鼻咽癌细胞中ezrin基因启动子上游序列转录调控特性的研究

目的:研究鼻咽癌细胞中ezrin基因启动子上游序列的转录调控特性。方法:构建一系列携带ezrin基因-1541/-706序列的报告基因表达载体,ezrin基因-1541/-706序列以正向和反向分别连接至不含启动子的报告基因上游、ezrin启动子上游、SV40启动子上游、ezrin启动子或SV40启动子控制的报告基因下游,将质粒转染CNE2细胞,检测荧光素酶活性。结果:CNE2细胞中,当-1541/-706序列正向位于报告基因上游时表现出启动子活性,其转录激活作用约为ezrin启动子的50%;反向连接时无启动子活性。而且,当-1541/-706序列正向位于ezrin启动子或SV40启动子上游时,显著提高荧光素酶表达;当反向位于启动子下游、正向或反向位于启动子控制的报告基因下游时,转录增强作用消失。结论:CNE2细胞中ezrin基因启动子上游序列具有转录激活和转录增强作用,这种作用具有DNA序列位置和方向依赖性。     

SPA基因启动子的克隆及转录靶向活性分析

目的：克隆大鼠肺表面活性蛋白A（SPA）基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性，为进一步研究SPA 基因的表达调控机制和探讨靶向性基因治疗奠定基础。方法:①从GenBank中获取大鼠SPA 基因序列，对其上游基因组序列进行计算机生物信息学分析，推断其上游序列约163bp的区域具有启动子功能。②利用PCR技术扩增SPA 基因上游启动子序列,将其亚克隆入pGL3-basic 中,构建pGL3-SPA 质粒，将其亚克隆于pGL3-control 中，构建pGL3-SPA-enhancer 质粒。③将构建pGL3-SPA质粒、pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-control质粒和pGL3-basic 质粒分别与内参质粒pRL-TK共转染入A549细胞和H441细胞, 用双荧光素酶报告系统检测该质粒在两种细胞中的荧光素酶活性表达。 结果:酶切及测序结果均证实成功克隆了SPA基因启动子序列,并已将该序列正确插入到荧光素酶报告基因系列载体中。重组的pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-SPA质粒转染H441 细胞后可以检测到荧光素酶的高表达。结论:成功构建了含有SPA 基因启动子序列的荧光素酶基因报告系统,证实了它在高表达SPA蛋白的细胞中有较高的转录活性， 为下一步研究SPA 基因功能及其转录调控以及探讨基因治疗的靶向性奠定了基础。     

pGL3-Claudin-1 promoter荧光素酶报告基因质粒的构建及其功能鉴定

背景：Claudin-1是一种多功能蛋白,除了组成紧密连接封闭细胞间隙,它在转录水平的表达失调可能作为一种分子标志反映到恶性肿瘤的侵袭转移和预后中。 目的：构建重组大鼠重组Claudin-1萤光素酶报告基因质粒。 方法：设计和合成包含5’非转录区的约2 000 bp的脱氧核糖核酸链,经过限制性内切酶KpnⅠ和MluⅠ酶切后插入到pGL3-Basic载体中,并用感受态E.coli DH5α和Pmd18-T-simple载体筛选阳性样品。阳性克隆通过测序和PCR证实。实验分为4组：对照组,阳性对照组(pGL3-promoter质粒转染),阴性对照组(转染pGL3-Basic质粒),实验组(转染pGL3-Claudin-1 promoter质粒)。将质粒转染293T细胞检测Claudin-1启动子活性。 结果与结论：重组质粒DNA测序结果采用NCBI blast比对与GenBank(gi|62750811)中大鼠Claudin-1基因启动子序列完全匹配。重组萤光素酶报告基因转录活性检测与pGL3-Basic质粒相比,重组pGL3质粒转录活性明显增强 (P < 0.001)。经过测序和转染结果证实有效的pGL3-Claudin-1启动子质粒构建成功。     

