定向敲除牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA的重组质粒构建

目的 构建定向敲除牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)菌毛蛋白FimA基因的质粒pPHU281_A_Spec_B,用于后续构建菌毛蛋白FimA缺陷型Pg,为研究FimA的功能奠定分子基础.方法 厌氧培养PgATCC33277,提取基因组DNA,聚合酶链反应扩增PgFimA基因一定长度的上游A片段及下游B片段,并在扩增片段两端添加合适的酶切位点；利用定向克隆技术将A和B 基因插入到载体自杀质粒pPHU281中,并添加大观霉素抗性基因片段,重组的pPHU281 _A_Spec_B 在大肠杆菌DH-5α内扩增后酶切电泳鉴定并进行DNA测序.结果 通过对重组质粒pPHU281_A_Spec_B进行酶切鉴定以及DNA序列测定分析,证明重组质粒pPHU281_A_Spec_B构建成功.结论 成功构建了质粒pPHU281_A_Spec_B,有利于菌毛蛋白FimA缺陷型Pg的构建,为深入研究FimA的作用机制奠定了基础.     

变形链球菌F-ATP酶基因重组质粒的构建和初步分析

目的：构建用于转化变形链球菌，含有F-ATP酶基因的重组质粒。方法：采用PCR方法，以变形链球菌基因组DNA为模板，扩增F-ATP酶β亚基5′末端序列，将克隆片段与载体pVA891酶切后连接，形成重组质粒，并对变形链球菌的转化作了初步分析。结果：构建的重组质粒经PCR鉴定、酶切鉴定和DNA序列测定，显示插入的目的片段序列正确。结论：变形链球菌目的片段与穿梭载体重组后能有效克隆，为通过同源重组特异突变变形链球菌染色体基因奠定基础。     

粪肠球菌luxS基因缺陷菌株的构建

目的通过同源重组方法构建粪肠球菌密度感应调控基因luxS基因缺陷突变菌株。方法利用PCR扩增粪肠球菌luxS基因的上、下游片段（up、dn）和红霉素抗性基因片段（erm）,依次采用相应的双酶切反应,将这些片段连接入载体pUC18,以构建目的质粒Puemrd重组载体。采用同源重组方法,将红霉素耐药基因erm置换粪肠球菌基因组中的luxS基因,并在含抗性标记的选择性培养基中筛选出阳性克隆。结果经酶切鉴定,目的质粒各片段插入无误,插入片段的测序报告也显示碱基无错配,成功构建粪肠球菌luxS基因缺陷株。结论本研究成功构建的粪肠球菌luxS基因突变株,为进一步研究该基因在生物膜中的作用及其调控机制提供了技术平台。     

牙龈卟啉单胞菌clpP基因缺失株和回补株的构建和鉴定

目的 构建并鉴定牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.g）W83的丝氨酸蛋白酶(caseinolytic protease,Clp)基因缺失株和回补株,为探索clpP基因在P.g致病过程中的作用和机制奠定基础。方法 设计clpP基因的引物对,PCR扩增其上下游同源片段,克隆入质粒pUC18中,插入红霉素抗性基因ermB作为筛选标记,构建重组质粒,电转化入P.g W83构建缺失株;PCR扩增clpP基因片段与重组质粒pUC18-ΔclpP-ermB连接,电转化入P.g W83缺失株中构建回补株。采用PCR和酶切电泳鉴定序列的正确性,利用抗性培养基筛选高表达菌株。结果 clpP基因克隆成功并顺利导入质粒pUC18中,P.g W83的clpP基因缺失株和回补株构建成功,并能在体外稳定传代。结论 本研究运用同源重组技术构建了P.g W83的clpP基因缺失株,并建立了以pUC18质粒为载体的clpP基因回补方法,为进一步研究clpP基因在P.g致病过程中的作用打下了基础。     

