顺铂致豚鼠螺旋神经节细胞凋亡及Caspase-3活化的研究

目的：探讨顺铂的耳毒性作用与螺旋神经节细胞（sprial glanglion cell,SGC)凋亡的关系，及SGC的凋亡是否与凋亡蛋白酶Caspase-3信号转导有关。方法：取40只听力正常的豚鼠，随机分为顺铂1、2、4天组和对照组，每天检测听性脑干反应（ABR）和40Hz相关电位以观察豚鼠高，低频的听阈变化，并用TNEL法检测凋亡细胞数量变化，免疫组化检测SGC中Caspase-3p20活性片段的表达。结果：随着注射顺铂时间的延长，豚鼠听力逐渐下降，同时SGC的TUNEL染色明显增强，Caspase-3p20活性片段的表达增高，与对照组比较均有显著性差异（P＜0．01），结论：顺铂的耳毒性损害机制与SGC的凋亡有关；顺铂所致的SGC凋亡过程中有Caspase-3p20的激活。     

顺铂对大鼠耳蜗螺旋神经节细胞外向延迟整流钾电流的影响

目的:观察记录顺铂作用下急性分离新生大鼠耳蜗螺旋神经节细胞(SGNs)延迟整流钾通道的电流曲线,分析顺铂对SGNs钾电流激活动力学的影响,并初步探讨其耳毒性机制。方法:采用全细胞膜片钳技术记录SGNs外向延迟整流钾电流及顺铂对此电流的影响。结果:钳制电压为-60mV,刺激电压从-60mV到 80mV逐渐去极化,阶跃电压为10mV,持续时间为500ms,可在SGNs上记录到外向钾电流,该电流对TEA-Cl(4-乙基胺)敏感,具有延迟整流特性;在细胞外液中加入10μmol/L顺铂,能明显抑制SGNs延迟整流钾电流;顺铂对此电流的抑制作用与细胞外液中顺铂的浓度呈剂量依赖性;外液洗脱后SGNs电流可基本恢复正常。结论:钾通道与SGNs动作电位的产生密切相关,顺铂可抑制SGNs钾通道电流,导致听觉功能障碍。     

顺铂对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞延迟整流钾电流的影响

目的探讨耳毒性药物顺铂对耳蜗螺旋神经节细胞延迟整流钾电流的影响,了解顺铂耳毒性的离子机制。方法选择状态良好培养2—14d的耳蜗螺旋神经节细胞在电压钳制条件下记录的钾电流作为对照组,浴液中分别加入100,500,1000,5000μM不同浓度的顺铂溶液后记录的电流为实验组,观察其对钾通道电流电生理学特性的影响,并观察冲洗后电流的恢复情况。结果实验显示耳蜗螺旋神经节细胞钾通道电流的电生理学特性受不同浓度顺铂溶液的影响,并具有浓度依赖性,表现在其活化动力学和电流幅度的改变。本实验中顺铂的50％的电流被抑制时的浓度（IC50）为294μM,冲洗后钾通道电流逐渐恢复。结论顺铂可以改变耳蜗螺旋神经节细胞钾通道电流的电生理学特性,这种变化在短期内可逆,揭示其耳毒性的形成具有一定的离子机制。     

顺铂作用下沙鼠耳蜗螺旋神经节神经元和Corti器细胞的凋亡

目的　探讨顺铂是否可引起沙鼠耳蜗螺旋神经节 (spiralganglion ,SG)神经元和Corti器细胞的凋亡。方法　对沙鼠进行顺铂连续腹腔注射 ,每日 4mg kg体重 ,分别于健康对照组及给药 4、5、6、7d各处死沙鼠 12只 ,取左侧耳蜗 ,每组动物取 10只耳蜗做平行蜗轴的石蜡切片 ,另 2只耳蜗做底回蜗轴及基底膜超薄切片。通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术 (terminaldeoxynucleotidyltransferase mediateddUTPnickendlabelingmethod ,TUNEL)及透射电镜检测连续用药不同时间后底回SG及Corti器的细胞凋亡情况。结果　连续应用顺铂 5～ 7d ,在透射电镜下可以观察到底回SG神经元及外毛细胞中出现凋亡特征性病理改变 ,TUNEL标记的石蜡切片中可见给药 5d后SG和Corti器出现的阳性细胞明显高于健康对照组 ,给药 6～ 7d阳性细胞进一步增加。结论　细胞凋亡是顺铂损伤沙鼠SG神经元和Corti器细胞的重要方式     