重组Ad-Cp-CDglyTK双自杀基因腺病毒载体构建及体外抑制鼻咽癌细胞的实验研究

目的：构建含EB病毒Cp启动子的CDglyTK双自杀基因靶向腺病毒载体 Ad-Cp-CDglyTK，探讨Cp启动子能否特异性调控自杀基因在转染鼻咽癌细胞中表达及靶向性治疗鼻咽癌的可行性。方法：采用pDC316穿梭质粒系统，高保真PCR扩增tk、 cd、 Cp等基因序列，采用定向克隆方法构建含Cp启动子的双自杀基因pDC316-CP-CDglyTK重组质粒，经DNA测序、酶切法鉴定所构建质粒，在293细胞中进行重组腺病毒Ad-Cp-CDglyTK包装、扩增、纯化与病毒滴度测定，体外转染鼻咽癌细胞株CNE1与正常鼻咽NP69细胞株，RT-PCR法检测转染细胞中CDglyTK基因的表达，MTT法观察Ad-Cp-CDglyTK/GCV+5-FC系统对CNE1细胞株的体外杀伤作用。结果： 经DNA测序、限制性酶切法分析显示pDC316-Cp-CDglyTK含完整正确的tk、cd、Cp基因序列，在293细胞中包装扩增后病毒滴度为5.6×1012 TCID50/L，体外转染鼻咽癌CNE1细胞株与正常鼻咽NP69细胞株后，采用RT-PCR法从CNE1细胞株总RNA中扩出Cp片段，而NP69细胞株未检测到相应基因mRNA表达，MTT结果显示经前体药物处理转染后CNE1细胞株与NP69细胞株，5-FC+GCV联合用药较单一前体药物对CNE1细胞具有更强的抑制作用（P＜0.05），联合用药对NP69细胞株未见明显杀伤作用。结论： Cp启动子可以特异性调控CDglyTK融合自杀基因在鼻咽癌细胞株(CNE1)中表达，融合自杀基因/前药系统较单一基因对鼻咽癌细胞具有更强的杀伤作用。     

特异性hTERT启动子在肿瘤细胞中启动效率研究

目的证明人端粒酶亚单位（hTERT）启动子可以引导目的基因在肿瘤细胞中表达。方法先使用RT-PCR检测各细胞系中hTERT mRNA的表达,再使用PCR方法扩增hTERT启动子基因的不同长度片段,并构建重组质粒,使用BglⅡ和HindⅢ双酶切鉴定重组质粒并测序。最后使用Dual-Glo Luciferase Assay System激发荧光检测各细胞系中重组质粒中hTERT启动子的启动效率。结果 pGL3-204、pGL3-378、pGL3-1375重组质粒中的hTERT启动子序列与预期一致,质粒构建成功。hTERT启动子引导荧光基因的重组质粒在H460中启动效率最强可以达到SV40启动子的80%,而在FRO、U251中启动效率可以达到SV40启动子的30%左右。hTERT全长启动子序列的启动效率在ARO细胞系中比pGL3-204、pGL3-378中的启动子片段启动效率强,而在FRO、H460和U251细胞系中pGL3-204中的启动子片段启动效率最强。结论 hTERT启动子引导荧光基因的重组质粒,可以实现只在肿瘤细胞系中表达,但在正常细胞中不表达的效果。     

错配修复基因hMLH1启动子萤光素酶报告基因载体的构建与鉴定

 目的：构建含hMLH1启动子片段的萤光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素诱导下的转录活性。方法：以正常人基因组DNA为模板,PCR扩增hMLH1启动子片段（-1953/+53）,插入萤光素酶报告基因载体pGL3-Basic,将重组质粒转入HEK293细胞,检测在有和无雌激素诱导下萤光素酶的活性变化。结果：酶切和测序结果证实重组萤光素酶报告基因载体pGL3-Promoter1-luc构建成功。转染pGL3-Promoter1-luc后,雌激素诱导的萤光素酶活性为7.45±0.81,显著高于无水乙醇组的3.28±0.19 (n=3,P<0.001)。结论：hMLH1启动子片段存在与雌激素相关的调控序列。     

Therapeutic anti-tumor effect of exogenous apoptin driven by human survivin gene promoter in a lentiviral construct

Introduction

The aim of this study was to construct a lentivirus vector with survivin promoter (pSur)-driven apoptin and test its efficiency in suppressing the growth of tumor cells.

Material and methods

Expression cassettes with different fragments of survivin gene promoter (pSur, 161 bp, 272 bp, 990 bp) driving 6XHis-tagged apoptin were constructed to generate recombinant lentivirus, of which the inhibitory effect on tumor cells was compared. The activity of different pSur in 293FT, and 272 bp pSur in primary bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), SW480, Hela and MCF-7 was examined by Western blot. Their ability to induce apoptosis in SW480 cells was determined by annexin-V staining. The inhibitory effect of letivirus containing different pSur-driven apoptin on nude mice-xenografted SW480 cells was assessed by tumor size and pathological observation.