变异链球菌LuxS基因缺陷突变株的构建及其生物膜结构的初步观察研究

目的:通过同源重组法构建变异链球菌LuxS基因缺陷突变菌株,比较其与变异链球菌UA159标准株在生物膜形成上的差异。方法:运用基因同源重组方法将氯霉素抗性基因(Cmr)与LuxS基因上下游区域的2个基因片段按一定顺序重组到PUC载体的多克隆位点中,构建出带氯霉素抗性标志的重组质粒,将载体质粒转化到含完整LuxS基因的变异链球菌UA159中,利用氯霉素抗性筛选出LuxS基因缺陷的突变株,并利用聚合酶链式反应(PCR)和哈氏弧菌发光实验进行检测。以釉质磨片为载体,在扫描电镜下观察上述两菌株含有20 g/L葡萄糖、20 g/L蔗糖的乳酪消化胨酵母(TPY)液体培养基中形成24 h的生物膜。结果:PCR基因扩增结果显示:突变株LuxS基因已被Cmr基因完全替换,成功的构建了变异链球菌LuxS基因突变株,并且突变株不能诱导哈氏弧菌BB170的生物发光。当用葡萄糖作为补充糖源时,变异链球菌UA159标准株和LuxS基因突变株所形成的生物膜表现型未见明显差异;而用蔗糖作为补充糖源时,两菌株所形成的生物膜有明显不同,UA159生物膜相对平滑均质,而LuxS基因突变株生物膜呈松散的蜂房状,基质间有较大的间隙,形成较大的团簇状菌落。结论:成功构建出LuxS基因缺陷的变异链球菌突变株,与变异链球菌UA159标准株其生物膜结构发生改变,提示LuxS会影响变异链球菌生物膜的形成。     

应用Cre-loxP*系统构建无标记的变形链球菌双基因缺陷株

目的 利用以Cre-loxP为基础的位点特异性重组系统Cre-loxP*构建变形链球菌的htrA和clpP双基因缺失突变株,为利用该系统构建无标记的多基因缺陷株奠定基础.方法 将htrA基因克隆到pGEM-T-Easy TA载体,并插入卡那霉素抗性基因愈(lox71-Km-lox66)使htrA基因失活,获得htrA基因删除载体pGEM-T-△htrA/Km.用相同方法构建带有大观霉索抗性标记的clpP基因删除载体pGEM-T-△clpP/Sp.用pGEM-T-△htrA/Km转化变形链球菌标准株,筛选出发生同源重组的菌株.用cre表达质粒pCrePA转化同源重组菌株,删除抗性基因.由于pCrePA的热敏复制子,改变温度培养可消除pCrePA,得到无标记的htrA基因缺失突变株MS△htrA,并经聚合酶链反应(PCR)及DNA测序鉴定.用同样的方法在MS△htrA中删除clpP及大观霉索抗性标记,获得无标记的htrA和clpP双基因缺失突变株MS△htrA-△clpP.结果 PCR及DNA测序鉴定结果表明,htrA和clpP基因及抗性标记已被删除,无标记的htrA和clpP双基因缺失突变株成功构建.结论 利用位点特异性重组系统Cre-loxP*初步构建出变形链球菌的无标记htrA和clpP双基因缺失突变株,为将该系统应用于构建口腔变形链球菌无标记的多基因缺陷株提供了实验依据.

