金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆及表达

目的 对金黄色葡萄球菌肠毒素A基因（SEA）进行克隆、鉴定与表达,为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究SEA的功能奠定基础。方法 用聚合酶链反应（PCR）扩增SEA基因,将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T上,经测序反应确定无误,酶切后将SEA基因与原核表达载体pET42b（＋）构建表达SEA的重组质粒。将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5a内并提取质粒,经双酶切鉴定后,再转化入表达宿主大肠杆菌B121菌株内,对转化菌株进行诱导后,破菌,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。结果 构建了表达载体pET42b（＋）-SEA,并获得高效表达,表达的蛋白质相对分子质量为27000,重组蛋白（rSEA）在37℃、25％经异丙基硫化-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导时均以包涵体形式存在。结论 SEA基因成功克隆到表达质粒内并表达,为制备单抗、诊断试剂及其致病机制研究奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B的基因克隆及原核表达

目的 构建金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因的原核表达克隆,并在大肠杆菌中表达.方法 从金黄色葡萄球菌中提出DNA,PCR扩增出肠毒素B(SEB)成熟肽前体蛋白基因,将其插入到质粒pGEX-4T-2编码谷胱甘肤转移酶(GST)的多克隆位点(MCS),构建原核表达克隆(PGEX-4T-2/SEB).重组质粒经酶切、测序鉴定后转化大肠杆菌,IPTG诱导表达目的 蛋白.SDS-PAGE电泳分析蛋白图谱.Western blot鉴定表达蛋白.结果 经酶切和测序分析,表明成功构建了pGEX-4T-2/SEB原核表达克隆.经IVTG诱导,转化的大肠杆菌表达出相对分子质量(Mr)为55×103Daltons的融合蛋白,且该蛋白能与抗SEB抗体发生特异性结合反应.结论 金黄色葡萄球菌肠毒素B(SES)基因原核表达克隆的成功构建,并在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究肠毒素B(SEB)的生物学功能和-临床应用奠定了基础.     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因在大肠杆菌中的克隆及表达

目的扩增金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,并进行诱导、表达,为其应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEB的基因序列,设计一对分别含BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,并与做相应酶切的pET-28α(+)连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及测序,用IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot印迹鉴定表达产物。结果成功扩增出SEB基因,基因大小为801bp,重组PET-28α(+)-SEB双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEB在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99%。经IPTG诱导后,pET-28α(+)-SEB/BL21在相应的相对分子质量(35×103)可见融合蛋白以包涵体形式表达,免疫印迹在相应分子量检测到目的蛋白。结论克隆了SEB基因,并成功在大肠杆菌BL21中以包涵体形式表达,为肠毒素B应用研究奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素的检测及结果分析

目的 了解引起临床感染的金黄色葡萄球菌(SA)携带肠毒素(SE)的情况.方法 对从临床标本中分离出的260株SA,用反向间接血凝试验检测其肠毒素,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)检测按2005年美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的检测头孢西丁方法进行.结果 260株SA中有172株携带肠毒素,占66.2%,主要为SEA型10.8%(28/260)、SEB型14.6%(38/260)、SEC型10.0%(26/260),同时携带二种或二种以上肠毒素的占23.8%(62/260);其中MRSA134株,全部携带肠毒素,且以SEA、SEB、SEC为主,分别为19.4%、16.4%、13.4%;甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)126株,携带肠毒素率为30.0%(38/126),以SEB为主,占9.5%.结论 临床上SA分离株大部分都携带肠毒素,且以SEA、SEB、SEC为主,MRSA的带毒率高于MSSA.     

金黄色葡萄球菌肠毒素的检测及结果分析

目的了解引起临床感染的金黄色葡萄球菌(SA)携带肠毒素(SE)的情况。方法对从临床标本中分离出的260株SA,用反向间接血凝试验检测其肠毒素,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)检测按2005年美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的检测头孢西丁方法进行。结果260株SA中有172株携带肠毒素,占66.2%,主要为SEA型10.8%(28/260)、SEB型14.6%(38/260)、SEC型10.0%(26/260),同时携带二种或二种以上肠毒素的占23.8%(62/260);其中MRSA134株,全部携带肠毒素,且以SEA、SEB、SEC为主,分别为19.4%、16.4%、13.4%;甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)126株,携带肠毒素率为30.0%(38/126),以SEB为主,占9.5%。结论临床上SA分离株大部分都携带肠毒素,且以SEA、SEB、SEC为主,MRSA的带毒率高于MSSA。     

