肿瘤U1 snRNA蛋白互作图谱及特征分析

目的 利用CHIRP-MS技术系统地鉴定肿瘤细胞中U1 snRNA的互作蛋白，并建立U1snRNA高通量互作蛋白图谱，研究U1 snRNA在肿瘤细胞中新的生物学功能和分子调控机制。方法 通过带生物素标记的U1 snRNA探针捕获与U1 snRNA结合的互作蛋白，并分别取部分样品纯化蛋白和RNA，通过qPCR与跑胶银染确认探针富集效果，然后利用高效液相色谱-质谱联用技术鉴定获取的蛋白，最后利用生物信息学的方法进行GO、KEGG、蛋白复合体富集分析和PPI分析。结果 我们共鉴定到了135个高可靠的U1 snRNA结合蛋白，其中包括60个已知的和75个新的U1 snRNA结合蛋白。通路富集等生物信息学分析显示U1 snRNA协同调控RNA剪接、胞内运输、定位、端粒和表观遗传等多个生物学过程。蛋白互作网络分析揭示ESWR1等肿瘤相关蛋白可能介导了U1 snRNA的肿瘤调控功能。结论 本研究在国际上首次建立了U1 snRNA互作蛋白图谱，揭示了U1 snRNA在肿瘤细胞中的多种生物学功能，为进一步研究U1 snRNA参与肿瘤发生发展以及肿瘤预防和治疗提供了理论基础。     

甲状腺癌非编码RNA与mRNA差异表达谱及竞争性内源RNA调控网络分析

目的:通过生物信息学方法分析甲状腺癌预后相关的非编码RNA与mRNA及信号通路。方法:从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中下载568例甲状腺癌患者的临床信息及其组织样本的非编码RNA(lncRNA、miRNA)与mRNA数据,筛选出差异表达的非编码RNA与mRNA,对差异表达的mRNA进行功能富集分析与通路分析;构建lncRNA-miRNA-mRNA的竞争性内源RNA(ceRNA)调控网络;结合临床信息进行生存分析获取与甲状腺癌预后相关的非编码RNA与mRNA。结果:共筛选出差异表达的lncRNA 497个(上调93个,下调404个),miRNA 72个(上调5个,下调67个),mRNA 1 097个(上调233个,下调864个)。功能富集分析结果显示差异表达的mRNA主要参与单组织过程、单组织细胞过程、刺激反应等生物学过程,受体结合、分子功能调节、钙离子调节等细胞功能以及细胞、细胞膜、细胞外组件等细胞构成过程。通路分析结果显示差异表达的mRNA主要参与神经反应受体-配体相互作用、细胞因子-细胞因子受体相互作用、肿瘤转录失调等信号通路的调节。构建的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA互作网络中,有2个差异表达lncRNA(MIR181A2HG、OPCML-IT1),1个差异表达miRNA(miRNA-184)和2个差异表达mRNA(E2F1、SALL3)与甲状腺癌的总体生存期明显有关(均P0.05)。结论:所筛选的非编码RNA与mRNA以及相关信号通路在甲状腺癌的预后密切相关,并为甲状腺癌发生、发展机制的研究提供了新的方向。     

免疫共沉淀联合质谱法筛选和鉴定TS-CBP86-IV相互作用蛋白

目的利用免疫共沉淀联合质谱分析方法,分别从人精子总蛋白和重组BL21细胞总蛋白中筛选和鉴定与TS-CBP86-IV相互作用的蛋白质。方法用克隆技术得到TS-CBP86-IV c DNA编码基因,构建原核表达载体,导入大肠杆菌BL21中诱导表达纯化重组蛋白;另外收集人精子细胞,提取总蛋白,用特异抗体通过免疫共沉淀法分离出TS-CBP86-IV蛋白复合体,再用质谱鉴定可能与其相互作用的蛋白质。结果利用免疫共沉淀联合质谱分析筛选到16个与TS-CBP86相互作用的候选蛋白质,数据库检索发现部分蛋白具有相同功能注释,参与精子运动调控。结论免疫共沉淀联合质谱分析方法成功筛选和鉴定出TS-CBP86-IV相互作用蛋白质,为进一步研究TS-CBP86-IV的功能奠定了良好的基础。     

