microRNA-196a2单核苷酸多态性对靶基因IL-2表达的影响

目的观察基因单核苷酸多态性（SNP）对成熟microRNA（miRNA）-196a2在人角质形成细胞HaCaT细胞中表达水平的影响,及对预测的靶信使RNA（mRNA）IL-2 3＇非翻译区（UTR）结合能力的影响,探讨miRNA-196a2 SNP是否与皮肤病等自身免疫性疾病关联。方法在HaCaT细胞中转染构建miR-196a2-T（野生型）和miR-196a2-C（突变型）的表达质粒,RT-PCR检测表达效果;将两种基因型的表达质粒与预测的靶mRNA IL-2 3＇UTR的报告基因质粒共转染细胞,双荧光素酶报告基因实验分别检测结合能力,并使用SPSS17.0软件统计分析。结果成功构建miR-196a2-T/C表达质粒和IL-23＇UTR报告基因质粒;miRNA-196a2野生型和突变型的表达质粒在HaCaT细胞中的表达水平无显著差异（P〉0.05）;IL-2是miR-196a2的靶基因,SNP影响miR-196a2与IL-2 3＇UTR的结合（P〈0.05）。结论 MiR-196a2可与IL-2结合调节其转录后水平,从而参与免疫反应,可能影响多种皮肤病等自身免疫性疾病的进程。     

小鼠DUSP1 3’-UTR双荧光素酶报告基因表达系统的建立及功能鉴定

目的 建立小鼠双特异性磷酸酶1(DUSPl)3’端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因表达系统,并对其进行功能鉴定.方法 提取RAW264.7细胞总RNA并反转录为cDNA,以其为模板通过PCR扩增获得小鼠DUSP1 3'-UTR全长序列,酶切后克隆至pGL3-control载体荧光素酶编码基因的下游,获得重组载体LuDP,经PCR、限制性内切酶酶切、DNA序列分析鉴定正确后与内参照质粒pRL-TK共转染NIH3T3细胞,48h后检测双荧光素酶报告基因的表达.将含有小鼠DUSP1 3’-UTR的荧光素酶表达模块与来源于pRL-TK质粒的RL表达模块克隆至pLenti6-TR质粒中,获得双荧光素酶报告基因表达载体LuDP/RL,将其与RNA结合蛋白HuR表达载体(pcDNA3.1-HuR-FLAG)、mmu-miR-101a分别共t转染NIH3T3细胞,检测双荧光素酶的活性,分析HuR、mmu-miR-101对荧光素酶基因表达活性的影响.结果 成功构建了双荧光素酶报告基因表达载体.小鼠DUSP1 mRNA 3'-UTR可显著下调与其相连的荧光素酶的表达活性(0.14±0.01倍,P＜0.01);共转染HuR可上调荧光素酶的表达活性(1.40±0.20倍,P＜0.05),共转染mmu-miR-101a则可下调荧光素酶表达活性(0.57±0.18倍,P＜0.05).结论 成功构建了DUSP1 3’-UTR双荧光素酶报告基因表达系统,该系统可用于转录后调控元件对小鼠DUSP1基因表达的调控机制研究.     

基于报告基因的PPRE转录调节模型的建立及应用

目的:建立基于报告基因的靶向PPRE的转录调节模型,并观察不同浓度的PPAR特异性配体对上述模型的影响.方法:PCR扩增获得乙酰辅酶A氧化酶(ACO)启动子上包含PPRE的片段,构建重组报告质粒pGL3-PPRE,将此质粒单独或与PPARα或γ的真核表达质粒(pSG5-PPARα、pSG5-PPARγ)共转染到HEK293细胞中,通过测定荧光素酶(Luc)活力来分析非诺贝特对PPARα激活的作用以及吡格列酮和15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)对PPARγ途径的影响.结果:在pGL3-PPRE和pSG5-PPARα共转染的HEK293细胞中,荧光素酶的表达受非诺贝特的诱导,并呈现一定的剂量依赖关系;在共转染pGL3-PPRE和pSG5-PPARγ的HEK293细胞中,荧光素酶的表达则受吡格列酮、15d-PGJ2的诱导,也呈现一定的剂量依赖关系.结论:在HEK293细胞中建立了基于报告基因的PPRE转录调节模型,用此模型可以进行PPARα或γ配体的筛选.     