神经营养因子受体在顺铂中毒大鼠耳蜗螺旋神经节中的表达

目的 探讨神经营养因子受体TrkB、TrkC和p75在顺铂中毒大鼠螺旋神经节中的表达及意义.方法 成年Wistar大鼠50只,随机分为对照组(生理盐水5 ml/kg,1次/d,腹腔注射,连续5 d),用药1 d组(顺铂5 mg/kg,腹腔注射),用药3 d组(顺铂5 mg/kg,1次/d,腹腔注射,连续3 d),用药5 d组A(顺铂5 mg/kg,1次/d,腹腔注射,连续5 d,第6天处死),用药5 d组B(顺铂5 mg/kg,1次/d,腹腔注射,连续5 d,第12天处死),每组10只,建立在体顺铂耳毒性模型.通过反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测耳蜗中TrkB、TrkC及p75的mRNA表达最,通过免疫组织化学染色测定TrkB、TrkC及p75蛋白在螺旋神经节巾的表达.结果 成功建立顺铂耳毒性大鼠模型,随着给约时间的延长,TrkB、TrkC和p75在螺旋神经节中的表达呈动态变化.TrkB的mRNA和蛋白表达(x±s,下同)在用药1 d及3 d组分别达到0.76±0.06、88.78±4.28及0.82±0.09、91.64±4.06,与对照组及其他用药组比较差异具有统计学意义(P值均＜0.05);TrkC的mRNA和蛋白表达在用药1 d组达到0.80±0.06和89.66±2.76,与对照组及其他用药纽比较差异具有统计学意义(P值均＜0.05);p75的mRNA和蛋白在对照组和各用药组的表达分别为0.64±0.04、55.16±3.10、0.77±0.04、78.46±3.86、1.01±0.09、105.02±6.61、1.18±0.09、111.10±6.08、0.51±0.04、42.74±±5.20,各用药组与对照组比较差异具有统计学意义(P值均＜0.05).结论 TrkB、TrkC在给药后早期有一过性表达增强,后期表达下降同时听力损失明显,p75在给药后表达逐渐增强.TrkB、TrkC可能参与顺铂中毒性螺旋神经节损伤后的修复过程;p75可能参与顺铂对螺旋神经节细胞的毒性作用,介导神经元凋亡.     

顺铂作用下沙鼠耳蜗螺旋神经节神经元和Corti器细胞的凋亡

目的 探讨顺铂是否可引起沙鼠耳蜗螺旋神经节(spiral ganglion，SG)神经元和Corti器细胞的凋亡。方法 对沙鼠进行顺铂连续腹腔注射，每日4mg／kg体重，分别于健康对照组及给药4、5、6、7d各处死沙鼠12只，取左侧耳蜗，每组动物取10只耳蜗做平行蜗轴的石蜡切片，另2只耳蜗做底回蜗轴及基底膜超薄切片。通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling method，TUNEL)及透射电镜检测连续用药不同时间后底回SG及Corti器的细胞凋亡情况。结果 连续应用顺铂5—7d，在透射电镜下可以观察到底回SG神经元及外毛细胞中出现凋亡特征性病理改变，TUNEL标记的石蜡切片中可见给药5d后SG和Cord器出现的阳性细胞明显高于健康对照组，给药6～7d阳性细胞进一步增加。结论 细胞凋亡是顺铂损伤沙鼠SG神经元和Cord器细胞的重要方式。     

顺铂对耳蜗单离听觉细胞一氧化氮合酶表达的影响

目的 探讨顺铂对耳蜗单离听觉细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS／NOSⅡ)表达的影响。方法 以单离毛细胞和单离螺旋神经节神经元为模型,用免疫组化方法(ABC法)研究顺铂对细胞内NOSⅡ表达的影响。结果 在1mM顺铂平衡盐溶液中室温下培养两小时的外毛细胞及培养半小时的单离螺旋神经元与对照组相比显示了对NOSⅡ抗体较强的免疫反应。结论 提示顺铂诱导了单离外毛细胞及单离螺旋神经元内NOSⅡ的合成增加,NO可能参与了顺铂的耳毒作用。     

顺铂耳蜗毒性作用机制的研究进展

顺铂主要用于治疗头颈部和泌尿生殖系统的恶性肿瘤,内耳毒性是其主要毒副作用之一,防治其毒性是耳鼻咽喉科研究领域的重要课题.目前研究表明,一氧化氮与顺铂耳蜗毒性密切相关.现将顺铂耳蜗毒性机制的研究进展综述如下.     