基于Label-free技术探讨肌少-骨质疏松症与骨质疏松症患者骨组织差异蛋白的研究与分析

目的 对"骨质疏松症(OP)"与"肌少-骨质疏松症(SO)"研究对象的骨组织样品进行蛋白定量检测、蛋白差异分析及差异蛋白功能富集分析,旨在筛选与鉴定出调控SO发生发展的差异蛋白.方法 共收集6例SO与OP患者骨组织样品,采用Label-free定量蛋白质组技术进行鉴定与筛选;在基因本体论(GO)生物学资源库、蛋白互作网...     

miRNA与LncRNA相互作用在骨关节炎中的作用

非编码RNA(ncRNA)包括微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(LncRNA)、核内小RNA(snRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、piwi互作RNA(piRNA)、核仁小RNA(snoRNA)等。ncRNA被转录后不被翻译成蛋白质,在RNA水平发挥其生物学功能,其中LncRNA在转录水平、转录后水平及表观遗传学水平调控基因表达。miRNA通过与靶mRNA的3’UTR互补配对,在转录后水平发挥生物学功能。越来越多的研究表明,LncRNA与miRNA相互作用在疾病进展中起至关重要的作用。该文主要对骨关节炎中LncRNA对miRNA的调控机制进行综述。     

环状RNA的功能及其在结直肠癌中的研究进展

环状RNAs(circRNAs)是一种具有共价闭合环状的长链非编码RNA。circRNAs广泛存在于真核细胞并且结构稳定。circRNAs可作为微小RNAs(miRNAs)的分子海绵参与基因转录后调控,也可与多种蛋白相互作用,调控基因转录及蛋白翻译等。越来越多的研究表明,circRNA与结直肠癌的发生、发展密切相关,有望为结直肠癌的诊断和治疗提供新的分子标志物和靶点。本文从circRNAs的形成、生物学功能以及在结直肠癌疾病中的研究进展等方面进行简要综述,以期为结直肠癌早期诊断和治疗提供新靶点。     

衰老肾脏时钟基因的表达

目的探索可能影响肾脏衰老的相关基因, 并验证时钟基因Arntl在衰老肾脏中的表达变化。方法通过全转录组测序鉴定C57BL/6雄性24月龄小鼠(衰老组)和3月龄小鼠(年轻组)的差异表达基因, 并通过生物信息学方法分析其所富集的生物学通路及关键蛋白。应用实时荧光定量PCR和Western印迹验证Arntl的mRNA及蛋白表达量。结果 (1)全转录组测序结果显示在C57BL/6衰老组小鼠及年轻组小鼠中共筛选出119个显著差异表达基因。差异表达基因主要富集于节律过程、昼夜节律、基因表达的昼夜调控等生物学过程(均P<0.001)。蛋白质互作网络分析结果显示, Nfil3、Hspa8、Arntl、Hlf、Rorc、Per3、Npas2等是差异表达基因中的关键蛋白。时钟基因Arntl、Nfil3、Npas2、Per3在衰老组及年轻组小鼠之间的mRNA表达差异(均P<0.05)与测序结果一致。(2)相较于C57BL/6年轻组小鼠和SAMR1快速老化小鼠, Arntl蛋白表达量在衰老组小鼠和SAMP8快速老化小鼠肾脏组织中均有下降趋势。结论时钟基因及其参与的昼夜节律生物学通路可能在肾脏衰老过...     