Results

The 272 bp and 990 bp pSur displayed comparable effects in terms of promoter activity, cell apoptosis/necrosis and G1 phase arrest in vitro, and growth of xenograft tumor in vivo. When lentivirus containing 272 bp pSur was tested, it drove high apoptin expression in tumor cells (SW480, Hela and MCF-7) and weak expression in primary bone marrow mesenchymal stem cells. Xenograft to nude mice using infected Sw480 cells showed that lentiviruses possessing 272 bp and 990 bp pSur were able to significantly induce tumor cell death, focal necrosis, and tumor growth lag.

Conclusions

The data indicated that pSur-apoptin expression cassette in lentivirus vector ensures specific suppression of tumor cells, and may be applicable to monitor malignant transformation of transplanted cells.     

利用合适的启动子提高外源基因在Jurkat细胞中的表达

目的通过选择合适的启动子来实现外源基因在Jurkat细胞中的高效表达。方法以pGL3-MCS质粒为基础构建不同启动子(SV40、CMV、EF1α和UbC)驱动萤火虫荧光素酶Fluc报告基因表达的重组质粒,并将其与作为内参的表达海肾荧光素酶Rluc报告基因的质粒共转Jurkat细胞,检测Jurkat细胞中这两种荧光素酶与相应底物反应所产生的荧光强度,计算Fluc与Rluc荧光强度的比值即Fluc的相对酶活,通过比较Fluc相对酶活的大小来选取在Jurkat细胞中具有高表达活性的启动子。结果以pGL3-MCS质粒为基础成功构建了不同启动子驱动Fluc报告基因表达的重组质粒pGL3-CMV、pGL3-EF1α和pGL3-UbC。在Jurkat细胞中,不同启动了驱动的Fluc报告基因的相对酶活的强弱关系为pGL3-UbCpGL3-EF1αpGL3-CMVpGL3-MCS。结论可以选择高活性的人源泛素C启动子实现外源基因在Jurkat细胞中的高效表达,以利于Jurkat细胞系在哺乳动物T淋巴细胞以及免疫相关功能研究中的应用。     

干扰素调节因子3 rs2304204野生型及突变型重组质粒的构建及活性分析

目的构建干扰素调节因子3（IRF-3）rs2304204野生型及突变型重组质粒并比较二者启动子活性。为进一步研究IRF-3对HBV感染的影响打下基础。方法以人全血DNA为模板,扩增含rs2304204位点的IRF-3启动子区1355bp目的序列,插入pGL3-Basic载体中,构建rs2304204野生型的重组质粒（wIRF-3）。以wIRF-3为模板,利用基因定点突变试剂盒构建rs2304204突变型重组质粒（mIRF-3）。wIRF．3、mIRF-3和pGL3-Basic质粒分别转染HEK293细胞,采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性,并计算荧光素酶相对活性单位（RLU）。结果成功构建IRF-3rs2304204野生型及突变型重组质粒,且wIRF-3质粒转染组RLU明显高于mIRF-3质粒转染组（P〈0．005）。结论野生型重组质粒的启动子活性明显高于突变型重组质粒,启动子活性的不同可能进而影响机体抗HBV感染的临床结局。     

Genistein ameliorates parathyroid hormone-induced epithelial-to-mesenchymal transition and inhibits expression of connective tissue growth factor in human renal proximal tubular cells

Introduction

Genistein, a soybean and soy-based product, has been reported to inhibit the growth of a wide range of cancer cells, but there is no evidence concerning its treatment of chronic kidney disease. The aim was to investigate whether genistein has potential to inhibit parathyroid hormone (PTH)-induced renal interstitial fibrosis.

Material and methods

Using human renal tubular epithelial HK-2 cells, α-smooth muscle actin (α-SMA) was assessed by using immunofluorescence detection. α-Smooth muscle actin, E-cadherin and connective tissue growth factor (CTGF) were measured by Western blot analysis. The promoter activity of the CTGF gene was examined by the luciferase reporter assay.

Results

When cells were treated with PTH (0.1 nM) for 48 h, α-SMA protein expression was induced significantly, the protein expression of E-cadherin decreased substantially, and the promoter activity of the CTGF gene as well as its mRNA and protein expression levels increased (p < 0.01). Interestingly, genistein effectively inhibited PTH-induced α-SMA expression, restored E-cadherin expression, decreased mRNA and protein expression of CTGF, and suppressed the promoter activity of CTGF in a dose-dependent manner.

