鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白免疫保护作用评价

  目的  评估鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白激活固有免疫信号通路的能力,并评价其免疫保护效果。  方法  利用生物信息学分析nfa47650序列特征,Blast比对其在鼻疽诺卡菌中的保守性;用纯化后的NFA47650蛋白刺激RAW264.7细胞,利用Western Blot免疫印迹检测MAPK信号通路激活水平、利用ELISA检测细胞上清中细胞因子诱导水平;将C57BL/6小鼠分成两组,分别免疫PBS及NFA47650蛋白3次,检测血清效价后感染鼻疽诺卡菌,并检测感染24 h后小鼠体温、体重变化、血清IgG水平、肺泡灌洗液中蛋白水平、LDH水平以及肺部菌载量、肺上清细胞因子等指标。  结果  NFA47650蛋白能够刺激RAW264.7细胞上调ERK、JNK、P38磷酸化水平,并诱导IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-γ等多种细胞因子浓度升高。 另外,该蛋白免疫小鼠后可以产生高效价的抗血清,使肺部感染减轻,肺部菌载量减少。   结论  NFA47650蛋白作为一种免疫显性蛋白,能在鼻疽诺卡菌感染宿主过程中刺激机体产生抗体,诱导小鼠产生免疫应答,具有免疫保护作用。     

鼻疽诺卡菌菌体蛋白的免疫蛋白质组学研究

目的 通过鉴别鼻疽诺卡菌菌体蛋白中具有免疫原性的蛋白,为筛选鼻疽诺卡菌特异诊断抗原提供线索。方法 提取鼻疽诺卡菌菌体蛋白进行双向电泳,结合免疫印迹法筛选与抗鼻疽诺卡菌兔血清发生免疫反应的蛋白点。结果 在鼻疽诺卡菌菌体蛋白的免疫杂交膜上,共发现9个具有抗原活性的蛋白,其中8个可在考马斯蓝染色胶上找到匹配点,通过介质辅助激光解吸电离飞行时间质谱成功鉴定8个蛋白,全部定位于胞内。结论 本研究成功建立鼻疽诺卡菌免疫蛋白质组学方法,在鼻疽诺卡菌菌体蛋白中发现新的具有免疫原性的蛋白,可作为鼻疽诺卡菌特异性诊断候选抗原,用于诊断试剂的研究。     

鼻疽诺卡菌Nfa34810蛋白的抗原表位筛选与鉴定

目的制备鼻疽诺卡菌IFM10152的Nfa34810蛋白的单克隆抗体并进行B细胞抗原表位的筛选与鉴定。方法首先将Nfa34810蛋白截成相互重叠20个氨基酸的P1和P2,使用重组Nfa34810蛋白兔多抗血清与鼻疽诺卡菌IFM10152的鼠多抗血清,通过Western Blot方法检测P1和P2,初步定位抗原表位,对初步确定表位所在片段的P2进行纯化,并使用纯化的P2和Nfa34810蛋白分别免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体。 采用Western Blot方法鉴定获得的单克隆抗体,应用肽扫描法进一步用单克隆抗体对逐步截短表达的短肽进行筛选,从而确定Nfa34810蛋白的B细胞抗原表位。结果成功制备了5株针对Nfa34810完整蛋白和4株针对P2的单克隆抗体,抗体能与P2和重组Nfa34810蛋白发生特异性抗原抗体反应。 通过肽扫描法成功筛选到1个抗原表位和2个抗原表位区域。结论本研究成功制备了Nfa34810蛋白的单克隆抗体,并对抗原表位进行定位,为开展鼻疽诺卡菌病原学检测、流行病学研究等奠定基础。     

两株鼻疽诺卡菌临床分离株的鉴定

目的应用基因测序方法对2株疑似非结核分枝杆菌的菌株进行初步菌种鉴定,指导临床用药治疗.方法将2株临床分离菌株1520、4108分别接种于罗氏培养基,观察其菌落生长状况;取生长对数期菌落,抽提菌株DNA;PCR扩增16S rDNA基因序列,对其PCR产物进行测序和NCBI网站Blast同源性比对,以进行菌株的初步鉴定.结果编号为1520、4108两株菌株,在罗氏培养基上生长迅速,均可见淡黄色粗颗粒样小菌落,疑似非结核分枝杆菌;以PCR扩增两株菌的16S rDNA基因序列,结果与鼻疽诺卡菌(Nocardia farcinica)同源性极高,比例均达到99%.结论从肺科急诊患者体内分离到的菌株1520、4108为鼻疽诺卡菌,而不是非结核分枝杆菌,为临床在治疗方案上提供了有力的证据.同时, DNA测序分析能够快速、简便、准确地鉴定到菌种,为实验室疑难菌型鉴定提供了技术保障.     