Abstract：

Objective To construct double gene deletions at the htrA and clpP loci on the chromosome of Streptococcus mutans(Sm) and to remove the antibiotic resistance markers with the Cre-loxP*site-specific recombination system. Methods The htrA gene was cloned into the pGEM-T-Easy TA cloning vector and then inactivated via the insertion of a kanamycin resistance cassette(lox71-Km-lox66), yielding pGEM-T-△htrA/Km for deleting the htrA gene. Using the same method, the pGEM-T-△clpP/Sp was constructed for deleting the clpP gene. Following the transformation of pGEM-T-△htrA/Km in Sm, the homologous recombination event was selected. One such mutant was transformed with a cre expression plasmid (pCrePA). The kanamycin resistance gene was then excised. The pCrePA was then easily eliminated at nonpermissive temperatures, resulting in a mutant strain (MS △ htrA) carrying a deletion at the htrA loci without a selectable marker. This mutant was verified by PCR and DNA sequencing. Then, the clpP and spectinomycin resistance gene were deleted from MS △htrA, yielding markerless mutant strain lacking clpP and htrA. Results The deletion of htrA, clpP and antibiotic resistance markers were confirmed by PCR analysis and DNA sequencing. Conclusions A mutant of Sm was constructed successfully which contained a deletion of the htrA and clpP gene without selectable marker. The Cre-loxP*system can be applied to Sm, which provides experimental evidence for generating markerless multiple gene deletion mutants.     

小鼠牙本质涎磷蛋白基因重组腺病毒载体的构建

目的 应用AdEasy重组腺病毒载体系统,构建携带小鼠牙本质涎磷蛋白编码区基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-DSPP.方法 将质粒pTRE2-DSPP中的小鼠DSPP编码序列亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV中构建重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-DSPP,酶切线性化后转入已含有病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌中进行同源重组.筛得的病毒质粒pAd-DSPP经酶切鉴定后,在293细胞中包装成重组腺病毒.荧光显微镜观察绿色荧光表达.扩增并纯化病毒,测定病毒滴度.结果 重组腺病毒质粒经酶切鉴定证实成功构建了携带DSPP基因的重组腺病毒载体,转染293细胞后可出现明显的细胞病变效应,并观察到绿色荧光的表达,DSPP基因测序鉴定与genebank中公布序列一致.重组腺病毒的滴度为:2×109pfu/ml.结论 应用AdEasy系统成功地构建了重组腺病毒载体Ad-DSPP,通过该系统携带的标记基因GFP可直观检测靶细胞转染和外源基因表达的情况,为进一步研究牙本质涎磷蛋白在牙齿发育中的作用奠定了基础.     

变形链球菌gcp基因突变菌株的构建及鉴定

目的:构建变形链球菌gcp基因突变菌株,以便研究变形链球菌gcp基因功能。方法:厌氧培养变形链球菌UA159,以前期研究中pMD19T-gcp为模板,PCR扩增gcp基因内部序列,连接自杀载体pVA8912,酶切鉴定;将鉴定正确的质粒转化变形链球菌UA159,挑取阳性克隆,提取基因组DNA,用PCR结合酶切鉴定。结果:发现PCR产物及插入片段大小与预期值相符,表明成功构建了重组质粒pVA8912/gcp;经PCR鉴定:gcp基因失活株基因组中gcp基因内部成功插入了重组载体片段。结论:成功构建了变形链球菌gcp基因失活株,为该基因功能的研究奠定了基础。     

变异链球菌luxS基因敲除重组质粒的构建

目的:构建一个含有抗卡那霉素基因和变异链球菌luxS基因上下游区同源序列的重组质粒,以便以后转化入变异链球菌进行luxS的敲除.方法:设计引物,以质粒pEGFP-N1为模板,进行PCR得到抗卡那霉素的DNA片断,再以变异链球菌的DNA为模板,PCR得到luxS基因上下游序列,最后将这3 段DNA片断分别按顺序插入到pMD19-T载体的多克隆酶切位点中,转化大肠杆菌的感受态中,通过在卡那霉素和氨苄青霉素的培养基进行筛选.结果:kana 基因和luxS基因两侧同源序列成功连入到pMD19-T载体相应酶切位点,酶切、测序结果正确.结论:成功构建变异链球菌luxS基因敲除重组质粒,为将来构建变异链球菌luxS突变株打下基础.     

