锌指蛋白A20在内毒素所致人脐静脉内皮细胞损伤中的作用

目的　探讨外源性锌指蛋白A2 0对内毒素 (LPS)诱导的内皮细胞同型半胱氨酸蛋白酶caspase 3表达和凋亡的影响。　方法　RT PCR检测A2 0基因在内毒素诱导内皮细胞中的表达。DOTAP脂质体转染pCDNA3 1EHA2 0于脐静脉内皮细胞 ,经G4 18筛选 ,A2 0表达经免疫荧光鉴定。Tunnel原位末端标记法、原位杂交检测转染前后内毒素诱导内皮细胞凋亡情况及caspase 3的表达情况。　结果　A2 0基因在内毒素诱导的内皮细胞中能表达。正常对照组及转染A2 0基因组人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)凋亡为 (5± 1) %、(6± 1) % ,LPS作用后对照组与转染A2 0基因组凋亡分别为 (36± 3) %、(10± 1) % ,两者相差显著 (P <0 0 5 )。A2 0基因能显著抑制内毒素诱导的内皮细胞caspase 3的表达。　结论　A2 0基因在创伤的治疗中可能有一定作用。     

锌指蛋白基因抑制氧损伤诱导的内皮细胞E-选择素的表达

目的：探讨外源性锌指蛋白基因A20对氧损伤诱导的内皮细胞E-选择素表达的影响。方法：DOTAP脂质体介导peDNA3．1EHA20质粒转染人脐静脉内皮细胞，经G418筛选，免疫荧光检测A20基因的表达，原位杂交、免疫组化分别检测过氧化氢诱导的内皮细胞E-选择素表达。结果：A20基因在经G418筛选后的内皮细胞中得到高效表达，过氧化氢能诱导人内皮细胞E-选择素高表达，而A20基因能抑制80％以上过氧化氢诱导的内皮细胞E-选择素表达，两者间相差显著。结论：A20基因能够显著抑制过氧化氢诱导的内皮细胞活化，有助于氧损伤的治疗。     

外源性A20基因对缺氧诱导的内皮细胞E-选择素表达的影响

目的:探讨外源性A20基因在缺氧培养条件下对内皮细胞E-选择素表达的影响。方法:培养原代人脐静脉内皮细胞,将细胞分组建立缺氧模型。采用脂质体转染法将质粒pcDNA3.1EHA20转染培养的内皮细胞,筛选出抗G418的阳性克隆,经免疫荧光鉴定A20表达。采用免疫组化和原位杂交的方法检测内皮细胞E-选择素的表达。结果:缺氧能诱导人内皮细胞E-选择素的高表达。外源性A20基因抑制80%以上由缺氧诱导的内皮细胞E-选择素的表达。结论:外源性A20基因能够显著抑制缺氧诱导的人内皮细胞的活化,有效抑制E-选择素的表达。     

锌指蛋白A20基因对内皮细胞缺氧损伤的保护作用

目的探讨外源性锌指蛋白家族中A20基因对缺氧诱导内皮细胞凋亡的影响.方法①培养原代人脐静脉内皮细胞,将细胞分组建立缺氧模型;②采用DOTAP脂质体介导pcDNA3.1EHA20质粒转染培养的内皮细胞,经G418筛选,免疫荧光检测A20基因的表达;③TUNEL原位末端标记法检测转染前后缺氧诱导内皮细胞凋亡情况.结果A20基因在内皮细胞中得到有效表达,正常对照组及转染A20基因组人脐静脉内皮细胞凋亡为(4±1)%,缺氧培养24h后对照组与转染A20基因组凋亡分别为(18±1)%、(8±1)%,两者相差有显著性意义(P＜0.05. 结论A20基因能够显著抑制缺氧诱导的内皮细胞凋亡,可能在缺氧所致内皮细胞损伤中具有保护作用.     

锌指蛋白基因抑制内皮细胞粘附分子表达及单核细胞粘附

目的单核细胞粘附是动脉粥样硬化发生的重要阶段,研究锌指蛋白A20基因在氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞粘附分子表达及单核细胞粘附中的作用。方法脂质体DOTAP转染pEGFPEHA20-N1于原代培养的脐静脉内皮细胞,经G418筛选,A20表达经免疫荧光鉴定。激光共聚焦显微镜及微管吸吮系统分别检测转染前后氧化型低密度脂蛋白诱导单核细胞粘附情况及内皮细胞粘附分子VCAM-1表达。结果氧化型低密度脂蛋白能显著提高单核细胞粘附力及内皮细胞VCAM-1表达,A20基因能显著抑制氧化型低密度脂蛋白诱导单核细胞粘附及内皮细胞VCAM-1表达。结论A20基因对动脉粥样硬化的防治可能有一定作用。     