鼻疽诺卡菌感染小鼠足垫后组织病理变化以及细胞因子分泌情况的初步研究

目的 了解鼻疽诺卡菌感染动物模型小鼠足垫后不同时间的组织病理进展变化以及细胞因子分泌情况,为鼻疽诺卡菌致病机制研究提供依据。方法 应用对数生长期的鼻疽诺卡菌注射于小鼠足垫,建立感染模型。将感染1、3、7、14 d后小鼠分别脱臼处死,用手术刀片切取感染小鼠的足垫,制备切片,应用HE染色观察组织不同时间的病理变化,通过免疫组化研究感染过程中IL-6、IL-12、IFN-、TNF表达分泌情况。结果 通过HE染色观察到感染后第1天中性粒细胞浸润,炎症形成;感染后第3天中性粒细胞脓肿形成,进入急性感染时期;感染后第7天肌肉组织间大量肌纤维母细胞及血管内皮细胞增生,感染转入慢性感染时期;感染后第14天肌肉组织间大量肌纤维母细胞及血管内皮细胞增生,见局灶小脓肿,周围见片状增生的泡沫样巨噬细胞,进入感染修复期。组织免疫组化结果显示,在炎症形成时期,组织中的IL-6和TNF表达水平高于对照组,差异有统计学意义（P0.05）;在急性感染期,组织中仅可见TNF表达水平高于对照组,差异有统计学意义（P0.05）;在慢性感染期,组织中IL-6、IL-12、IFN-和TNF表达量均高于对照组,差异有统计学意义（P0.05）;在感染修复期,组织中的IL-6、IFN-和TNF表达水平高于对照组,差异有统计学意义（P0.05）。结论 鼻疽诺卡菌感染小鼠足垫后出现明显的病理变化周期,在感染第3天开始进入急性感染时期,感染后第7天转入慢性感染时期,感染后第14天进入组织修复期,并且IL-6、IFN-、TNF参与了炎症反应,尤其是IL-6表达量最高,主要促进Th0向Th1和Th17亚群分化,激活巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞等,增强其吞噬和杀伤功能,以杀伤胞内鼻疽诺卡菌。     

类鼻疽伯克霍尔德菌误鉴定1例

正伯克霍尔德菌(Burkholderia)是一种革兰阴性非发酵菌,其中与人类疾病相关的病原菌主要包括洋葱伯克霍尔德菌复合群(B.cepacia complex)、类鼻疽伯克霍尔德菌复合群(B.pseudomallei complex)等。而类鼻疽伯克霍尔德菌复合群可进一步分为类鼻疽伯克霍尔德菌、鼻疽伯克霍尔德菌(B.mallei)、泰国伯克霍尔德菌(B.thailandensis)、俄克拉何马伯克霍尔德菌(B.oklahomensis)和汉普蒂社伯克霍尔德菌(B.humptydooensis)5个种[1],其中除泰国伯克霍尔德菌毒力较     

GyrB基因在诺卡菌菌种鉴定中的应用研究

目的 分析研究gyrB基因对于诺卡菌种水平的鉴定能力。方法 采用特异性引物对14种41株诺卡菌的gyrB基因进行扩增,并对其产物进行测序。从GenBank数据库中下载21株诺卡菌gyrB基因序列,对序列用DNAStar软件计算其相似性。利用Mega 6.06软件,采用邻接法和最大似然法构建诺卡菌菌种系统发育进化树。结果 以gyrB基因构建的系统发育进化树中,不同诺卡菌种能准确地分离成独立的分支,且亲缘关系较近的近缘种也能得到有效分离。诺卡菌种gyrB基因种内相似性为94.2%~100%,种间相似性约为79.2%~97.6%,平均相似性为86.9%。结论 gyrB基因序列分析是一种快速、准确、特异性较高的鉴定方法,能将诺卡菌属的鉴定至种的水平,对于鉴定诺卡菌属近缘种gyrB基因比16S rDNA更具优越性。     

肺诺卡菌病诊治的研究进展

肺诺卡菌病（PN）是由诺卡菌导致的严重的肺部感染性疾病,临床少见,易被误诊为肺部其他细菌、真菌、结核感染性疾病、肿瘤、血管炎等。PN常发生于全身或肺部局部免疫功能缺陷的宿主,临床症状主要表现为发热、咳嗽、咳痰等,影像学表现包括实变、结节、肿块及空洞等,肺部典型病理损害为坏死性脓肿,慢性感染者形成有肉芽肿,目前尚无特异性的血清学标志物,实验室检查可见外周血白细胞、C反应蛋白等炎症指标升高,低淋巴细胞、低白蛋白血症亦常见。确诊依靠病原学检查,镜下诺卡菌菌体呈多向分枝丝状,可表现为白色、黄色或紫色的粉状或天鹅绒样菌落,细菌培养所需时间较长,易致漏诊,分子技术有助于诊断。治疗上应足量、足疗程、个性化,将药敏试验作为指导。磺胺是主要的治疗药物,联合治疗可作为初始治疗。早期诊断、及时治疗是该病预后的关键。     