牙龈卟啉菌蛋白酶基因rgpA与rgpB蛋白酶区的克隆和表达

目的克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)rgpA、rgpB蛋白酶区,构建rgpA、rgpB蛋白酶区原核表达系统。方法采用聚合酶链式反应(PCR)从PgATCC33277菌株中扩增rgpA、rgpB蛋白酶区,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET42a的rgpA/rgpB蛋白酶区表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导其表达。结果所克隆的PgATCC33277菌株rgpA、rgpB基因蛋白酶区的核苷酸序列与报道的相应核苷酸序列同源性分别为98.9%、99.0%,氨基酸序列同源性分别高达99.2%、99.1%。pET42a-rgpA/rgpB-E.coli BL21DE3系统的蛋白表达量为细菌总蛋白的60%左右。结论本研究成功地构建PgrgpA、rgpB蛋白酶区高效表达系统,为测定RgpA、RgpB免疫原性及作用提供前提。     

Characterizing the specific coaggregation between Actinobacillus actinomycetemcomitans serotype c strains and Porphyromonas gingivalis ATCC 33277

A visual coaggregation study showed specific interspecies coaggregation between an Actinobacillus actinomycetemcomitans serotype c strain and Porphyromonas gingivalis strains ATCC 33277 and 381. We mutagenized A. actinomycetemcomitans SUNYaB 67 (serotype c) with transposon IS903phikan and isolated three transposon insertion mutants that had a reduced ability to aggregate with P. gingivalis ATCC 33277. The three transposon insertions in the mutant strains mapped to the genes at ORF12, ORF13 and ORF16 of the gene cluster responsible for producing serotype c-specific polysaccharide antigen (SPA). Western blot analysis with serotype c-specific antibody showed that these strains did not produce the high-molecular-mass smear of SPA. Furthermore, two SPA-deficient mutants and an SPA-producing mutant were constructed. The two SPA-deficient mutants were deficient for ORF12 and ORF14, which are necessary for the synthesis of serotype c-SPA, and the SPA-producing mutant was deficient for ORF17, which is not related to SPA synthesis. The ORF12- and ORF14-deficient mutants showed reduced ability to aggregate with P. gingivalis ATCC 33277, while the ORF17-deficient mutant aggregated with ATCC 33277 to the same extent as wild-type SUNYaB 67. Our findings suggest that serotype c-SPA of A. actinomycetemcomitans mediates coaggregation with P. gingivalis ATCC 33277.     

牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉内皮细胞一氧化氮生成的影响

目的 观察牙龈卟啉单胞茵(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人脐静脉内皮细胞皮细胞功能损伤的途径,以期为牙周病在动脉粥样硬化发病机制中的作用提供依据.方法 应用厌氧罐培养Pg ATCC33277,用感染复数(multiplicity of infection,MOI)1:10、1:100、1:1000的Pg干预HUVEC,未受Pg干预的HUVEC作为阴性对照组,分别于4、8、12、24 h时收集细胞上清液,利用硝酸还原酶法测定细胞上清液中NO的浓度.结果 在24 h内,Pg MOI 1:10、1:100均能促进HUVEC NO的生成,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);Pg MOI 1:1000干预HUVEC后,12 h内可促进HUVEC NO的生成,但与阴性对照组相比差异无统计学意义,24 h时HUVEC NO的生成降低[(57.83±9.09)mmol/L],与其他各组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 Pg对内皮细胞NO的生成有影响.Pg MOI 1:10、1:100能够促进内皮细胞NO的生成,Pg MOI 1:1000则抑制内皮细胞NO的生成.     

牙龈卟啉单胞菌对牙龈上皮细胞焦点黏附成分paxillin和FAK的作用

目的:研究牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)对牙周组织的破坏机制,探讨菌毛的致病作用.方法:应用Western blot法检测P.gingivalis ATCC 33277及其fimA缺陷突变株对Hela细胞及永生化人牙龈上皮细胞 (immortalized human gingival epithelial cells, IHGE细胞) 的焦点黏附成分——焦点黏附蛋白paxillin和焦点黏附激酶 (focal adhesion kinase,FAK) 蛋白表达的影响.结果:P.gingivalis ATCC 33277野生株和fimA缺陷突变株能够使HeLa细胞和IHGE细胞的paxillin和FAK发生降解,fimA缺陷突变株对paxillin和FAK的降解能力较野生株显著减弱.在IHGE细胞中,paxillin和FAK的降解呈时间依赖性和MOI依赖性.结论:菌毛介导的P.gingivalis的黏附和侵入可能对焦点黏附成分的降解起促进作用,IHGE细胞较Hela细胞更适用于牙周致病菌的研究.     