E4F1真核表达载体的构建及与p53的相互作用

目的：构建E4 F1野生型及缺失32～81位氨基酸的真核表达载体,检测其与p53的相互作用及对下游基因p53的调节。方法分别用普通PCR和重组PCR方法从乳腺文库中扩增E4F1野生型编码序列及缺失32～81位氨基酸的突变型序列,分别将其以正确相位构建到pXJ40-MYC载体中,得到重组质粒MYC-E4F1和MYC-E4F1（Δ32-81）,分别转化大肠杆菌DH5α,重组质粒经酶切鉴定并转染293 T细胞, Western印迹检测蛋白的表达。将MYC-E4F1和MYC-E4F1（Δ32-81）质粒与FLAG-p53质粒共转染293T 细胞,免疫共沉淀实验检测其相互作用,野生型及缺失突变型表达载体共转染骨肉瘤细胞U2OS,检测其对下游基因p53的调节。结果 E4F1重组质粒及其突变型构建成功,在293 T细胞中鉴定表达正确,野生型及突变型E4 F1均与p53存在相互作用,突变型的结合能力增强,野生型E4F1升高p21蛋白表达水平,而突变型不改变p21蛋白水平。结论成功构建E4F1野生型及缺失32～81位氨基酸的突变型真核表达载体,二者都能与p53相互作用且突变型结合能力更强,野生型E4F1升高基因p53的靶基因p21的蛋白表达水平,而突变型不改变靶基因p21的蛋白水平。该研究为进一步研究E4 F1对p53的调节及其机制奠定了基础。     

miR-193b在HepG2细胞中下调K-Ras蛋白表达

目的探讨microRNA-193b（miR-193b）在HepG2细胞中对K-Ras蛋白表达的调控作用。方法 Tar-getScan软件预测获得miR-193b调控候选靶基因K-ras;构建包含预测miR-193b作用靶位点的K-rasmRNA3′UTR野生型和突变型荧光素酶报告基因载体pGL-KRAS和pGL-Mu-KRAS,检测转染HepG2细胞的荧光素酶活性;合成miR-193b的dsRNA,转染HepG2细胞,实时定量PCR和Western印迹检测对K-rasmRNA和蛋白表达的影响。结果与结论 miR-193b可以与K-rasmRNA3′UTR结合。在HepG2中,miR-193b在mRNA和蛋白水平下调K-ras基因表达。     

人野生型和突变型CITED2真核表达质粒的构建与表达

目的 构建人转录辅助因子CITED2突变型(c.573-578del6)及野生型真核表达质粒并检测两种重组质粒CITED2蛋白的表达情况.方法 分别以健康儿童和CITED2基因突变的先天性心脏病患儿血细胞DNA为模板,PCR定向克隆扩增野生型和突变型CITED2编码链,分别T/A克隆至pMD19-T simple质粒上,筛选出野生型和突变型CITED2的T载体重组质粒.应用DNA重组技术将T载体重组质粒上的CITED2基因片段亚克隆入真核表达载体pEGFP-C1,构建pEGFP-C1-wtCITED2和pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒,并分别转染至HEK293细胞,24h后在荧光显微镜下观察质粒转染情况,48h后应用流式细胞仪检测转染效率,Western blotting检测CITED2蛋白的表达.结果 成功构建了人野生型pEGFP-C1-wtCITED2和突变型pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒.转染至HEK293细胞后24h,在荧光显微镜下可观察到各转染组EGFP的表达,转染后48h流式细胞仪检测转染效率为50％ ～ 60％,Western blotting检测可见CITED2蛋白与EGFP的融合表达.结论 成功构建了人转录辅助因子CITED2突变型及野生型真核表达质粒,并检测到CITED2蛋白的表达.     