Conclusions

Genistein has the ability to block the biomarker for renal transdifferentiation and epithelial-to-mesenchymal transition, α-SMA, following PTH treatment and inhibit CTGF expression in human renal tubular epithelial cells; these might be important modes of actions that contribute to genistein anti-fibrogenic effects and may have great implications for its potential in clinical treatment of renal interstitial fibrosis.     

HCV核心蛋白抑制SFRP1基因启动子活性

 目的 探讨HCV 核心蛋白对Wnt信号通路抑制分子SFRP1启动子活性的影响。方法 以人肝癌细胞系Huh7基因组为模板,扩增SFRP1启动子区不同片段(-407～-27bp, -837～-27bp, -1202～-27bp, -1619～-27bp, -2029～-27bp),以pGL3-Basic为载体分别构建SFRP1启动子区截短报告质粒。将构建好的质粒与pRL-TK共转染HEK293细胞,确定启动子区活性最强区域;分别用编码HCV 核心蛋白的腺病毒或GFP对照腺病毒感染已转染重组报告质粒的SK-Hep1细胞,观察AdCore对SFRP1启动子活性的调控作用。结果 SFRP1启动子区域-407～-27bp片段活性最强;与pGL3-Basic对照组相比较,相对荧光素酶活性增加了37.31±4.45倍(P<0.01),pGL3-S2～S5的活性分别增加了28.74±2.47、13.56±2.52、12.97±0.87和8.29±0.09倍(P<0.01);HCV Core蛋白能够抑制SFRP1基因启动子区活性,其对pGL3-S1的抑制作用最强,与GFP对照组相比较,抑制率为63.8%±1.0% (P<0.01)。结论 HCV核心蛋白通过抑制SFRP1启动子区活性下调SFRP1基因的表达,可能参与Wnt/β-catenin信号通路的活化,并与原发性肝癌的发生密切相关。     

乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白对病毒自身调控序列的影响

目的 研究双剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接变异体特异性蛋白TPds对病毒自身调控序列的影响.方法 PCR扩增6种HBV启动子/增强子序列,以Kpn Ⅰ及Xho Ⅰ位点克隆于pGL3-basic,分别构建萤火虫荧光素酶重组报告载体pGL3-BCP(含HBV基本核心启动子)、pGL3-CP1601(含增强子Ⅱ的核心启动子)、pGL3-XP(X基因最小启动子)、pGL3-XP1071(含增强子Ⅰ的X基因启动子)、pGL3-SP1(表面抗原大蛋白基因启动子)、pGL3-SP2(表面抗原中蛋白基因启动子).以FuGENE6将TPds表达载体pcDNA3.1/HisC-TPds或空白载体pcDNA3.1/HisC分别与6种HBV启动子/增强子报告载体共转染Huh7细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性,实验重复5次,数据以SPSS11.5软件分析.结果 在一定的质量比值范围内,与pcDNA3.1/HisC空白载体对照相比,pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-CP1601、pGL3-XP1071、pGL3-SP1、pGL3-SP2共转染后,Huh7细胞内萤火虫荧光素酶活性增高,而pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-BCP或pGL3-XP共转染后,胞内荧光素酶活性无变化.结论 TPds蛋白可反式激活HBV启动子SP1、SP2和增强子Ⅰ、Ⅱ,对基本核心启动子和X基因最小启动子无影响.     

重组法国梧桐花粉过敏原2( rPla a2) 对诱导型一氧化氮合酶( NOS2)基因启动子活性及基因表达的影响

目的:构建人诱导型一氧化氮合酶(NOS2)基因启动子区,对NOS2 启动子序列进行鉴定并分析其活性;探索重组法国梧桐花粉过敏原2(rPla a2)对人NOS2 基因启动子活性及基因表达的影响。方法:利用PCR 扩增、限制性内切酶双酶切、DNA 连接酶连接、大肠杆菌转化等方法将NOS2 基因启动子区克隆至pGL3-Basic 载体上,将所构建重组报告质粒转染至人胚肾(HEK293T)细胞中,利用双荧光素酶活性分析检测该重组报告质粒启动子活性及检测rPla a2 对人NOS2 基因启动子活性的影响;用实时荧光定量PCR 法检测rPla a2 对人NOS2 基因mRNA 水平的影响。结果:成功构建含有NOS2 启动子的重组报告质粒,与对照(pGL3-Basic) 组相比,含NOS2 启动子区的重组质粒转染组荧光素酶活性显著增高;与不加刺激(NOS2)组相比,加入rPla a2 刺激后含NOS2 启动子区的重组报告质粒转染组荧光素酶活性显著增高,加入rPla a2 刺激后NOS2 mRNA 相对表达水平显著增高。结论:rPla a2 可增强人NOS2 基因启动子活性,并增加其基因表达。     