不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉内皮细胞产生血管细胞黏附分子1和细胞间黏附分子1的影响

目的 观察不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)产生血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的影响,探讨Pg在动脉粥样硬化发生、发展中的可能作用.方法 实验分别以PgATCC33277 (Ⅰ fimA ) 、WCSP115 (Ⅱ fimA)、W83 (Ⅳ fimA)和大肠杆菌脂多糖刺激HUVEC作为T1、T2、T3组(3个实验组)和阳性对照组,未受刺激的HUVEC作为阴性对照组;标准条件下厌氧培养上述3型Pg,将其以及大肠杆菌脂多糖分别与 HUVEC共同孵育2、6、24 h,采用流式细胞术检测HUVEC表面ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达量,并通过激光共聚焦显微镜观察ICAM-1和VCAM-1的表达分布情况.结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ fimA型Pg刺激HUVEC后,细胞表面ICAM-1表达均增强(P<0.05),2、6、24 h表达量分别为Ⅰ fimA:60.27±5.43、80.81±1.44、85.94±2.56;Ⅱ fimA:86.69±8.81、90.19±0.00、96.18±0.48,Ⅳ fimA:59.66±0.40、85.79±4.86、96.04±2.07.除2 h时ⅠfimA与Ⅳ fimA型Pg刺激的HUVEC表面ICAM-1表达量差异无统计学意义外,其他各时间点Ⅱ、Ⅳ fimA型Pg的刺激作用均强于Ⅰ fimA型Pg(P<0.05).本研究条件下,Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ fimA型Pg刺激HUVEC后2、6、24 h表达VCAM-1的水平均较低,各实验组与对照组间相比差异均无统计学意义(P>0.05).激光共聚焦显微镜观察显示,Pg刺激下HUVEC表达ICAM-1和VCAM-1增加,在Ⅱ、Ⅳ fimA型Pg刺激下,HUVEC中ICAM-1和VCAM-1荧光点相对较多且分布范围广.结论 牙周主要致病菌Pg毒力和致病性与其fimA基因型相关,Ⅱ fimA和Ⅳ fimA型Pg 有较强的上调HUVEC表达细胞黏附分子的能力,可能导致血管内皮功能紊乱.

Abstract：

Objective To investigate the effect of Porphyromonas gingivalis(Pg) with different fimA genotypes on vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1) and intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) production by human umbilical vein endothelial cells(HUVEC). Methods In the present study, PgATCC33277(type Ⅰ fimA genotype), WCSP 115(type Ⅱ fimA genotype), W83(type Ⅳ fimA genotype), and Escherichia coli-lipopolysaccharide (Ec-LPS) were designed as experimental group 1, 2, 3, and positive control group, respectively, to stimulate HUVEC, and the un-stimulated HUVEC were analyzed as negative control group. The three strains of Pg were cultured anaerobically in standard condition, and then the Pg cells and Ec-LPS were co-cultured with HUVEC for 2, 6, and 24 h, respectively. The amount of ICAM-1 and VCAM-1 produced by HUVEC was detected with flow cytometry(FCM). The expression of ICAM-1 and VCAM-1 by HUVEC were assayed with confocal laser scanning microscope(CLSM). ResultsThe expression of ICAM-1 on the surface of HUVEC were intensified after infected by Pg with Ⅰ, Ⅱ, and Ⅳ fimA genotypes (P<0.05). The amounts of ICAM-1 were 60.27±5.43, 80.81±1.44, and 85.94±2.56 for Pg with type Ⅰ fimA genotype, 86.69±8.81, 90.19±0.00, and 96.18±0.48 for Pg with type Ⅱ fimA genotype, 59.66±0.40, 85.79±4.86, and 96.04±2.07 for Pg with type Ⅳ fimA genotype at 2, 6 and 24 h after infection, respectively. The up-regulation effects caused by Pg with type Ⅱ and Ⅳ fimA genotypes were stronger than those caused by Pg with type Ⅰ fimA genotype at different time points except at 2 h(P<0.05). Under the present experimental condition, infected by Pg with type Ⅰ, Ⅱ and Ⅳ fimA genotypes stimulated low expression of VCAM-1 by HUVEC, it showed no significant differences among all the groups (P>0.05). Expression of ICAM-1 and VCAM-1 in Pg infected HUVEC were confirmed by CLSM. Infection of HUVEC with Pg resulted in more fluorescence staining of ICAM-1 and VCAM-1 compared with that in uninfected HUVEC cultures. Conclusions The virulence and pathogenicity of Pg is associated with its fimA genotypes, Pg with type Ⅱ and Ⅳ fimA genes possess stronger ability to stimulate HUVEC to up-regulate the expression of cell adhesion molecules, which may lead to disorders in vascular endothelial function.     