ABRACL基因启动子不同片段重组质粒构建及转录活性研究

目的 构建肌动蛋白结合Rho激活C末端样（ABRACL）基因启动子不同截短片段重组质粒,并检测其转录活性。方法 以含ABRACL启动子全长质粒为模板,利用PCR方法分别扩增ABRACL启动子不同截短片段;将扩增片段分别插入pGL3.0-basic载体,构建ABRACL启动子不同截短片段重组质粒;经双酶切及序列鉴定正确后,将重组质粒转染ZR75-1和A549细胞,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定ABRACL启动子不同截短片段的双荧光素酶活性;检测转录因子MYB原癌基因样2(B-MYB)对ABRACL启动子不同截短片段转录活性的影响。结果成功构建含ABRACL基因启动子不同截短片段重组质粒,双荧光素酶活性测定发现ABRACL基因启动子-400 bp片段活性较高,转录因子B-MYB可以增强ABRACL启动子-600 bp和-1000 bp片段的活性。结论 发现ABRACL基因启动子转录活性较高区域,为进一步研究ABRACL基因上游调控机制奠定基础。     

miR-9对神经纤毛蛋白-1的靶向调控及其在辐射效应中的作用

目的：构建has-miR-9表达质粒和NRP1-3’UTR荧光素酶报告质粒,探讨miR-9对 NRP1的靶向调控作用及其在A549 细胞中的辐射效应。方法：利用生物信息学方法预测has-miR-9与NRP1-3’UTR的结合位点;将miR-9序列插入载体pcDNA-DEST47中构建真核表达质粒,同时构建NRP1-3’UTR的野生型和突变型荧光素酶报告质粒,并与pcDNA-DEST-miR-9质粒共转染至A549细胞,分析miR-9对其调控作用;miR-29b作为阴性对照,观察miR-9对NRP1的靶向作用。采用Western blot方法,验证miR-9对NRP1蛋白表达的抑制作用及照射后A549细胞NRP1蛋白表达变化;采用实时定量PCR方法检测10 Gy电离辐射照射后A549细胞miR-9表达量。结果：荧光素酶活性实验结果显示,miR-9可以显著下调野生型NRP1-3’UTR质粒的荧光素酶活性（t=3.906,P<0.05）,而不影响突变型质粒的荧光素酶活性,同时证实miR-9以外的miRNA（miR-29b）不能抑制野生型NRP1-3’UTR质粒的荧光素酶活性。转染miR-9 mimic后,在A549细胞中,靶基因NRP1蛋白的表达受抑制。10 Gy照射后,A549细胞中miR-9表达量下调（t=37.319,P<0.05）,而NRP1蛋白表达升高。结论：在A549辐射效应中miR-9通过靶向结合NRP1基因3’UTR,特异性调控NRP1蛋白表达。     

辐射诱导的野生型及突变型PTEN基因重组质粒的构建及鉴定

目的构建辐射诱导人野生型及突变型PTEN基因重组质粒并进行鉴定。方法以HeLa细胞总DNA为模板PCR扩增Egr-1基因启动子辐射敏感区,将PCR产物分别定向插入携带野生型PTEN和突变型PTEN蛋白编码基因的表达载体pEGFP-PTEN和pEGFP-PTEN-G129E启动子区,构建具有辐射诱导能力的重组表达质粒pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E。同时,将Egr-1基因启动子辐射敏感区亚克隆入pGL3-Promoter载体中,通过荧光素酶报告实验,验证不同照射剂量、照射后不同时间点下人肝癌SMMC-7721细胞中Egr-1启动子区对X线照射的辐射诱导能力。Western印迹检测X线照射对PTEN蛋白表达的影响。结果凝胶电泳分析证实,PCR扩增出Egr-1基因启动子辐射敏感区,构建出具有辐射诱导能力的重组表达质粒pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E,经不同酶切实验均证实含有与Egr-1辐射诱导区和PTEN基因相同片段大小的条带。荧光素酶报告实验证实,在不同时间点和不同照射剂量照射下,含Egr-1启动子区报告质粒细胞组的荧光素酶活性均明显高于转染空载体细胞,Western印迹检测表明,转染了pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E的细胞组在未接受照射时PTEN蛋白的表达量极低,但在接受8 Gy的X线照射后,PTEN蛋白的表达量明显提高,高于转染了pEGFP-PTEN和pEGFP-PTEN-G129E的细胞。结论成功构建了具有辐射诱导能力的含人野生型及突变型PTEN基因的重组质粒,为今后肿瘤的治疗奠定了基础。     