精子膜蛋白研究进展

精子膜表面的蛋白是精子发生、成熟和精卵相互作用的重要分子,对其深入研究有助于揭示精子发生、成熟以及受精的分子机制。近年来,各种现代分子生物学技术以及生物信息学方法在生殖生物学领域的广泛应用,不仅使以前发现的一些精子膜蛋白相继得到克隆和测序,同时新的精子膜相关蛋白也不断被发现,为从基因和蛋白质水平研究其生物学功能、揭示生物生殖的分子机制并进而为避孕疫苗的开发等奠定了基础。本文就近年来精子膜蛋白的研究进展作一综述。     

大鼠附睾管腔液M_r22000蛋白的鉴定研究

目的:鉴定大鼠附睾管腔液中可能参与精子成熟/精子表面修饰的附睾特异蛋白。方法:通过SDS-PAGE或双向(2D)电泳比较正常大鼠附睾头段和尾段以及实验性精索静脉曲张(ELV)大鼠附睾尾段管腔液中差异蛋白成分。选择主要差异斑点进行质谱分析,并采用免疫印迹对目标蛋白作进一步鉴定确认。结果:发现多个蛋白成分明显增高。对其中之一的相对分子质量(Mr)22000蛋白集中研究。经质谱分析及免疫印迹确认Mr22000蛋白为磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PBP)。结论:附睾管腔液中的PBP存在多种分子形式包括糖基化修饰。ELV导致大鼠附睾尾管腔液中PBP升高。因此,该分子与精子表面修饰的关系仍需进一步研究。     

基于GEO数据库筛选影响同种异体肾移植术后肾功能的关键基因及生物学因素

目的本研究旨在通过生物信息学算法探讨影响同种异体肾移植术后肾功能的关键基因及生物学因素。方法通过GEO网站筛选GSE181757、GSE30718和GSE147089数据集进行数据挖掘。使用R语言的limma包进行数据预处理及差异基因分析。使用R语言的Clusterprofiler包进行GO、KEGG富集分析。蛋白互作网络是基于STRING数据库构建, 并使用Cytoscape进行可视化。使用Cytoscape中的插件CytoHubba计算蛋白互作网络中排名前5的核心基因。采用CIBERSORT和Xcell反卷积算法被用来进行基于转录谱的免疫微环境量化。结果基于GSE181757芯片数据, 247个基因被鉴定和肾移植患者的远期肾功能相关。差异基因参与的生物学过程主要有类固醇激素生物合成、化学致癌、细胞色素P450-外源性物质代谢、细胞色素P450-药物代谢、视黄醇代谢和全身动脉血压的调节。基于STRING数据库的蛋白互作网络结果显示, MMP7、LCN2、LGALS3、ALB、CYP3A5被认为在调控肾移植患者的远期肾功能中起到核心作用。此外, GSE30718和GSE147089的结...     

Mitochondrial proteomic characterization of human normal articular chondrocytes

OBJECTIVE: Mitochondrial dysfunctions have been associated with apoptosis, aging and osteoarthritis (OA). Chondrocyte mitochondrial proteins are attractive targets for the study of the metabolism of cartilage degradation. The copurification of "contaminating" proteins has been the major problem in all phases of mitochondrial proteome research. Therefore, we set up a procedure for the proteomic analysis of human chondrocyte mitochondrial proteins. METHOD: Four types of protein extracts were obtained from primary cultured chondrocytes isolated from healthy donors: (1) initial total chondrocyte extract (CE), (2) cytosol-enriched supernatant fraction (CY), (3) crude mitochondria fraction (CM), and (4) pure mitochondria fraction (PM). Mitochondria were purified by density gradient ultracentrifugation. Mitochondrial proteins were separated by means of two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) and silver stained. Protein spots were then identified by mass spectrometry using MALDI-TOF/TOF technology. RESULTS: The best 2-DE reference map of mitochondrial proteome was constructed employing PM fraction. Thirty-nine percent of the identified proteins were functionally distributed in the mitochondria, 14% in the endoplasmic reticulum and 36% in the cytoplasm. Examining their biological function, 22% are involved in protein targeting, 12% in signaling, 12% in glycolysis, 10% in RNA, DNA or protein synthesis, 10% in oxidative phosphorylation and 4% in redox. The analysis of mitochondrial Mn-superoxide dismutase (SODM) revealed an age-dependent decrease of this protein. CONCLUSION: PM fraction allowed the obtention of a high quality proteomic map for the study of mitochondrial proteins in human articular chondrocytes. This proteomic approach may be also efficient to analyze both quantitative and qualitative modulations of the mitochondrial proteome in human chondrocytes during aging and pathological conditions such as OA.     

