骨组织工程用三维灌注生物反应器系统的设计

目的:设计并构建一套骨组织工程用三维灌注生物反应器系统。方法:①明确骨组织工程用生物反应器系统的设计原则。②灌注小室由管状玻璃主体、聚四氟乙烯螺帽以及橡胶O型圈构建组成。整个系统通过铂处理的硅胶管以及三通和四通将3个灌注小室、双向蠕动泵、培养液贮存瓶、废液贮存瓶、接种口和空气滤膜连接构成。③研究生物反应器系统操作程序。④计算细胞/支架结构体内细胞受到的流体剪切力。结果:设计并构建了一套三维灌注生物反应器系统,既可以减轻内外扩散限制,也可以将力学刺激作用于细胞。该系统区别于其他设计的主要特点是:将细胞接种和长期培养整合于一体构建工程化组织;培养基可以完全穿过支架内部;同时,其模块式设计不仅可以增加工程化组织培养的数量,而且可以根据实验目的在不同时间点灵活方便地收获结构体。结构体内细胞所受到的流体剪切力可以根据灌注速率和支架性质进行计算。结论:所设计的三维灌注生物反应器系统在骨组织工程中具有广阔的应用前景,不仅可以构建工程化骨组织用于临床修复骨缺损,而且可以用于研究流体剪切力作用对骨细胞在三维支架中行为的影响。     

骨组织工程研究现状

由于创伤、肿瘤、退行性改变等各种原因造成的骨组织缺损导致患肢体功能严重受损或丧失，以致患预后生活质量极差，已成为骨科领域急待解决的问题之一。目前常用的修复骨组织缺损的方法有：自体骨移植、同种异体骨移植、异种骨移植，但由于供体来源有限，手术二次创伤、感染、强烈排斥反应等原因而限制了其在临床上的应用，组织工程学研究使人们看到新的希望。     

三嵌段高分子骨组织工程支架材料的体内生物学性能评价

目的：对三嵌段高分子骨组织工程支架材料-聚（丙交酯-乙交酯）[天冬氨酸-聚乙二醇1的生物相容性进行评价，探讨用于骨组织工程的可行性。 方法：实验于2003-08／12在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。①过敏试验：20只豚鼠随机分为试验组、对照组，每只豚鼠脊柱两侧皮内注射等体积聚（丙交酯-乙交酯）[天冬氨酸-聚乙二醇]浸提液、生理盐水及体积分数为0．05的甲醛溶液，记录激发部位红斑水肿。②急性全身毒性试验：12只小白鼠随机分为试验组和对照组，该两组腹腔分别注射浸提液及生理盐水，4，24，48及72h观察动物的一般状态。③植入试验：聚（丙交酯-乙交酯）[天冬氨酸-聚乙二醇]植入6只新西兰大白兔肌肉内，1，4及8周切取材料周围0．5cm处肌肉组织，苏木精-伊红染色，光镜下观察。 结果：①过敏试验结果：皮内注射浸提液及生理盐水动物皮肤无红斑水肿，注射体积分数为0．05的甲醛溶液出现中度以上红斑水肿。②急性全身毒性试验结果：阴性对照组未见毒性症状，试验组4h后仅1只有轻微的运动减少，24h后恢复正常。③植入试验结果：所有试验动物伤口均一期愈合。 结论：聚（丙交酯-乙交酯）[天冬氨酸-聚乙二醇]具有良好生物相容性，是一种新的骨组织工程支架材料。     

生物体内可降解骨组织工程复合材料的研究与进展

可降解骨组织工程复合支架材料可以分为同类生物材料的复合,不同类别生物材料之间的交叉复合.天然材料存在性能难以重现,难以大批量生产,在体内水解过程中不能保持空间构型等缺点;人工合成生物高分子材料之间的复合,但其本体降解特性会使支架过早丧失结构完整性,且局部形成降解产物的积累,引起炎症反应;人工合成无机材料之间的复合,存在脆性大、润湿性较差,降解性能较差等不足.交叉复合可以克服单种材料支架的缺陷.交叉复合材料可以分为:天然生物材料与无机材料之间的复合;人工合成高分子与无机材料之间的复合;金属基交叉复合材料.     