实时荧光聚合酶链反应检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、D

目的建立一种快速、准确、特异、定量检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素A、D的方法并探讨肠毒素在食物中毒引起腹泻中的意义。方法选择femB、SEA和SED基因分别作为金黄色葡萄球菌菌株、肠毒素A、肠毒素D的靶序列,设计合成引物和探针;收集食物中毒导致腹泻患者粪便标本487份,并对其进行检测分析。结果采用荧光聚合酶链反应检测金黄色葡萄球菌和肠毒素A的灵敏度为1·0×102拷贝,而检测肠毒素D的灵敏度为1·0×103拷贝;487份粪便标本中检出金黄色葡萄球菌72例(14·8%),检出产肠毒素A菌株为11例(15·3%,11/72),产肠毒素D菌株为9例(12·5%,9/72),同时产肠毒素A、D菌株1例(1·4%,1/72)。结论应用Taqman探针实时荧光PCR技术能够快速、准确检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素,适合于大样本筛查;肠毒素是金黄色葡萄球菌食物中毒导致腹泻的重要病因之一。     

北京市健康从业人员携带金黄色葡萄球菌肠毒素特征分析

目的 了解健康从业人员携带金黄色葡萄球菌的肠毒素分布情况。方法 收集北京市朝阳区健康从业人员鼻部携带金黄色葡萄球菌100株,对20种肠毒素和类肠毒素基因进行检测,并进行spa分型和多位点序列分型（MLST）分析。结果 100株金黄色葡萄球菌菌株中,64株菌（64%）携带1种或多种肠毒素基因。最常见的肠毒素基因分别为sea、seg、selm、seln、sell和seb。最常见的肠毒素类型为sea和selp,检出率均为10%。肠毒素sea主要分布在ST6（29.4%,5/17）和ST401（29.4%,5/17）型菌株。携带单一selp肠毒素基因的菌株50%均属于spa t796型。结论 健康从业人员金黄色葡萄球菌肠毒素基因的高携带率可能成为食物中毒不可忽视的危险因素。     

虾仁制品中金黄色葡萄球菌及其肠毒素的检测研究

目的分析研究虾仁制品中金黄色葡萄球菌及其肠毒素污染状况。方法金黄色葡萄球菌按GB/T4789.10-2003检测,金黄色葡萄球菌肠毒素采用mini-VIDAS全自动荧光酶标免疫分析仪进行测定。结果速冻虾仁中金黄色葡萄球菌的检出率为68.2%,从检出的金黄色葡萄球菌中产肠毒素菌株的检出率为40.0%;脱水虾仁中金黄色葡萄球菌的检出率为31.8%,从检出的金黄色葡萄球菌中产肠毒素菌株的检出率为100.0%。结论虾仁制品金黄色葡萄球菌及其肠毒素的污染严重,应加强对虾仁制品中金黄色葡萄球菌肠毒素的检测。     

金黄色葡萄球菌肠毒素与多器官功能障碍综合征

临床资料表明 ,革兰阳性 ( G )菌脓毒症的发病率逐年上升 ,至 2 0世纪 90年代已达脓毒症发病率的40 %以上 ,并仍有升高趋势。其中金黄色葡萄球菌 (金葡菌 )发病率位居首位 ,是烧伤创面感染、急性肝衰竭的重要病原菌。由于其致病因素复杂、耐药性不断增强 ,特别是中间型抗万古霉素金葡菌的出现 ,金葡菌感染所致脓毒症及多器官功能障碍综合征 ( MODS)的防治已成为现代创伤外科和危重病医学面临的棘手难题之一。我们回顾性调查了近 5年间从创面分离的病原菌 1 661株 ,其中金葡菌分离率从 1 995年的 1 7.7% (居第3位 )上升为 1 999年的 2 9.3…     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与表达

目的　对结核分枝杆菌的ESAT - 6基因进行克隆、鉴定与表达 ,为结核病的诊断、重组疫苗的应用打下基础。方法 　 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用聚合酶链反应 (PCR)对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物连接于测序载体 pGEM T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR产物与原核表达载体pET4 2b(+)构建表达ESAT - 6的重组质粒 ,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒 ,经酶切鉴定后 ,再转化入表达宿主大肠杆菌BL2 1菌株内 ,对转化菌株进行诱导后 ,破菌 ,进行SDS -PAGE电泳。结果 　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,其表达的蛋白质相对分子质量为 990 0。结论 　 目的基因克隆到菌株内 ,重组结核分枝杆菌ESAT - 6的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测等奠定了基础     