少见诺卡菌的鉴定及其药物敏感性分析

目的探讨少见诺卡菌的鉴定方法及药物敏感性,提高对诺卡菌的认识。方法采用菌落形态、显微镜检查和质谱分析仪的方法鉴定菌株,采用微量肉汤稀释法检测药物敏感性。结果对该院近2年分离到的3例少见诺卡菌进行鉴定和药物敏感性试验,分别为皮疽诺卡菌、乔治教堂诺卡菌和豚鼠耳炎诺卡菌,其中皮疽诺卡菌对亚胺培南、莫西沙星、复方磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、头孢曲松、阿莫西林/克拉维酸、米诺环素、利奈唑胺、阿米卡星9种抗菌药物均敏感;乔治教堂诺卡菌对环丙沙星和阿莫西林/克拉维酸耐药,对其余7种药物敏感;豚鼠耳炎诺卡菌对亚胺培南、头孢曲松和阿莫西林/克拉维酸耐药,对其余6种药物敏感。结论质谱仪有助于提高诺卡菌菌种的鉴定水平。诺卡菌属的抗菌药物敏感性因菌种不同而异,临床医生应结合药物敏感性试验结果指导临床治疗。     

secA1基因用于诺卡菌菌种鉴定分型的研究

目的 研究secA1基因在诺卡菌菌种的鉴定分型能力。方法 对59株诺卡菌的secA1基因进行聚合酶链反应扩增,扩增片段纯化后测序,并从GenBank数据库下载32株诺卡菌secA1基因序列进行补充,采用DNAStar软件对所有序列计算种内与种间相似度水平,并用Mega 6.06软件的邻接法构建诺卡菌菌种系统发育进化树。结果 91株受试诺卡菌secA1基因的种内相似度为97.2%~100.0%,平均相似度达98.6%;种间相似度为85.2%~98.4%,平均相似度达91.8%。以secA1基因构建的系统发育进化树中,16种诺卡菌被准确分离为16个独立的分支,诺卡菌近缘种新星诺卡菌复合体、少食/短链诺卡菌复合体均可有效分离。结论 secA1基因序列分析为诺卡菌菌种的鉴定分型提供了一种新方法,在诺卡菌近缘种的分型方面有独特的优势。     

Nocardia beijingensis pulmonary infection successfully treated with intravenous beta-lactam antibiotics and oral minocycline

We report a case of pulmonary infection caused by a rare Nocardia species, Nocardia beijingensis, in a 48-year-old man who received multiple immunosuppressive therapy after renal transplantation. This pathogen was isolated from a bronchoscopic protected specimen brush and was identified as N. beijingensis by 16S rRNA gene sequence analysis. The patient was initially treated with imipenem/cilastatin followed by ceftriaxone and oral minocycline. Traditionally, trimethoprim-sulfamethoxazole (SXT) has been one of the first-line antibiotics chosen as an initial therapy for pulmonary nocardiosis, but this case was successfully treated without SXT. Considering recent reports about failures of both prophylaxis and treatment for nocardial infections with SXT and its various side effects, treatment with beta-lactam antibiotics and minocycline for pulmonary nocardiosis can be chosen in mild to moderate cases with confirmed susceptibility to these antibiotics in vitro.     

盖尔森基兴诺卡菌GUH-2感染小鼠后细胞因子分泌特征研究

目的了解盖尔森基兴诺卡菌感染小鼠后细胞因子的分泌特征,进一步阐明其致病机制,为诺卡菌病的治疗提供理论基础。方法滴鼻感染BALB/c小鼠,采用平板计数法统计不同时间点小鼠肺上清及血清中的菌载量。 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测在不同时间点肺上清及血清中多种细胞因子的浓度。 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。结果小鼠感染48 h后,98.35%的肺内盖尔森基兴诺卡菌被清除,在血清中没有检测到该菌。 在感染早期,肺组织中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-γ的浓度均明显高于对照组,差异有统计学意义（P<0.01）,随着时间的推移,各细胞因子的浓度呈现逐渐下降的趋势。 在血清中,IL-6（6～24 h）、IFN-γ（12～24 h）与IL-10（48 h）浓度较高,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）。IL-12（12～48 h）与IL-4（12 h）的表达受到抑制,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）。 另外,在肺中,各细胞因子的浓度与菌载量之间符合线性相关,且均呈正相关。结论在小鼠感染盖尔森基兴诺卡菌的过程中,机体会分泌IL-6、TNF-α、IL-12、IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4等细胞因子,尤其是IL-6、IL-12、IFN-γ和IL-10浓度较高。 各细胞因子交互作用参与了清除盖尔森基兴诺卡菌感染的免疫效应机制。     