应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术筛选牙龈卟啉单胞菌共同外膜蛋白

目的 应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)技术筛选多种牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)共同外膜蛋白(outer membrane protein,OMP),为针对多种Pg设计具有交叉保护作用的疫苗提供候选靶抗原.方法 应用超速离心法提取PgATCC33277、Pgw83、Pg301和Pg381菌株外膜蛋白,SELDI疏水性蛋白芯片H50检测OMP,Biomarker Wizard软件分析4种菌株OMP质谱图.结果 OMP质谱图显示,PgATCC33277、PgW83、Pg301和Pg381分别有71、74、76和72个蛋白质峰,并存在13种共同OMP;在美国国立生物信息中心蛋白库中鉴定到一种已知蛋白gil116636495,其功能尚不清楚.结论 发现13种共同OMP可作为牙周病疫苗候选抗原,证实基于SELDI-TOF-MS技术适合检测小相对分子质量(＜20000)、低丰度、疏水性蛋白,且操作简单、重复性好,可用于大规模寻找Pg的共同OMP.     

联合应用二维液相色谱及串联质谱技术筛选牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白抗原的初步研究

目的 联合应用二维液相色谱(two-dimensional liquid phase fractionation,PF2D)及基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF-MS)技术,筛选多种牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)共同外膜蛋白(outer membrane protein,OMP),为针对多种Pg设计具有交叉保护作用的疫苗提供候选靶抗原.方法 超高速离心法提取Pg301、PgATCC33277和PgW83菌株OMP,应用PF2D目标蛋白快速分离系统分离OMP,对比分析得到共同OMP,用MALDI-TOF/TOF-MS串联质谱结合数据库搜索,确定蛋白质一级结构.结果 第一维色谱聚焦分离,3株Pg共获得99个蛋白质样本;选定OMP组分B7,进行第二维反相色谱分离,3株Pg共确定了8个共同的蛋白色谱峰,运用MALDI-TOF/TOF-MS对蛋白样品进行鉴定,结果 确定了其中一个为已知的蛋白精氨酸-牙龈素A.结论 PF2D分离系统分辨率高、重现性好,结合MALDI-TOF/TOF-MS串联质谱技术,可用于鉴定Pg的共同OMP.     