VEGF-C基因3'端未翻译区对荧光素酶表达的影响

目的 构建小鼠血管内皮生长因子-C(VEGF-C)基因3'端未翻译区(3'UTR)的荧光素酶表达载体,利用双荧光报告系统观察VEGF-C基因3'UTR对荧光素酶基因表达的影响.方法 通过PCR分别扩增小鼠Lewis肺癌细胞VEGF-C cDNA全长3'UTR(429bp)和一段312bp的编码区序列(CR),采用基因工程方法 将PCR产物克隆至pTA2克隆载体,随后再亚克隆至荧光素酶报告基因载体(pGL3-Promoter)荧光素酶编码基因下游的Xba Ⅰ酶切位点,使用LipofectamineTM 2000真核转染小鼠Lewis肺癌细胞,化学发光法检测荧光素酶的活性,定量RT-PCR检测荧光素酶mRNA水平.结果 PCR成功扩增出与预期长度相符的小鼠VEGF-C CR (312bp)和VEGF-C 3'UTR (429bp).经酶切、测序鉴定,小鼠VEGF-C基因3'UTR和CR均插入到pGL3-Promoter的Xba Ⅰ位点,插入序列碱基组成和插入方向均正确,获得载体pGL3-VEGF-C 3'UTR和pGL3-VEGF-C CR.荧光素酶报告系统和定量RT-PCR检测显示,与pGL3-Promoter组比较,pGL3-VEGF-C 3'UTR转染组荧光素酶活性和mRNA水平均显著降低,而pGL3-VEGF-C CR组与pGL3-Promoter组之间无显著性差异.结论 VEGF-C基因3'UTR可以抑制荧光素酶的表达.     

人HUT78细胞褪黑素受体的基因与蛋白表达的研究

为了检测人HUT78细胞是否存在褪黑素受体（melatonin receptor,MR)及其亚细胞分布特点，采用异硫氢酸胍－苯酚－氯仿一步法抽提总RNA，进一步通过RT－PCR方法检测MR亚型mt1和MT2的mRNA，并将RT－PCR的阳性产物通过自动测序仪测序；同时应用免疫组化染色方法检测mt1和MT2受体亚型蛋白在HUT78细胞内的分布特点，RT－PCR方法则得到了368bp mt1 cDNA片段，无321bp MP2 cDNA片段，同时将mt1阳性条带通过胶回收，测序，结果显示扩增产物与人mt1受体亚型的基因序列相吻合，免疫组化结果显示，人HUT78细胞存在mt1受体蛋白，主要分布于细胞膜和细胞浆，呈棕褐色阳性颗粒，而细胞上未见阳性颗粒，MT2受体蛋白则未检出，提示褪黑素（melatonin,Mel)对T淋巴细胞具有直接调节作用，为研究生理及病理情况下Mel调节免疫系统的作用机制奠定了基础。     

Identification of a broad spectrum of mammalian and avian species using the short fragment of the mitochondrially encoded cytochrome b gene

Mitochondrial DNA (mtDNA), especially the gene for cytochrome b (MT-CYB), has been found to be highly informative for species identification. In this study, we present the results of the analysis of a 127 bp long fragment of MT-CYB, amplified using universal primers, variable enough to be used for species identification and discrimination, even in highly degraded animal samples. The total number of analyzed species in this study was 30, including 17 mammalian and 13 bird species. Using a newly created primer pair, we successfully amplified and sequenced the target sequence in almost all tested species. The amplification was incomplete in just two species, and as a result, partial, but still variable sequences, were obtained. Using the target fragment we successfully identified all tested samples. Initial results suggested that the intraspecies genetic diversity of the target region, in all tested species, was low – from 0 to 4.72%. The interspecies genetic diversity of the target region, crucial for successful discrimination, showed relatively high diversity, ranging from 8.36% to 42.52%. Given its short length, the target region should be used for species determination, particularly in samples that are degraded or are low in DNA quantity.     