人胰腺α-淀粉酶的cDNA克隆和原核表达的初步研究

目的 获得人胰腺α-淀粉酶(AMY2A)基因并进行原核表达。方法 采用基因工程技术,根据人AMY2A基因序列设计并合成特异性引物;从人胰腺组织中提取总RNA,反转录成CDNA第一链;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人胰腺AMY2A基因,经BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切、连接并插入原核表达载体pGEX-5T,构建pGEX-5T-AMY2A重组表达载体,在大肠杆菌BL21中异丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达AMY2A蛋白。包涵体经尿素变性、复性及谷胱苷肽琼脂糖柱亲和层析纯化、AMY2A酶活性测定和免疫印迹分析。结果 重组质粒测序和酶切结果显示AMY2A基因已正确插入pGEX-5T,重组蛋白、复性及纯化产物SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在84 000处有一条明显的蛋白表达条带,AMY2A检测具有酶活性,免疫印迹分析表明重组蛋白具有人胰腺淀粉酶抗原性。结论 作者已克隆并在大肠杆菌中初步表达并获得纯化的谷胱苷肽转移酶(GST)-AMY2A融合蛋白。     

金黄色葡萄球菌肠毒素快速分型体系的建立及应用

目的 建立SYBR-Green荧光PCR体系金黄色葡萄球菌肠毒素快速分型体系,应用于金黄色葡萄球菌食物中毒和食品风险监测快速诊断.方法 根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E基因的保守序列设计特异性引物,分别建立SYBR-Green荧光PCR体系.应用该系列体系检测185株金黄色葡萄球菌野生株的肠毒素基因A～E型.结果 建立的SYBR-Green荧光PCR系列体系其DNA灵敏度为1.34～2.80 ng/μL,菌液灵敏度为46～96 CFU/mL;用以检测185株金黄色葡萄球菌的肠毒素基因A～E型,携带一种基因型的为58.38%,同时携带两种以上毒素基因占4.86%.结论 建立的荧光PCR反应体系快速、灵敏度高、特异性强,能应用于金黄色葡萄球菌肠毒素基因的准确分型,对食物中毒诊断和食品风险监测很有意义.     

Temperature dependence of staphylococcal enterotoxin A production by Staphylococcus aureus

Staphylococcal food poisoning (SFP) results from the consumption of foods containing sufficient amounts of one or more preformed staphylococcal enterotoxins (SEs). SEs are heat stable and can withstand heat at 121 degrees C for 10 min. Therefore, after SEs were produced in food, reheating of food is ineffective in preventing SFP. Among the SEs, SEA appears to be most frequently associated with food poisoning. SEA can be produced at the temperature range of 10-46 degrees C. Many researchers investigated SEA in various foods such as milk, cream, egg and mushroom at some temperatures. As the temperature is raised, SEA concentration was increased. But, because detailed relationships between SEA production and incubation temperature were not examined, we investigated the effect of incubation temperature (10, 15, 20 and 37 degrees C) on SEA productions by using various SEA producing strains of S. aureus. As a result, relationships were found between incubation temperature and SEA production as well as the studies of others. However, little relationship was found between the maximal SEA concentrations at each incubation temperature. SEA production does not necessarily depend on temperature. This result suggests that SEA production is strongly influenced by the intrinsic properties of strains as well as the environmental factors such as temperature and nutrients.     

金黄色葡萄球菌的药敏表型和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的SCCmec基因分型

目的研究从临床标本中分离的金黄色葡萄球菌（SA）的耐药性、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的发生率及其葡萄球菌盒式染体色mec（SCCmec）基因分型。方法采用纸片琼脂扩散法进行SA耐药性检测及MRSA测定,应用多重聚合酶链反应（PCR）进行SCCmec各基因型及PV杀白细胞素（PVL）基因型的检测。结果 102株SA中检出39株MRSA,检出率为38.2%（39/102）。甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）对克林霉素、复方磺胺甲口恶唑、四环素3种抗菌药物耐药率较高,分别为39.7%、31.7%、22.2%;对庆大霉素及喹诺酮类耐药率较低,为6.3%~14.3%。而MRSA对克林霉素、β-内酰胺类抗菌药物100%耐药,对其他药物表现为多重耐药。未检出万古霉素耐药菌株。MRSA菌株的SCCmec基因型以SCCmecⅢ型为主,占71.2%,SCCmecⅣa占10.3%,未检测出PVL基因。结论临床分离的SA中,MRSA耐药率较MSSA高且表现为多重耐药,其SCCmec基因分型主要表现为SCCmecⅢ型,其次是SCCmecⅣa。     