A20基因在血管内皮细胞的表达研究

目的：探讨外源性A20基因在内皮细胞获得稳定表达的可行性。方法：将N－末端标记E－tag的HA20 cDNA重组于pCAGGS真核表达载体，构建了pCAGGSEHA20真核表达重组体，构建了pCAGGSEHA20真核表达重组体。DOTAP脂质体介导的pCAGGSEHA20和pMAMneo基因转染，经G418筛选阳性克隆，再用免疫荧光及分子原位杂交检测A20基因的表达。结果：成功构建了pCAGGSEHA20真核表达重组体，A20基因在经G418筛选后的内皮细胞中得到有效表达。结论：在DOTAP脂质体介导下，A20基因能够导入内皮细胞并在其内获得表达。     

A20基因真核表达载体的构建及抑制内皮细胞组织因子(TF)表达的研究

本研究旨在克降人 A2 0基因与真核表达载体进行连接 ,并对其在内皮细胞的表达及功能进行研究。方法 :将 N-末端标记E - tag的人 A2 0 c DNA与穿梭质粒p CAGGS进行连接后得到重组表达质粒p CAGGSEh A2 0 ,将 p CAGGSEh A2 0用脂质体包裹转染培养的人脐静脉内皮细胞 ,同时转染 p CAGGS空载体进行对照 ;G418加压筛选重组细胞克隆。随机挑选p CAGGSEh A2 0转染的内皮细胞 5株 ,调整为 10 0 0 0 / ml,用鼠抗人 E- tag抗体进行免疫荧光染色。转染 p CAGGSEh A2 0阳性的内皮细胞及 p CAGGS空载体转染对照细胞调整为 10 0 0 0 …     

TGFβ1基因对血管内皮细胞细胞外基质表达及与基质黏附的影响

了解TGFβ1基因对血管内皮细胞表达细胞外基质蛋白及与基质黏附力的影响。用DOTAP脂质体转染p MAMneo TGFβ1于原代培养的脐静脉内皮细胞,经G4 18筛选,TGFβ1表达经免疫荧光鉴定。Western blot确定 型胶原、纤黏连蛋白的表达,微管吸吮系统确定内皮细胞与基质的黏附力。结果表明生理情况下的内皮细胞能表达少量的TGFβ1及胶原、纤黏连蛋白。经G4 18筛选,外源性TGFβ1在血管内皮细胞中稳定表达,能显著提高胶原、纤黏连蛋白纤维的表达及细胞与基质的黏附。说明TGFβ1在血管组织工程中促进内皮细胞的黏附具有一定的应用价值。     

锌指蛋白基因抑制人平滑肌细胞表型转化的实验研究

目的探讨锌指蛋白基因A20抑制氧化型低密度脂蛋白诱导平滑肌细胞增殖及表型转化的影响。方法用DOTAP脂质体转染pEGFPEHA20-N1原代培养的平滑肌细胞,经G418筛选,A20表达经免疫荧光鉴定。Brdu检测转染前后氧化型低密度脂蛋白诱导平滑肌细胞增殖情况及α-SM-actin抗体检测细胞表型转化情况。结果 A20基因在平滑肌细胞得到有效表达,少量的氧化型低密度脂蛋白能诱导平滑肌细胞增殖,平滑肌细胞α-SM-actin骨架蛋白表达减少,而A20转染的平滑肌细胞增殖不明显,α-SM-actin骨架蛋白表达呈强阳性。结论 A20基因在动脉粥样硬化中能抑制平滑肌细胞的病理性增生。     

人白介素- 4对牛血管内皮细胞保护作用的研究

目的:研究人白介素-4(hIL-4)对经TNF-α活化的牛主动脉内皮细胞(BAEC)的保护作用。方法:用不同浓度的hIL-4与BAEC共孵育2h后,再与4μg/L的TNF-α共孵育6h或18h。应用细胞ELISA方法,检测BAEC表面的E选择素和ICAM-1的表达;用MTT比色法测定hIL-4对BAEC活性的影响。结果:在一定浓度内用hIL-4预处理BAEC后,能明显抑制TNF-α诱导活化BAEC上的E选择素与ICAM-1的表达,并呈现一定的剂量依赖性。用MTT比色法测定BAEC活性的实验表明,各实验组BAEC的活性与对照组无明显差异性。结论:hIL-4能明显抑制TNF-α诱导活化的BAEC表达E选择素与ICAM-1;hIL-4对BAEC的正常功能具有一定的保护作用。     