骨组织工程中支架材料的研究进展

因创伤、感染、肿瘤、骨坏死及先天畸形等多种疾病引起的骨缺损临床常见,但治疗困难。近代组织工程学的发展为骨缺损的修复开辟了新的途径。骨组织工程学作为此学科的一个重要组成部分,已经被认为是目前最有前途和可行性的一个领域,在基础研究和临床应用等方面均取得了很大进展。骨组织工程学研究主要有三个方面：种子细胞、支架材料、生长因子。支架材料连接细胞与组织的框架、信号分子的载体、骨组织繁殖分化和代谢的场所。骨组织工程支架材料对骨缺损的修复有重要影响。理想的支架材料应具备的特性包括［1］：①良好的生物相容性。材料本身及其降解产物应无不良反应,不引起炎症反应,且要有利于细胞的黏附、增殖、生长和分化。②良好的生物降解性。当支架材料的支架作用完成后,其应该能被人体降解并被人体吸收。支架的降解速度应与组织细胞的生长速度保持动态平衡。③具有三维立体多孔结构。一般要求支架材料具有一定的孔隙率,孔隙率应达90％以上,以利于营养和氧气的吸收和代谢产物的排出,以及神经和血管的生长。④良好的材料‐细胞界面。材料要为细胞的黏附和增殖提供良好的界面,以促进细胞的生长,特别是能激活细胞特异基因,保证正常细胞表型的表达。⑤可塑性和一定的机械强度。支架材料应能预先加工成与缺损区相匹配的形态结构,并能够为新生组织提供良好的机械支撑。⑥支架材料易于消毒、保存,且消毒后支架材料的内部结构完整无破坏。在骨组织工程学研究中,寻找理想的支架材料是一大热点。     

生物衍生骨支架材料制备及在体内的组织相容性

背景：理想的支架材料必须对机体无毒性，无免疫排斥反应，并能适时地降解，具有良好的生物相容性，生物衍生骨支架材料能否长期存留体内并发挥功能值得研究。 目的：观察生物衍生骨支架材料植入鼠体内后机体局部组织生物相容性及对免疫功能的影响。 设计：随机对照动物实验。 单位：吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室。 材料：实验于2006-03／2006-07在吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室完成，选用18只雄性BALB／C小鼠，体质量（202）g，雌雄各半：1只昆明小鼠，体质量20g：1只雌性家兔，体质量2．5kg，以上实验动物均由吉林大学基础医院实验动物部提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。猪松质骨（髂骨）为市售。实验用IMDM培养基为美国Hycolone公司产品，FBS购自美国GIBCO公司，四甲基偶氮唑盐及ConA均为美国Sigma公司产品。 方法：采用猪髂骨制备生物衍生骨支架材料。①采用随机抽签法将BALB，C小鼠分成支架材料植入组、异种骨植入组及对照组，每组6只。支架植入组将支架植入到BALB／C小鼠的下肢肌肉内，异种骨植入组将昆明鼠骨植入到BALB／C小鼠下肢肌肉内，对照组仅将局部肌肉损伤。②术后21d取材料植入部位及周围组织，大体及苏木精-伊红染色法进行观察材料与组织相容性：采用刀豆蛋白A诱导各组脾淋巴细胞转化，酶联免疫检测仪在λ570nm波段检测并记录淋巴细胞刺激指数。以补体依赖性细胞毒实验评估各组小鼠免疫功能，即采用酶联免疫检测仪在λ570nm波段检测并记录各组吸光度值，计算细胞杀伤率。 主要检测指标：①植入物周围组织相容性。②刀豆蛋白A诱导后淋巴细胞刺激指数。③补体依赖性细胞毒实验各组细胞杀伤率。 结果：18只BALB／C小鼠均进入结果分析。①?     