尿苷基转移酶通过调节miR132/212簇的尿苷化影响食管上皮细胞放射敏感性

目的 验证末端尿苷基转移酶（TUT4）通过影响miR132/212簇的尿苷化作用影响食管上皮细胞（HEEC）的放射敏感性。方法 本研究通过PCR的方法检测0、2、4、6和8 Gy X射线照射后0、6、18、24和48 h HEEC中TUT4的表达。将细胞分为阴性对照组、下调TUT4表达组（shTUT4组）、单纯6 Gy照射组（6 Gy组）、6 Gy照射+下调TUT4表达组（6 Gy+shTUT4组）分别检测TUT4对细胞放射敏感性、细胞增殖、细胞周期、线粒体损伤、氧自由基产生的影响;通过PCR检测下调TUT4表达对miR132/212尿苷化的影响;克隆形成和增殖实验检测过表达miR132/212及miR132/212+UUU（末端添加3个尿嘧啶的miR132/212）时HEEC的放射敏感性;增殖实验检测在下调TUT4表达且过表达miR132/212及尿苷化miR132/212时HEEC的增殖情况。结果 PCR结果显示,2、4、6和8 Gy X射线照射后TUT4表达增加,差异有统计学意义（t=12.84、62.06、27.86、32.43,P<0.05）。下调TUT4表达可增加HEEC的放射敏感性,D₀、D_q、SF₂值分别为0.79、1.61、0.47,与对照组比较差异有统计学意义（t=13.2、5.85、7.31,P<0.05）,放射增敏比（SER_D0）为1.41;且经6 Gy照射后,低表达TUT4组细胞增殖减少（t=7.12、13.63,P<0.05）、S期细胞增加（t=11.98,P<0.05）、线粒体损伤增加（t=11.98,P<0.05）、氧自由基产生增加（t=15.65,P<0.05）。进一步研究结果表明,下调TUT4表达可使miR132/212表达增加,miR132/212+UUU表达减少（t=27.90、60.99,P<0.05）;而过表达miR132/212和miR132/212+UUU也可影响HEEC的放射敏感性,SER_D0分别为1.20、0.71。双重转染实验证明,TUT4低表达且miR132/212过表达细胞的增殖能力较单纯TUT4低表达时更弱（t=4.76、7.65,P<0.05）;同时TUT4低表达且过表达miR132/212+UUU时细胞增殖能力较单纯TUT4低表达更强,差异有统计学意义（t=7.22,P<0.05）。结论 X射线可增加HEEC中TUT4的表达,TUT4可降低HEEC放射敏感性、减轻放射损伤,其机制与miR132/212的尿苷化相关。     

红色糖多孢菌A226-ΔeryCⅢ突变体的构建及产物分析

目的构建红色糖多孢菌糖基转移酶EryCⅢ失活突变体,为探索红霉素糖基结构修饰和合成新型红霉素衍生物打下基础。方法通过PCR扩增方法将eryCⅢ基因缺失130bp后,克隆至同源重组型质粒pWHM3上,构建pWHM3-ΔeryCⅢ,将其导入红色糖多孢菌A226中。经过两次同源重组,筛选出1株缺失EryCⅢ酶活性的红色糖多孢菌A226-ΔeryCⅢ突变体。使用抑菌实验、薄层层析和质谱对其发酵产物进行分析,并通过回补实验进一步验证。结果与结论对红色糖多孢菌A226-ΔeryCⅢ染色体序列测定表明,eryCⅢ基因相应位点缺失130bp,突变菌株发酵产物对枯草芽孢杆菌无抑制作用,薄层和质谱结果表明突变菌株积累3-L-mycarose红霉内酯B（MEB）,而并没有发现红霉素产物。回补验证发现eryCⅢ基因导入A226-ΔeryCⅢ使得其恢复了红霉素合成能力。所构建的红色糖多孢菌EryCⅢ失活突变体A226-ΔeryCⅢ,为探讨组合合成红霉素衍生物奠定基础。     

菜豆空间突变品系的分子生物学分析

目的：从分子水平证实经太空飞行处理的菜豆种子后代突变系的遗传物质（ＤＮＡ）确实发生了基因突变。方法：菜豆种子经卫星搭载飞行１５ｄ,回收种植后,采用ＲＡＰＤ的方法对５个叶片形态有变异的突变体的群体及亲本材料进行分析。结果：在５０个１０寡聚核苷酸引物中,有２０个引物扩增出了ＤＮＡ带,共有１８０条带,其大小在２００￣２０００ｂｐ之间,其中有３个引物的扩增产物与对照组相比产生明显的差异。结论：本文首次对空间诱变的菜豆品系进行ＤＮＡ水平上的分析,ＲＡＰＤ分析结果说明该突变品系与原始对照在ＤＮＡ水平上确实已发生了明显变异。     