胆管癌肿瘤标志物的蛋白质组学初步研究

目的:蛋白质组学分析被认为是一种寻找潜在生物标志物,尤其是肿瘤标志物的有效方法。二维电泳蛋白质组学分析是一种流行和行之有效的技术。使用二维微分凝胶电泳(2-D DIGE)的研究是为了解癌症病人和对照组不同的蛋白质表达,并从蛋白质在二维图像上分布模式发现潜在的肿瘤标志物。方法:选取5例胆管癌病人和5例对照组胆管标本作为实验样本。然后提取DIGE裂解的蛋白质。随后提取的蛋白质以3种不同CyDyes进行标记,并通过2-D DIGE分离。结果:2-D DIGE从肿瘤和对照组标本中分离出多种蛋白质,点状分布在长13 cm、pH值在3.0～10.0的固相pH梯度胶条上。经过DeCyder软件的生物变异分析模块分析,所有胆管癌病人有20处蛋白质点被发现显着升高,5处蛋白质点下调(配对t检验,P     

Establishment of a high-resolution 2-D reference map of human spermatozoal proteins from 12 fertile sperm-bank donors

Aim： To extend the analysis of the proteome of human spermatozoa and establish a 2-D gel electrophoresis （2-DE） reference map of human spermatozoal proteins in a pH range of 3.5-9.0. Methods： In order to reveal more protein spots, immobilized pH gradient strips （24 cm） of broad range of pH 3-10 and the narrower range of pH 6-9, as well as different overlapping narrow range pH immobilized pH gradient （IPG） strips, including 3.5-4.5, 4.0-5.0, 4.5-5.5, 5.0-6.0 and 5.5-6.7, were used. After 2-DE, several visually identical spots between the different pH range 2-D gel pairs were cut from the gels and confirmed by mass spectrometry and used as landmarks for computer analysis. Results： The 2-D reference map with pH value from 3.5 to 9.0 was synthesized by using the ImageMaster analysis software. The overlapping spots were excluded, so that every spot was counted only once. A total of 3 872 different protein spots were identified from the reference map, an approximately 3-fold increase compared to the broad range pH 3-10 IPG strip （1 306 spots）. Conclusion： The present 2-D pattern is a high resolution 2-D reference map for human fertile spermatozoal protein spots. A comprehensive knowledge of the protein composition of human spermatozoa is very meaningful in studying dysregulation of male fertility.     

ARH3通过稳定MCM2-7表达促进神经胶质母细胞瘤增殖

目的 探讨ADP-核糖水解酶ARH3在神经胶质母细胞瘤内促进细胞增殖的机制。方法 通过GEPIA2和CPTAC数据库分析ARH3在胶质母细胞瘤中的mRNA及蛋白水平的表达量;设计两条siRNA并分别转入胶质母细胞瘤细胞系U87和LN229细胞内沉默ARH3的表达,利用Western Blot验证ARH3的敲低效率;克隆形成检测细胞增殖情况;流式细胞术检测不同时期的细胞比例;利用EdU实验检测细胞处于S期的比例;构建Flag标签的ARH3过表达载体并转染进入细胞,通过免疫共沉淀技术结合质谱分析ARH3的相互作用蛋白组并进行相关通路网络富集分析;通过细胞转染siRNA结合Western Blot验证ARH3对细胞周期相关蛋白稳定性的影响;采用细胞转染siRNA结合质谱技术分析ARH3沉默后胶质母细胞瘤细胞内部的信号通路网络变化。结果 GEPIA2和CPTAC数据库结果显示胶质母细胞瘤显著高表达ADP-核糖水解酶ARH3(P<0.05);在胶质母细胞瘤U87和LN229内敲低内源ARH3后,克隆形成数目减少（P<0.05）;流式结果显示内源性ARH3敲降细胞G1期比例增加（P&l...     