骨组织工程中细胞种植基质材料的发展

目前研究和实验中的骨组织工程支架材料种类繁多,来源不同,性能各异,但尚无一种材料能够满足支架材料的全部要求,应充分考虑到各种材料的优缺点,发挥各自优势,取长补短,形成复合材料,并含有最佳组合的生长因子释放系统,发挥最佳成骨能力。     

生物反应器在组织工程中的应用进展

种子细胞是组织工程学的基本要素之一,种子细胞体外大规模扩增培养是组织工程学的一个重要方面.生物反应器体外大规模扩增动物细胞已成为当前最常用、有效的方法，并且越来越多地在组织工程中得到应用。以此为参考，在新型生物反应器中大规模扩增组织工程种子细胞或体外构建工程化组织，已成为一种全新的研究和治疗思路。     

三嵌段高分子骨组织工程支架材料的体内生物学性能评价

目的:对三嵌段高分子骨组织工程支架材料--聚(丙交酯-乙交酯)犤天冬氨酸-聚乙二醇犦的生物相容性进行评价,探讨用于骨组织工程的可行性。方法:实验于2003-08/12在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。①过敏试验:20只豚鼠随机分为试验组、对照组,每只豚鼠脊柱两侧皮内注射等体积聚(丙交酯-乙交酯)犤天冬氨酸-聚乙二醇犦浸提液、生理盐水及体积分数为0.05的甲醛溶液,记录激发部位红斑水肿。②急性全身毒性试验:12只小白鼠随机分为试验组和对照组,该两组腹腔分别注射浸提液及生理盐水,4,24,48及72h观察动物的一般状态。③植入试验:聚(丙交酯-乙交酯)犤天冬氨酸-聚乙二醇犦植入6只新西兰大白兔肌肉内,1,4及8周切取材料周围0.5cm处肌肉组织,苏木精-伊红染色,光镜下观察。结果:①过敏试验结果:皮内注射浸提液及生理盐水动物皮肤无红斑水肿,注射体积分数为0.05的甲醛溶液出现中度以上红斑水肿。②急性全身毒性试验结果:阴性对照组未见毒性症状,试验组4h后仅1只有轻微的运动减少,24h后恢复正常。③植入试验结果:所有试验动物伤口均一期愈合。结论:聚(丙交酯-乙交酯)犤天冬氨酸-聚乙二醇犦具有良好生物相容性,是一种新的骨组织工程支架材料。     

解放军第三军医大学西南医院骨组织工程实验室将组织工程骨应用于临床骨缺损治疗

解放军第三军医大学西南医院骨组织工程实验室在许建中主任和王序副主任的指导下,通过多年实验研究,在将组织工程骨应用于临床骨缺损治疗上取得了重大成果。采用组织工程原理,将患者自身的骨髓干细胞分离出来,再将其复合在脱钙骨质支架材料上,将“死”的骨材料构建成“活”的骨组织,再用其修复人体骨缺损。     

生物反应器在组织工程学中的应用及其前景

用于组织工程的生物反应器主要有以下类型:搅拌式生物反应器一般应用于微载体培养细胞或组织构建,但对细胞的剪应力大。灌注反应器克服了机械混合产生的剪应力,可以对细胞的周围环境进行精确的监测和控制。旋转生物反应器是一种水平旋转的、无气泡的膜扩散式气体交换的培养系统,几乎没有破坏性的剪切力,细胞表型表达更充分。生物反应器与微载体相结合,可使细胞培养的数量提高数十倍,可以满足较大体积组织构建对种子细胞数量的需求。生物反应器提供的动态培养可使支架内的氧及营养传质更充分,代谢产物更容易排出,细胞表型更充分地表达,种子细胞可达到远超过被动扩散的深度。生物反应器还能提供很多培养组织所必需的物理信号。     