恙虫病东方体Karp株主要外膜蛋白基因的克隆与表达

目的：表达恙虫病东方体(Orientia tsutsugomushi)Karp株56000表面蛋白，探索其作为诊断抗原的可能性。方法：采用PCR方法，从Ot．Karp株菌种基因组DNA中扩增出56000成熟蛋白基因片段，将该片段克隆于原核表达载体pQE30，构建重组质粒pQE30／56，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测目的蛋白的表达。结果：(1)获得长约l500bp的Ot．Karp株56000外膜蛋白基因；(2)SDS-PAGE电泳和免疫印迹显示该重组质粒转化的大肠杆菌有一相对分子质量约为56000的独特蛋白带；(3)表达后菌体超声破碎后，目的蛋白主要以包涵体形式存在；(4)重组表达质粒序列分析结果显示，pQE30／56中插入的基因片段的序列与已报道的Ot．Karp株56000外膜蛋白基因序列基本一致。结论：获得了Ot．Karp56000蛋白基因，并在大肠杆菌中实现了表达，表达的重组蛋白具有免疫反应性。     

miR-503对辐射诱导U937细胞CD40表达的调控作用

目的 探讨miR-503在U937细胞中与CD40的靶向关系,并观察其对辐射诱导U937细胞CD40表达的调控作用。方法 将miR-503序列插入载体pcDNA-DEST-47中构建真核表达质粒;同时构建CD40基因3’-UTR-荧光素酶报告质粒,与pcDNA-DEST-miR-503质粒共转染至U937细胞,分析miR-503对其调控作用;同时用miR-203和miR-29b作为对照,观察miR-503对CD40的靶向作用。采用Western blot方法,证实miR-503对CD40蛋白表达的抑制作用及照射后U937细胞CD40蛋白表达变化;采用Real-Time PCR方法检测 5 Gy电离辐射照射后U937细胞miR-503表达量。结果 psiCHECK2-CD40和pcDNA-DEST-miR-503两种质粒共转染组的荧光素酶表达明显低于单独转染的空载体和靶基因CD40组(t=3.16,P<0.05),miR-203和miR-29b不能抑制CD40荧光素酶活性,而miR-503明显抑制CD40荧光素酶活性(t=5.25,P<0.01);转染pcDNA-DEST-miR-503质粒后在U937细胞中,靶基因CD40蛋白的表达受抑制。5 Gy电离辐射照射后,U937细胞中miR-503表达量上调(t=3.63~17.00,P<0.01),而CD40蛋白表达下降。结论 miR-503与CD40可能是靶向关系,并参与其调控作用。辐射上调人急性白血病细胞株U937细胞的miR-503的表达量,而且抑制CD40蛋白表达,说明miR-503可能参与辐射对肿瘤细胞CD40蛋白表达的调控作用。     

New cyt b gene universal primer set for forensic analysis

Analysis of mitochondrial DNA, and in particular the cytochrome b gene (cyt b), has become an essential tool for species identification in routine forensic practice. In cases of degraded samples, where the DNA is fractionated, universal primers that are highly efficient for the amplification of the target region are necessary. Therefore, in the present study a new universal cyt b primer set with high species identification capabilities, even in samples with highly degraded DNA, has been developed. In order to achieve this objective, the primers were designed following the alignment of complete sequences of the cyt b from 751 species from the Class of Mammalia listed in GenBank. A highly variable region of 148 bp flanked by highly conserved sequences was chosen for placing the primers. The effectiveness of the new pair of primers was examined in 63 animal species belonging to 38 Families from 14 Orders and 5 Classes (Mammalia, Aves, Reptilia, Actinopterygii, and Malacostraca). Species determination was possible in all cases, which shows that the fragment analyzed provided a high capability for species identification. Furthermore, to ensure the efficiency of the 148 bp fragment, the intraspecific variability was analyzed by calculating the concordance between individuals with the BLAST tool from the NCBI (National Center for Biotechnological Information). The intraspecific concordance levels were superior to 97% in all species. Likewise, the phylogenetic information from the selected fragment was confirmed by obtaining the phylogenetic tree from the sequences of the species analyzed. Evidence of the high power of phylogenetic discrimination of the analyzed fragment of the cyt b was obtained, as 93.75% of the species were grouped within their corresponding Orders. Finally, the analysis of 40 degraded samples with small-size DNA fragments showed that the new pair of primers permits identifying the species, even when the DNA is highly degraded as it is very common in forensic samples.