Localization of Nitric Oxide Synthase Isoforms in the Human Cochlea

The location of nitric oxide (NO) in the structures of the cochlea is a topical issue. Nitric oxide synthase (NOS) has been detected previously in mammalian cochleae, but information on its presence in the human cochlea is still sparse. The location of NOS isoforms I, II and III in substructures of the human cochlea was studied by immunohistochemistry (fluorescein isothiocyanate technique) using monoclonal antibodies to NOS I, II and III. NOS I was the predominant isoform and staining could be observed in cells of the spiral ganglion (SG), in nerve fibres and in the outer hair cells (OHC). Furthermore, the supporting cells of the organ of Corti and the stria vascularis showed a fluorescent reaction to NOS I. Staining for NOS III was less intense and was located in the OHC, supporting cells and SG cells, while the stria vascularis remained unstained. By contrast, NOS II showed weak staining in a few neuron fibres only. The results imply that NO in the human cochlea could act as a neurotransmitter/neuromodulator at the level of neural cells and may be involved in the physiology of the supporting cells and stria vascularis. Moreover, because NO is both a mediator of excitotoxicity and a non-specifically toxic radical, it may also play a role in neurotoxicity of the human cochlea.     

一氧化氮在放射性内耳损伤中的作用

目的 观察放射线对耳蜗功能和形态的损害,探讨放射性内耳损伤中一氧化氮(NO)所起的作用。方法 将24只白毛红目豚鼠随机平均分成对照组和照射组,对照射组豚鼠耳颞部进行60钴γ射线照射,听性脑干电反应(ABR)检测照射前后动物听阈变化并对结果进行统计学分析。电镜观察照射前后耳蜗的超微结构改变,免疫组化法研究耳蜗中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的活性表达。结果 实验前后正常对照组ABR显示听阈无改变;照射组听力明显下降(P<0.01)。电镜结果显示放射线对耳蜗的结构造成明显损害。免疫组化结果显示正常对照组螺旋器呈iNOS阴性染色;照射组的螺旋器呈iNOS强阳性表达。结论 放射治疗对耳蜗可造成损伤,NO的毒性作用可能是放射性内耳损伤重要机制之一。     

不同培养方法对螺旋神经元体外生长的影响

目的 观察不同培养条件下螺旋神经元体外生长情况,获得高纯度螺旋神经元培养物.方法 利用酶消化法、剪切分离结合酶消化法对出生后3～5天的大鼠螺旋神经节进行分离,分别在血清培养基和神经元专用培养基内培养,观察神经元形态及生长情况,并进行免疫组化鉴定.结果 神经元专用培养基比含血清培养基能够得到纯度更高的神经元,且细胞形态良好,轴突再生能力强.结论 酶消化结合剪切分离螺旋神经节,经神经元专用培养基培养,能获得高纯度的螺旋神经元.     

顺铂引起斑马鱼侧线毛细胞凋亡的实验研究

目的　探讨顺铂引起听觉毛细胞的死亡形式。方法　利用模式脊椎动物斑马鱼侧线毛细胞易于处理和观察的优势,通过毛细胞特异性抗体免疫组化、活体染料、长时程活体成像、TUNEL染色以及Caspase-3原位抗体组化方法分别观察顺铂孵育过程中毛细胞形态变化、细胞核断裂情况以及Caspase-3活化情况,为顺铂引发听觉毛细胞的凋亡提供在体实验依据。结果　与对照组相比,顺铂可引起斑马鱼侧线毛细胞90%丢失。长时程成像结果显示毛细胞在死亡过程中会出现逐渐固缩的现象。TUNEL染色结果表明顺铂可引起毛细胞细胞核断裂。Caspase-3抗体原位组化结果显示顺铂可导致毛细胞Caspase-3活化。结论　通过细胞形态追踪、细胞核的断裂情况以及Caspase-3活化情况可得出结论顺铂通过细胞凋亡途径导致斑马鱼侧线毛细胞丢失。     