金黄色葡萄球菌的药敏表型和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的SCCmec基因分型

目的研究从临床标本中分离的金黄色葡萄球菌(SA)的耐药性、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的发生率及其葡萄球菌盒式染体色mec(SCCmec)基因分型。方法采用纸片琼脂扩散法进行SA耐药性检测及MRSA测定,应用多重聚合酶链反应(PCR)进行SCCmec各基因型及PV杀白细胞素(PVL)基因型的检测。结果 102株SA中检出39株MRSA,检出率为38.2%(39/102)。甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)对克林霉素、复方磺胺甲口恶唑、四环素3种抗菌药物耐药率较高,分别为39.7%、31.7%、22.2%;对庆大霉素及喹诺酮类耐药率较低,为6.3%~14.3%。而MRSA对克林霉素、β-内酰胺类抗菌药物100%耐药,对其他药物表现为多重耐药。未检出万古霉素耐药菌株。MRSA菌株的SCCmec基因型以SCCmecⅢ型为主,占71.2%,SCCmecⅣa占10.3%,未检测出PVL基因。结论临床分离的SA中,MRSA耐药率较MSSA高且表现为多重耐药,其SCCmec基因分型主要表现为SCCmecⅢ型,其次是SCCmecⅣa。     

人regucalcin cDNA高表达重组质粒的构建及其在原核细胞中的表达

目的原核表达获得大量人regucalc in(RGN)蛋白。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)中扩增RGN全长cDNA,将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T,测序鉴定准确后,进行酶切,将正确的RGN全长cDNA与原核表达载体pET42b( )构建成重组质粒pET42b( )-RGN。将pET42b( )-RGN先转化入大肠杆菌DH5α,提取质粒经双酶切鉴定正确后,再转化入表达宿主大肠杆菌DE3菌株。对转化菌株进行诱导、破菌,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹分析,鉴定RGN融合蛋白质表达的正确性。RGN重组融合蛋白经N i2 亲和层析纯化,达电泳纯。结果构建了重组质粒pET42b( )-RGN并获得高效表达,RGN重组融合蛋白经异丙基硫化-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后以包涵体形式存在,表达的蛋白质相对分子质量为34 000。结论人RGN蛋白在pET42b( )原核表达载体可获得高效表达,为进一步了解RGN蛋白质的结构、功能及其抗体的制备等奠定了基础。     

葡萄球菌肠毒素A对人肝癌SSMC7721细胞周期进程及凋亡的影响

目的 体外观察葡萄球菌肠毒素A(SEA)对人肝癌细胞株SSMC7721的增殖抑制作用,旨在为肝癌的治疗提供理论依据.方法 应用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度(0、20、40、80 μg/L)的SEA对SSMC7721细胞的增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞周期进程的变化,荧光显微镜检测细胞凋亡情况.结果 0、20、40、80.μg/L浓度的SEA吸光度(A)值分别为1.52±0.12,1.14±0.13,0.98±0.16,0.82±0.21;根据吸光度值计算SSMC7721细胞增殖抑制率分别为0、(18.4±1.3)％、(35.5±0.9)％、(46.7±1.6)％,多组间经统计学处理,差异有统计学意义(F=4.63,P＜0.05),其他3组与0μg/L组比较,差异均有统计学意义(P均＜0.01);显示不同浓度的SEA对SSMC7721细胞增殖均有抑制作用,且呈剂量依赖性.流式细胞仪检测结果显示:不同浓度的SEA对SSMC7721细胞均有影响,G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,G2/M期细胞相对增多;荧光染色结果显示正常SSMC7721细胞凋亡率为1.0％,而20、40、80μg/L浓度的SEA对SSMC7721细胞凋亡率分别为12.5％、19.4％和23.2％.结论 SEA能显著抑制SSMC7721细胞增殖,抑制SSMC7721细胞Gl期向S期转化进程,诱导SSMC7721细胞凋亡.