牙龈卟啉单胞菌Hgp44基因的克隆表达与纯化

目的 克隆表达牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)牙龈素中黏附素区域的Hgp44基因,并纯化目的蛋白.方法 通过聚合酶链反应(PCR)和基因重组技术,克隆得到PgATCC33277的Hgp4基因,插入到克隆载体pMD18-T中并测序鉴定.经过酶切后将目的基因片段与表达载体pET22b相连,构建出表达质粒pET22b-Hgp44.将重组质粒转化到感受态细胞BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白,通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹法进行分析.用固定化金属亲和层析法对重组蛋白进行分离纯化.结果 目的基因片段约为1100 bp,与预期大小相符,测序结果与GenBank中ATCC33277国际标准菌株的RgpA的等位基因序列U15282一致.IPTG诱导后的菌体经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后形成一个以包涵体形式存在的44 000的融合蛋白.蛋白质印迹法检测证实其具有免疫原性.用镍离子金属螯合层析柱纯化出了目的蛋白,最后得到约3.5 mg/L的目的蛋白.结论 成功克隆表达了PgHgp44基因,并纯化出了目的蛋白.     

牙龈卟啉单胞菌脂蛋白基因在慢性牙周炎及牙周健康者中的检测

目的 应用基因芯片技术检测3种脂蛋白基因PG0717、PG0183、PG2135在慢性牙周炎患者和牙周健康者牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)中的分布,探讨这些基因与牙周临床指数之间的关系,为研究脂蛋白在Pg致病过程中的作用提供依据.方法 选取41例慢性牙周炎患者(牙周炎组)及76例牙周健康者(健康对照组),记录探诊深度、附着丧失、探诊出血及牙齿松动度,取龈下菌斑进行细菌分离培养,以临床采集的样本提取的DNA为探针,以抑制消减杂交技术获得的PgW83特异基因片段PG0717、PG0183、PG2135为目标序列,采用Cy5荧光标记目标序列.应用基因芯片技术检测PG0717、PG0183、PG2135基因在牙周炎组病变部位、非病变部位和健康对照组Pg中的分布.结果在牙周炎组病变部位PG0717、PG0183、PG2135基因的检出率分别为90%(18/20)、70%(14/20)、70%(14/20),非病变部位的检出率分别为60%(12/20)、45%(9/20)、40%(8/20),而在健康对照组PG0717、PG0183、PG2135的检出率分别为55%(11/20)、25%(5/20)、30%(6/20).3种脂蛋白基因在牙周炎组病变部位和健康对照组中的检出率差异均有统计学意义(P＜0.05),并且与牙周探诊深度、临床附着丧失、探诊出血及牙齿松动度相关.结论 带有PG0717、PG0183、PG2135基因的Pg菌株致病力强.     

抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白的制备、鉴定及理化特性分析

目的 制备牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)的卵黄免疫球蛋白( immunoglobulin yolk,IgY)并评价其理化性质,以期为采用被动免疫抗体防治慢性牙周炎寻找新途径.方法 厌氧培养Pg国际标准菌株ATCC33277,收集细菌,超声振荡至菌体完全破碎,离心,收集上清液,即为全菌可溶性蛋白抗原.罗曼母鸡隔离饲养至5个月龄用于抗体的制备.以质量浓度为1 g/LPg全菌可溶性蛋白抗原1ml与等量弗氏完全佐剂吹打混匀成油包水状注射剂,经皮下和肌肉多点注射免疫母鸡,共注射免疫4次,每次免疫间隔时间为10d.初次免疫即开始收集鸡蛋,标记后4℃保存.提纯免疫后不同时间的抗Pg-IgY,二喹啉甲酸总蛋白定量法测定蛋白浓度,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定,间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法进行IgY 抗体效价变化和理化性质的检测.结果 通过免疫诱导出质量浓度为2.05 g/L的特异性IgY,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测得相对分子质量分别为65000的重链和25000的轻链,与理论值一致;间接ELISA法结果显示初次免疫后5d左右出现抗Pg-IgY,免疫后50～55d达峰值;抗体效价达到1∶100000以上;一个鸡蛋可以生产超过10 mg的IgY,纯度高达95％.结论 Pg全菌蛋白免疫产蛋母鸡可使鸡蛋产生高效价、高浓度的特异性IgY,该抗体纯度高、耐热、耐酸碱,理化性质稳定,适合口腔环境.