In vivo tissue engineering of an adipose tissue flap using fat grafts and Adipogel

For decades, plastic surgeons have spent considerable effort exploring anatomical regions for free flap design. More recently, tissue‐engineering approaches have been utilised in an attempt to grow transplantable tissue flaps in vivo. The aim of this study was to engineer a fat flap with a vascular pedicle by combining autologous fat grafts and a novel acellular hydrogel (Adipogel) in an established tissue‐engineering model comprising a chamber and blood vessel loop. An arteriovenous loop was created in the rat groin from the femoral vessels and positioned inside a perforated polycarbonate chamber. In Group 1, the chamber contained minced, centrifuged autologous fat; in Group 2, Adipogel was added to the graft; and in Group 3, Adipogel alone was used. Constructs were histologically examined at 6 and 12 weeks. In all groups, new tissue was generated. Adipocytes, although appearing viable in the graft at the time of insertion, were predominantly nonviable at 6 weeks. However, by 12 weeks, new fat had formed in all groups and was significantly greater in the combined fat/Adipogel group. No significant difference was seen in final construct total volume or construct neovascularisation between the groups. This study demonstrated that a pedicled adipose flap can be generated in rats by combining a blood vessel loop, an adipogenic hydrogel, and a lipoaspirate equivalent. Success appears to be based on adipogenesis rather than on adipocyte survival, and consistent with our previous work, this adipogenesis occurred subsequent to graft death and remodelling. The regenerative process was significantly enhanced in the presence of Adipogel.     

成骨诱导脂肪基质细胞在骨组织工程体内成骨中的作用

背景:以往研究认为,经过成骨诱导后的脂肪基质细胞通过转化为成骨细胞分泌骨基质进而修复骨缺损,然而并没有明确结论证实。目的:将经过体外成骨诱导的脂肪基质细胞复合支架材料分别植入骨缺损区和非骨区,根据是否成骨,验证经过成骨诱导后的脂肪基质细胞是否转化为成骨细胞。方法:取12月龄犬背部皮下脂肪,经胶原酶消化法获得单个核细胞,将培养的第3代细胞与双相磷酸钙陶瓷形成复合物。在犬下颌骨两侧制备长20mm、高10mm的箱状缺损,拔除术区牙齿,将细胞支架复合物植入一侧术区,空白侧留作对照;另外在犬背部皮下肌肉区植入细胞支架复合物及骨诱导性磷酸钙陶瓷材料,术后6周及12周经组织学检测骨缺损修复情况。结果与结论:脂肪基质细胞复合双相磷酸钙陶瓷在骨缺损区成骨,在肌肉区未形成新骨;骨诱导性磷酸钙陶瓷在肌肉区形成新骨。提示成骨诱导并不能将脂肪基质细胞转化为成骨细胞,其确切机制有待进一步研究。     

腺病毒介导的骨形态发生蛋白基因增强在骨组织工程中的应用

背景:将目的基因转导到靶细胞中需要载体工具,载体可协助基因进入细胞及表达蛋白,载体的选择是转基因成败的关键。目的:总结腺病毒介导的骨形态发生蛋白基因增强用于诱导成骨和修复骨缺损的研究现状。方法:应用计算机检索PubMed数据库及中国期刊网全文数据库1989-01/2012-01有关腺病毒介导骨形态发生蛋白基因转染的诱导成骨作用,骨形态发生蛋白基因修饰的组织工程化骨修复骨缺损的文章,英文检索词为"adenovirus,bone morphogenetic protein,gene transfection,bone tissue engineering",中文检索词为"腺病毒,骨形态发生蛋白,基因转染,骨组织工程"。排除重复性及非中英文语种研究,共保留24篇文献进行综述。结果与结论:腺病毒介导的骨形态发生蛋白基因增强的组织工程利用基因工程技术将编码特定功能因子的基因转移到种子细胞上,使其持续产生生长因子。转基因后的细胞停留支架材料表面缓慢释放生长因子,促进成骨前体细胞增殖分化,也可在骨缺损处诱导成骨前体细胞向成骨细胞定向分化,从而修复骨缺损。     