鼻咽癌STGC3基因转录调控元件分析与鉴定*

目的：分析并鉴定STGC3基因转录调控元件,探讨鼻咽癌STGC3基因的转录调控分子机制。方法：运用 生物信息学,预测并分析STGC3基因核心启动子区的转录因子结合位点;将相关转录因子结合位点,制备3 种探 针即生物素标记野生型、突变型及未标记野生型;提取CNE2细胞核蛋白,利用电泳迁移率变动分析（ EMSA） 及染色质免疫共沉淀（ ChIP）分析,体内外鉴定转录因子结合位点。结果：在STGC3基因核心启动子区存在21 个转录因子结合位点,其中9 个为Sp1 转录因子结合位点;进一步严格限定参数,STGC3基因核心启动子区域含 有转录因子结合位点5 个,其中Sp1 转录因子结合位点2 个;EMSA和ChIP 实验结果显示,STGC3基因中存在转 录因子Sp1 特异性结合位点,从而鉴定出STGC3基因转录调控元件。结论： STGC3基因核心启动子区含有Sp1 特异性结合位点,为该基因的转录调控元件。     

NOX4报告基因重组质粒的构建及表达调控初探

目的：构建NOx4荧光素酶报告基因质粒载体,探讨NOX4基因表达调控机制。方法：以细胞基因组DNA为模板作,采用PCR扩增NOX4基因上游调控序列（533bp）,插入质粒DGL3-basic载体,构建重组质粒pGL3-NOX4,重组质粒经酶切和测序鉴定。将pGL3-NOX4转染A549细胞,通过细胞因子刺激观察报告基因表达水平。结果：酶切及测序证实NOX4报告基因质粒构建成功。转染报告基因的A549细胞以细胞因子刺激,结果显示NOx4表达增强。结论：成功构建了NOX4荧光素酶报告基因质粒载体,为进一步研究NOX4基因的表达规律及生理功能奠定了基础。     

人Egr-1启动子的克隆及其在肿瘤细胞中的辐射诱导反应

目的:克隆人Egr-1基因的启动子, 插入荧光素酶报告基因载体中, 并检测电离辐射对其活性的影响.方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出Egr-1启动子, 将其克隆到pGL3-basic载体中;将重组质粒转染人肿瘤细胞, 测定Egr-1启动子在不同辐射条件下转录活性的改变.结果:成功构建了Egr-1启动子的荧光素酶报告基因;在不同剂量的γ射线照射后, Egr-1的启动子活性均明显高于未照射组;在同一剂量照射后48 h, Egr-1的启动子活性达峰值.结论:本实验构建的Egr-1启动子具有辐射激活的功能, 为进一步研究放射-基因治疗奠定了基础.     

小鼠BCMA基因启动子活性研究

目的:探索B淋巴细胞成熟抗原(BCMA)基因5′上游序列的启动子活性, 为进一步研究BCMA基因的表达调控机制提供实验依据.方法:构建由BCMA基因5′上游-820～ 145、 -607～ 145、 -359～ 145、 -157～ 145、 -93～ 145 5个片段驱动的荧光素酶报告载体pGL3-B820、 pGL3-B607、 pGL3-B359、 pGL3-B157、 pGL3-B93, 通过转染J558L、 293T、 HeLa细胞检测荧光素酶的表达, 观察荧光素酶相对活性.结果:5种5′删除体的转录激活性由大到小为pGL3-B157>pGL3-B607>pGL3-B359>pGL3-B93>pGL3-B820.pGL3-B157在3种细胞中的转录激活能力为J558L>HeLa>293T, 且在J558L中的转录激活能力明显强于Hela和293T细胞.结论:BCMA基因5′上游序列"-820 bp～ 145 bp"具有启动子活性, 核心启动子可能位于-93～ 145区域中.     