转铁蛋白受体介导的Survivin对U251细胞生长的抑制作用

目的 构建Survivin短发夹状RNA(shBNA)序列的表达载体并观察其对神经胶质瘤细胞U251生长的抑制作用.方法 针对Survivin基因编码shRNA的序列,克隆到携带绿色荧光蛋白基因的载体,经酶切电泳和DNA测序鉴定.采用转铁蛋白.多聚乙烯亚胺(Tf-PEI)介导的转染方法 将重组的shRNA质粒转入U251细胞后,通过倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察绿色荧光蛋白的表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot分别检测Survivin inRNA和蛋白表达;采用MTF法测定细胞增殖.结果 编码短发夹状的RNA序列被成功地插入到预期位点.转染Survivin shRNA1、shRNA2载体分别入U251细胞后,其bcl-2蛋白表达水平均显著降低,P＜0.05.U251细胞在48、72和96 h细胞生长明显受到抑制,分别与转染阴性shRNA组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 构建的Survivin shRNA可特异性地抑制U251细胞生长.     

人成骨样细胞和前破骨样细胞ER亚型、OPG/RANKL/RANK系统、IL-6及其受体以及破骨细胞标志基因表达的研究

目的分析比较两种人成骨样细胞系(U2-OS、MG-63)和两种人前破骨样细胞系(U937、HL-60)ER亚型、OPG/RANKL/RANK系统、IL-6及其受体以及破骨细胞标志基因表达的差异,为今后研究雌激素与IL-6等细胞因子在骨组织中相互关系提供适宜的细胞模型。方法RT-PCR和免疫印迹法检测ERα、ERβ的表达,ELISA法测定IL-6的分泌,OPG、RANKL、RANK及IL-6受体的表达采用免疫印迹法进行检测,TRAP、MMP-9则采用RT-PCR技术进行分析。结果(1)转录水平及蛋白水平证实四种细胞均表达ERα和ERβ;(2)四种细胞不同程度地表达OPG和RANKL,而RANK则仅见于U937细胞表达;(3)四种细胞均表达IL-6受体(IL-6Rα、gp130),除U2-OS细胞外其余三种细胞均组成型分泌IL-6;(4)破骨细胞标志基因TRAP在两种人前破骨样细胞U937、HL-60中均表达,且表达水平相近;而MMP-9仅在U937细胞中弱表达;两种人成骨样细胞U2-OS、MG-63未见有这两种基因表达。结论筛选出用于研究雌激素与IL-6等细胞因子在骨组织中相互关系的细胞模型,同时也为今后深入阐明骨靶向和其他新型抗骨质疏松雌激素的分子机制研究奠定基础。     

Autocrine IL-6 production by human transitional carcinoma cells upregulates expression of the alpha5beta1 firbonectin receptor

PURPOSE: Studies have demonstrated elevated expression and secretion of IL-6 by transitional cell carcinomas (TCC) following bacillus Calmette-Guerin (BCG) therapy. At present, the role of IL-6 on the biology of TCC is poorly understood. This study evaluated the influence of IL-6 expression on a critical variable regulating BCG-tumor interaction, the tumor expression of alpha5beta1 integrin. MATERIALS AND METHODS: A human TCC cell line (253J) was transfected with an expression vector containing the full-length IL-6 cDNA sequence. Overexpression of IL-6 mRNA and protein was confirmed by Northern analysis and ELISA, respectively. Clones found to overexpress IL-6 were then assayed for alpha5beta1 expression using Northern analysis and flow cytometry. The effect of alterations in alpha5beta1 expression on tumor adherence to fibronectin (FN), and BCG adherence to tumor cells was determined using specific adherence assays. RESULTS: mRNAs for both the alpha5 and beta1 subunits of the FN receptor were increased an average of 9.4 fold and 125.7 fold respectively in the IL-6 overexpressing transfectants relative to the parental 253J cells. Increased mRNA of alpha5 and beta1 was associated with increased cell surface expression of both proteins. Increased protein expression resulted in greater FN substrate binding affinity and increased adherence of BCG to tumor cells. CONCLUSIONS: Autocrine expression of IL-6 upregulates the expression of FN receptor subunits in TCC. Increased alpha5beta1 expression increases cellular adherence to FN, and BCG adherence to tumor cells. These results suggest a role for IL-6 in mediating the antitumor activity of BCG by influencing BCG's adherence to TCC.