豚鼠耳蜗一氧化氮合酶异型体的定位

目的研究一氧化氮合酶(NOS)的异型体在豚鼠耳蜗的定位分布,以探讨一氧化氮(NO)在内耳听觉生理和病理生理机制中的作用。方法使用特异性NOS异型体抗体,采用ABC免疫组化染色法,观察NOS异型体在正常豚鼠耳蜗的定位表达。结果NOS Ⅰ主要分布在内骨膜、螺旋神经节的核周体、螺旋韧带和Corti's器的细胞。NOSⅢ是耳蜗的主要NOS异型体免疫染色,其主要免疫染色分布于耳蜗神经、螺旋神经节核周体、螺旋韧带和耳蜗毛细血管球的内皮细胞,也见于Corti's器的细胞和神经纤维。NOS Ⅱ在正常豚鼠耳蜗内不表达。 结论结构型NOS(cNOS)表达在耳蜗的多个部位,表明NO参与内耳的正常生理功能,包括神经突触的神经传导、耳蜗血流的调节和耳蜗的骨代谢。     

噪声性聋小鼠耳蜗螺旋神经节生长相关蛋白-43变化

目的通过噪声引起4周龄昆明小鼠出现暂时性阈移（tmporary threshold shift,TTS）和永久性阈移（permanent threshold shift,PTS）,观察听觉通路耳蜗螺旋神经节神经元（spiral ganglion of cochlea,CG）中生长相关蛋白（growth associated protein 43,GAP-43）变化,探讨听觉损伤后内耳突触修复的可能机制。方法采用32只昆明小鼠制作噪声性聋动物模型,进行听觉脑干诱发反应听力检测,用免疫组化法对耳蜗听觉通路中GAP-43在神经损伤刺激的表达进行检测。结果噪声性聋引起PTS后CG的GAP-43表达在损伤后第7天出现增加,第14天仍增加明显,而TTS组无明显变化。结论噪声性聋听觉通路神经性损伤作用后7天,GAP-43出现增高说明内耳开始出现突触修复。     

Group delay measurement from spiral ganglion cells in the guinea pig cochlea

Summary Measurements of group delay were made extracellularly from spiral ganglion cells in the basal turn of the guinea pig cochlea, using sinusoidally amplitude modulated tones, with constant modulating frequency and modulation depth at the microphone input. Threshold cochlear tuning was accompanied by a frequency dependent group delay, with relative peak proportional to Q₁₀. For sensitive units with steep intensity functions, the group delay decreased with increasing sound pressure level above threshold, without a significant change of Q₁₀.Supported by a grant from the Australian Research Grants Commission to BMJ and a University of Western Australia Research Studentship to AWGPresented at the 18th Workshop on Inner Ear Biology in Montpellier/La Grande Motte, September 14–16, 1981     

血管内皮舒张因子对豚鼠耳蜗功能的影响

目的 探讨血管内皮性一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)对耳蜗电位的影响.方法 健康豚鼠100只,随机等分为10组:①人工外淋巴液组;②L-精氨酸组;③Ca2+-ATP酶抑制剂组;④Ca2+-ATP酶抑制剂+L-精氨酸组;⑤Ca2+-ATP酶抑制剂+环磷酸鸟苷(c...     

缺氧对体外培养耳蜗螺旋神经节细胞及神经纤维的影响

目的:建立耳蜗器官体外培养模型,详细观察缺氧对体外培养耳蜗螺旋神经节细胞(SGC)及神经纤维的影响。方法:分离生后3 d Wistar大鼠耳蜗基底膜,平铺在含有DMEM培养液的培养基内(每盘6条基底膜),2盘为1组,随机分为5组。4组作为实验组,按不同时间段(6 h、12 h、24 h、48 h)进行缺氧(37℃,90%N2,5%CO2,5%O2)培养。1组作为对照组放置在37℃、5%CO2培养箱。用抗神经丝蛋白作为一抗,对耳蜗SGC及神经纤维进行免疫荧光染色。激光共聚焦显微镜下观察缺氧时耳蜗SGC及神经纤维形态变化并计数单位面积(24 mm×36 mm)SGC数即细胞密度。结果:缺氧早期(6 h)神经纤维局灶性水肿,SGC变化不明显。12 h神经纤维局灶性断裂及崩解,SGC减少,细胞密度与对照组相比差异有显著性(P<0.01)。随缺氧时间延长,神经纤维崩解和SGC缺失逐渐加重,48 h神经纤维完全崩解破坏,SGC严重缺失,细胞密度与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。结论:缺氧造成体外培养耳蜗SGC及神经纤维损伤,神经纤维对缺氧更敏感。