结核杆菌Ag85A重组蛋白的免疫原性研究

目的探讨纯化的结核杆菌Ag85A重组蛋白激发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)免疫应答的能力,为新型结核疫苗的设计打下基础。方法通过细胞增殖和细胞毒性实验,研究纯化的重组表达Ag85A蛋白刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性,初步鉴定Ag85A重组蛋白的免疫原性。结果以刺激系数(SI)>3为界,Ag85A重组蛋白(10μΜ)能刺激全部12例HL-A*0201阳性(A2 )结核菌素阳性(PPD )健康个体的PBMC发生增殖(平均SI为56.2±3.6);增殖反应明显高于PPD(平均SI为13.7±3.5)引起的细胞增殖反应(P<0.01)。在Ag85A重组蛋白诱导的CTL细胞毒活性分析中以负载抗原肽(10μΜ)的T2细胞作为靶细胞,Ag85A重组蛋白诱导的CTL作为效应细胞,Ag85A重组蛋白能诱导全部的12例A2 PPD( )健康个体中CTL杀伤活性,平均活性分别为(85.2±8.5%),显著高于PPD〔(平均为(21.6±1.7%)〕(P<0.01)诱导的CTL杀伤活性。结论本研究得到的重组优化Ag85A蛋白具有较好的免疫原性,能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性,为进一步开发有效的结核疫苗打下了基础。     

一株mcr-1阳性多重耐药宋内志贺菌的鉴定和药物敏感性特征分析

目的对分离的1株mcr-1阳性多重耐药宋内志贺菌进行鉴定和耐药性分析。方法采用生化和血清凝集试验进行病原体鉴定；使用微量肉汤稀释法进行药敏试验，并用聚合酶链式反应方法检测耐药基因的存在情况；利用脉冲场凝胶电泳方法对菌株进行遗传多态性和质粒图谱分析并进行Southern杂交试验；用质粒接合转移试验验证mcr-1基因的水平转移能力。结果在广西壮族自治区分离出1株mcr-1阳性的多重耐药宋内志贺菌，对萘啶酸、阿奇霉素、多粘菌素有较高耐药性。 mcr-1基因、mph(A)和bla_CTX-M-14基因分别在两个不同的质粒上，且mcr-1基因能通过质粒介导水平转移。结论加强志贺菌尤其是宋内志贺菌对头孢曲松和阿奇霉素共同耐药的监测及mcr-1传播的分子流行病学研究，为合理使用抗生素治疗细菌性痢疾提供依据。     

胶质瘤来源exosome的鉴定及其蛋白质组成研究

目的初步分析胶质瘤细胞分泌的exosome蛋白组成,探讨胶质瘤来源exosome的潜在免疫调节功能,从而为进一步利用exosome对胶质瘤进行免疫治疗提供理论依据。方法采用差速离心法从U251胶质瘤细胞培养上清液和Ⅲ级星形胶质瘤囊液中分别提纯exosome,用透射电镜鉴定;利用二维电泳分离、分析exosome内蛋白质,并用质谱技术鉴定了部分蛋白质。结果胶质瘤细胞可以产生exosome,其平均直径约100 nm。二维电泳图显示U251细胞分泌的exosome含有270个蛋白点,与数据库相符的有66个;而来自Ⅲ级星形胶质瘤囊液的exosome含有242个蛋白点,与数据库相符的有60个;两者有130个蛋白点在等电点和表观分子量方面相同,其中包含HSP70、RNA结合蛋白、核酸外切酶、MHCI及MHCII类分子等。部分蛋白质点质谱鉴定结果为hCG、低密度脂蛋白、T细胞受体等。结论胶质瘤细胞可分泌exosome,其一般特性与已报道的exosome一致,其蛋白组成与其他细胞来源的exosome具有共性,体内和体外培养的胶质瘤细胞分泌的exosome的蛋白质组成具有同源性与差异性。胶质瘤细胞源的exosome具有一定的免疫调节功能,可以为胶质瘤免疫治疗提供理论基础。     

一株mcr-1阳性韦太夫雷登沙门菌的鉴定和药物敏感性特征分析

目的 鉴定1株mcr-1阳性韦太夫雷登沙门菌并对其耐药特征及机制进行分析.方法 基于肠道病原监测平台收集的分离于2015年的沙门菌株使用生化检测试验和血清凝集试验进行病原体鉴定和血清型分型,并用聚合酶链式反应方法检测mcr-1基因;使用微量肉汤稀释法进行药敏试验;使用质粒图谱和Southern-blot试验对菌株耐药基...