载体和基因片段的选择对戊型肝炎病毒基因免疫抗原表达的影响

目的比较不同载体和不同大小的目的基因片段对戊型肝炎病毒(HEV)基因免疫抗原表达的影响,为基于HEV中和抗原表位的HEV基因免疫提供一定的依据。方法将含Ⅳ型HEV中国株中和抗原表位的p166和p179片段编码基因分别克隆入pTR421和pCDNA3.1两种真核表达载体,用脂质体介导基因转染HepG2人肝癌细胞系,经间接免疫荧光和Western blot分析以及将质粒注射小鼠局部肌肉组织后经免疫组织化学染色检测,分析目的基因在体内外的表达水平。结果成功构建了pTR421-166、pTR421-179、pCDNA3.1-166和pCDNA3.1-179四种重组质粒,经限制性内切酶双酶切和核苷酸测序鉴定,编码基因正确无误;pTR421-179转染的细胞以及注射小鼠的局部肌肉组织可以检测到p179的表达,而pCDNA3.1-179、pCDNA3.1-166以及pTR421-166均检测不到目的基因在体内、外的抗原表达。结论载体和目的基因片段的选择显著影响HEV抗原在体内、外的表达,直接关系到基因免疫的成功与否。     

HCV核心蛋白对HepG2 细胞microRNA表达谱的影响

 摘要：目的 分析HCV核心蛋白（HCV-Core）对HepG2细胞microRNA表达谱的影响。方法 将构建好的重组真核表达质粒pCDNA3.1（+）/HCV-Core用脂质体转染HepG2细胞,经G418筛选得到稳定转染HCV-Core的HepG2细胞,命名为HepG2-HCV Core细胞株。然后用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）,细胞免疫荧光和Western blot对HCV核心蛋白在HepG2细胞里mRNA和蛋白水平的表达情况进行验证。利用博奥生物公司的miRNA Array基因芯片,分析稳定表达HCV核心蛋白的HepG2细胞和转染空质粒pCDNA3.1（+）的HepG2细胞二者microRNA表达谱的差异,最后用Taqman探针荧光定量PCR法进行验证。 结果 感染HCV-Core后,HepG2细胞表达有差异的microRNA有8种,用Taqman探针荧光定量PCR法进行分析,发现HCV核心蛋白可以上调miR-29、 miR-146a、miR-149、miR-192、miR-221、miR-222和miR-193b;下调miR-196a。结论 HCV核心蛋白可以诱导肝细胞microRNA表达谱发生改变,在肝癌发生发展过程中发挥重要作用。     

hLKB1基因重组质粒构建及蛋白表达和定位

目的构建hLKB1真核表达载体,证实融合蛋白在胃癌细胞内的表达及定位。方法提取胃正常黏膜上皮细胞GES-1的总mRNA并进行反转录。以反转录的cDNA为模板PCR扩增hLKB1全长编码基因,克隆至pCDNA3.1/flag的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到胃癌SGC-7901细胞中,分别利用Western blot和激光共聚焦扫描显微技术检测其表达和在胃癌细胞中的定位。结果 hLKB1全长基因序列克隆到真核表达载体中,酶切鉴定片段为1300bp。Western blot检测到真核转染的Flag-hLKB1在胃癌SGC-7901细胞表达,条带约为50kD,免疫荧光显示蛋白广泛定位于细胞质和细胞核内。结论成功构建了hLKB1基因真核表达载体,并验证其在胃癌细胞表达。     

大鼠Hes1基因真核表达载体的构建及瞬时表达在神经前体细胞分化中的作用

目的 探讨Hes1基因高表达对神经前体细胞分化的影响. 方法从大鼠脑组织中提取总BNA,用RT-PCR方法获得Hes1基因的全长cDNA,插入pGEM-T-Easy克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pCDNA3.1,用脂质体将重组质粒转染原代培养的神经前体细胞,经G418筛选获得抗性细胞克隆,用RT-PCR方法鉴定Hes1基因在神经前体细胞基因组中的存在,实时荧光定量PCR检测Hes1基因在转染细胞中的过表达情况. 结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定,证实目的 基因已插入重组质粒,RT-PCR证明,经G418筛选得到的转基因神经前体细胞克隆的基因组DNA中存在Hes1基因;实时荧光定量PCR进一步证明,转基因神经前体细胞Hes1基因的mRNA高表达. 结论 构建了大鼠Hes1基因的真核表达载体,获得了高表达Hes1基因的神经前体细胞克隆.Hes1基因高表达可抑制神经前体细胞Ngn1的表达,并促进神经前体细胞向神经胶质细胞的分化.