的 Ｄ Ｃ 作为一新概念上的抗肿瘤疫苗有可能在肿瘤的治疗中发挥重要作用。     

急性白血病细胞中增殖细胞核抗原的表达

目的 探讨急性白血病细胞的增殖活性及其在白血病预后判断上的作用。方法 运用单克隆抗体免疫细胞化学染色技术检测了急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）和急性淋巴细胞白血病（ＡＮＬＬ）中增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）的表达。结果 ＰＣＮＡ在ＡＬＬ和ＡＮＬＬ中表达无显著性差异（Ｐ〉０．０５）,在ＡＬＬ和ＡＮＬＬ中ＰＣＮＡ表达阳性细胞百分率分别为２８％￣９５％和２６％￣９６％。急性白血病中ＰＣＮＡ阳性细胞百分率与患者骨     

筑巢式RT-PCR检测慢性粒细胞白血病残留细胞

目的：检测慢性粒细胞白血病残留细胞,方法：应用RT－PCR方法对20例（其中6例为异基因骨髓移植术后）慢性粒细胞白血病患者进行右骨髓的bcr/abl mRNA检测,结果：20例初发时Ph染色体阴性1例,阳性19例,20例均检出bcr/abl基因扩增产物,全部病例进行连续性监测发现,6例异基因骨髓移植患者5例最终Ph染色体及bcr/abl基因转阴,1例持续阳性并检出两类（168bp 或93bp)bcr/abl基因,结论：RT－PCR是当前检测慢性粒细胞白血病残留细胞比较可靠的方法。     

促红细胞生成素、粒细胞及粒-巨噬细胞集落刺激因子对慢性粒细胞白血病急变细胞生长的影响

为了解外源性细胞因子对慢性粒细胞白血病急变细胞增殖的影响，观察了促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子和粒－巨噬细胞集落刺激因子在体外对慢粒急变细胞生长的影响。实验结果显示慢粒急变细胞的增殖不受这些外源性细胞生长因子的影响，提示急变期细胞的生长特性发生了改变，同时这一结果也对细胞生长因子的临床应用有一定的意义