阴道毛滴虫LAG1基因启动子区克隆及分析

本研究旨在克隆并分析阴道毛滴虫LAG1基因启动子,为进一步研究在细胞衰老过程中LAG1基因的转录调控提供实验资料。预测启动子所在区域,用PCR技术扩增启动子区序列,并分别克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic及增强型绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1,用脂质体介导的方法瞬时转染EC109细胞,然后测定荧光素酶表达活性及观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明在构建的6种荧光素酶报告基因表达体系及2种增强型绿色荧光蛋白报告基因表达体系中,表达载体pGL3-455(-455~ 55bp)、pGL3-417(-417~ 55bp)、pGL3-280(-280~ 55bp)、pGL3-202(-202~ 55bp)、pGL3-81(-81~ 55bp)的荧光素酶表达活性相近,均明显高于表达载体pGL3-47(-47~ 55bp)荧光素酶表达活性,而pGL3-47表达载体荧光素酶表达活性极低,与阴性对照活性相近,提示-47~ 55bp区无启动子活性。绿色荧光蛋白的表达情况也类似,pEGFP-81(-81~ 55bp)有明显的绿色荧光蛋白表达,而pEGFP-47(-47~ 55bp)和空载体pEGFP-1未见表达。因此-81~-47bp区域含有阴道毛滴虫LAG1基因转录所必需的基本启动子序列。     

乙型肝炎病毒X蛋白通过降低P4启动子甲基化水平上调人IGF-II基因的转录

目的:构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝癌细胞株HepG2-HBx,探讨HBx对胰岛素样生长因子 II(IGF-II)基因P4启动子甲基化水平及转录表达的影响。方法:应用基因重组技术,构建含HBx基因的重组逆转录病毒载体pBABE-puro-HBx,采用磷酸钙共沉淀法将其转染293FT包装细胞产生逆转录病毒,感染HepG2肝癌细胞,采用嘌呤霉素进行阳性克隆筛选,Western blotting鉴定表达HBx蛋白的肝癌细胞株HepG2-HBx。采用亚硫酸氢盐测序法及实时荧光定量RT-PCR检测HepG2-HBx细胞中P4启动子甲基化水平及P4 mRNA表达水平变化。进一步将体外甲基化的人IGF-II基因P4启动子驱动的荧光素酶报告载体pGL3-P4及含HBx基因的pCMV-tag2B-X质粒共转染HepG2肝癌细胞,采用亚硫酸氢盐测序法及双萤光素酶实验检测pGL3-P4载体上P4启动子甲基化水平及转录调控活性变化。结果:(1)经Western blotting鉴定,成功构建了稳定表达HBx蛋白的肝癌细胞株HepG2-HBx;(2)表达HBx蛋白的HepG2-HBx细胞中P4启动子甲基化CpG位点的比例(9.0%)明显低于对照细胞HepG2-control(25.0%)(P<0.01),而其P4 mRNA表达水平则为对照细胞HepG2-control的2.8倍;(3)共转染pCMV-tag2B-X质粒的HepG2细胞中pGL3-P4载体上P4启动子甲基化CpG位点的比例(60.8%)明显低于共转染对照质粒pCMV-tag2B的HepG2细胞(84.1%)(P<0.01),而前者P4启动子相对萤光素酶活性(14.12±0.89)则明显高于后者(4.61±0.76)(P<0.01)。结论:HBx蛋白可降低IGF-II基因P4启动子甲基化水平,进而上调其转录表达。     

IPO8基因启动子区rs35100176位点变异对基因表达的影响

 目的：研究人importin 8（IPO8）基因启动子区rs35100176多态性位点CCT插入/缺失对基因表达的影响。方法：PCR扩增IPO8基因启动子区包含rs35100176多态位点的342 bp序列,通过测序获得了49例DNA样本的基因多态性分布。以CCT/CCT插入纯合子或-/-缺失纯合子DNA样本为模板,扩增含有不同插入/缺失序列的IPO8基因启动子片段,插入萤光素酶报告质粒pGL3-Basic,构建pGL3-3N Insertion 和pGL3-3N Deletion重组表达载体。重组质粒经Fugene 6.0转染入细胞,采用双萤光素酶报告系统,检测携带不同多态性序列的重组质粒中报告基因的表达活性;real-time PCR检测各不同基因型细胞中IPO8 mRNA表达。结果：通过测序发现rs35100176多态位点存在CCT/CCT、CCT/-和-/- 3种表型,其基因分布频率分别为1837%、5510%和2653%。成功构建pGL3-3N Insertion和pGL3-3N Deletion重组表达载体。双萤光素酶报告基因活性检测结果显示,pGL3-3N Insertion启动下游报告基因表达的相对活性与pGL3-3N Deletion相比显著减弱,两者存在显著差异（P<005）;real-time PCR结果显示,CCT纯合插入的HEK293细胞中IPO8 mRNA的表达显著低于CCT纯合缺失的Saos-2细胞。结论：IPO8基因启动子区rs35100176位点的CCT碱基插入变异能显著抑制启动子活性,从而影响IPO8基因的转录。