骨组织工程中干细胞的研究与应用

背景：是否可以通过改进对已知的可以分化成骨的干细胞的培养方式或者寻找到新的干细胞,为骨组织工程找到更为合适的种子细胞.目的：从干细胞的分离培养、生物学特性及标志物等方面对各类干细胞的在骨组织工程中的应用进行综述.方法：以英文检索词为“bone tissue engineering,seed cel s,stem cel ,osteoblast differentiation”及中文检索词为“骨组织工程,种子细胞,干细胞,成骨分化”,由第一作者检索1995年至2012年PubMed 数据库及中国知网中文科技数据库,查阅近年种子细胞相关文献,最终保留50篇文献,从分离培养方法、基本特性及在骨组织工程中的应用3方面进行综述.结果与结论：文章分别对各类干细胞（包括：胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞和脐带血间充质干细胞、外周血来源的多潜能间充质干细胞、脂肪干细胞、子宫内膜基质干细胞、人羊膜基质细胞、牙髓干细胞）的分离方法、生物学特性、标志物等相关实验研究进行了探讨.目前用于分离纯化骨髓间充质干细胞的方法主要有4种：密度梯度离心法、全骨髓贴壁培养法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠法.研究证实各类干细胞在特定条件下均有分化成骨的能力.     

骨组织工程的研究进展

本文对组织工程骨的研究作了概述,介绍了用于骨组织工程的种子细胞、支架材料和骨组织构建的基本做法.介绍了用珊瑚、珊瑚-羟基磷灰石、松质骨基质和其他一些天然生物材料,用作成骨细胞培养的支架材料,研究证实除了人工合成的聚合物类材料之外,一些天然生物材料也可作为骨组织工程理想的支架材料.     

原位杂交技术在组织工程研究中的应用

背景:通过原位杂交技术对修复组织进行检测,是目前分析组织再生和修复状况的重要方法之一.目的:综述国内外关于原位杂交技术在组织工程应用中的研究概况.方法:应用计算机检索PubMed 1980-01/2009-07期间的相关文章,检索词为In situ hybridization,Tissue engineering,Insulin-like growthfactor-Ⅰ(IGF-Ⅰ),并限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库1995-01/2009-07期间的相关文章,检索词为原位杂交,组织工程,胰岛素样生长因子1,并限定文章语言种类为中文.此外还手工查阅相关专著数部.纳入原位杂交技术基本原理及原位杂交技术在组织工程中相关应用的文章.结果与结论:原位杂交技术包括分子生物学、细胞遗传学和组织化学等方面的技术,是一种核酸定位和检测基因表达的有效方法.原位杂交技术尤其是荧光原位杂交技术,可对修复的组织进行准确有效的检测,在骨、软骨等组织工程实验研究中有广泛应用,已成为目前分析组织再生和修复状况的重要方法之一.近年来国内外对原位杂交技术在组织工程中的应用研究主要从生物医学和临床医学两方面着手,都获得了众多研究成果.此外,对与组织生长发育密切相关的生长因子胰岛素样生长因子1的原位检测也很有效,三维支架中胰岛素样生长因子1的原位检测是今后工作的重点.     

In vivo vascular tissue engineering: influence of cytokine and implant location on tissue specific cellular recruitment

In vivo tissue engineering has been explored as a means to create autologous vascular replacements. Elastin is necessary to sustain continual pulsatile flow and to prevent the dilatation of vascular tissues. Unfortunately, elastogenesis in tissue‐engineered constructs has been very limited. To overcome this limitation, we have created tubular elastin scaffolds from porcine carotid arteries. Elastin would provide the necessary elasticity to the graft on implanting these scaffolds as vascular grafts. In this study, elastin tubes with agarose gel containing either stromal‐derived factor‐1 α [SDF; for homing of endothelial cells (ECs)] or basic fibroblast growth factor (bFGF; for homing of myofibroblasts) were implanted into adipose tissue, as it is a known source of stem/progenitor cells. We also implanted these tubes into subdermal pouches (as a control location). We observed a difference in the types of cells recruited—ECs were recruited in large numbers by SDF in the adipose tissue, whereas the adipose‐FGF group had a vascularized (smooth muscle and EC‐positive), collagenous capsule (adventitia) with many smooth muscle α‐actin (SMA)‐positive cells in the elastin scaffold layer (media). These results were in contrast to the subdermal group, which only recruited fibroblasts and some SMA‐positive cells. Also, more cell infiltration and neo‐collagen formation was seen in adipose implants. This study provides novel results by the use of specific cytokines and implant locations to recruit tissue‐specific cells to create autologous vascular grafts. Copyright © 2009 John Wiley & Sons, Ltd.     

携带半乳糖苷酶报告基因重组腺相关病毒体内转染骨组织的实验观察

目的:腺相关病毒载体因具有安全性好、免疫源性低、能感染分裂和非分裂细胞且能介导外源基因稳定长期表达等优点而备受瞩目,是最有希望应用于临床的病毒类载体。观察携带半乳糖苷酶报告基因的重组腺相关病毒(rAAV-LacZ)体内转染骨组织的效果。方法:实验于2005-01/2006-01在北京大学医学部第三医院和皖南医学院弋矶山医院骨科实验室完成。实验材料:8周龄雄性SD大鼠8只,体质量220g左右。rAAV-LacZ载体(本元正阳公司,病毒滴度为6×1012v·g/mL);Ⅰ型胶原海绵载体(上海其胜公司)。实验分组:将大鼠随机分为实验组和对照组,每组4只。实验方法:实验组4只大鼠在胫骨前外侧做骨缺损槽后,将滴有6×1011v·g病毒量的rAAV-LacZ和Ⅰ型胶原载体复合物植入骨缺损槽;对照组4只大鼠仅在胫骨骨缺损槽内植入Ⅰ型胶原载体。实验评估:①手术后6周取材行x-gal染色后,分别行标本大体病理观察和组织学观察以了解β-半乳糖苷酶特异表达的情况。②同时提取实验部位以远器官肝和心脏组织RNA,反转录-聚合酶链反应检测这些部位有无β-半乳糖苷酶特异表达。结果:8只SD大鼠均进入结果分析。①大体病理观察结果:实验组动物胫骨骨缺损处取材经x-gal染色后可见骨质蓝染,即有特异性β-半乳糖苷酶表达,而骨缺损临近处肌肉也表达β-半乳糖苷酶,Ⅰ型胶原载体植入部位以远的骨质和肌肉则没有特异性β-半乳糖苷酶的表达。②组织学观察结果:实验组骨缺损处肌肉肌纤维特异性表达β-半乳糖苷酶且没有明显的淋巴细胞局部浸润。蓝染的骨皮质切片显示骨陷窝内的骨细胞特异性表达β-半乳糖苷酶。对照组则没有实验组上述特异性β-半乳糖苷酶的表达。③反转录-聚合酶链反应结果:实验组实验部位有特异性β-半乳糖苷酶的表达,而其以远的心、肝器官内没有特异性β-半乳糖苷酶的表达。而对照组实验部位和实验部位以远的心、肝器官内均没有特异性β-半乳糖苷酶的表达。结论:腺相关病毒载体直接注射到骨缺损和骨折部位可以有效转染骨和临近肌肉组织,并能长期(6周)表达所携带的外源基因,具有一定的安全性。