AAV2-hVEGF165与AAV2-hTGFβ1对退变兔椎间盘纤维环细胞的生物学效应

目的采用基因治疗方法,把AAV2-hVEGF165和AAV2-hTGFβ1共转染兔纤维环细胞,观察其生物学活性,并进一步评价人血管内皮生长因子165（hVEGF165）和人转化生长因子β1（hTGFβ1）逆转椎间盘退变的可行性。方法分离并培养兔椎间盘纤维环细胞,以腺相关病毒（AAV2）为载体,分别携带hVEGF165和hTGFβ1eDNA,转染兔纤维环细胞。用Westernblotting检测hVEGF165和hTGFβ1的表达,并用同样的方法检测纤维环细胞中Ⅰ型胶原的表达。结果AAV2能够感染兔椎间盘细胞。用Westernblotting可以检测到AAV2-hVEGF165和AAV2-hTGFβ1在退变椎间盘细胞中的表达,并且,两种因子联合转染纤维环细胞时Ⅰ型胶原的表达要比分别转染是显著增高。结论hVEGF165和hTGFβ1共同转染培养的兔退变纤维环细胞,Ⅰ型胶原的表达显著增高。     

腺相关病毒载体介导hTGFβ1、β3体外转染退变腰椎间盘细胞的生物学效应

目的比较研究腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）载体介导人转化生长因子β1（human transforming growth factor β1,hTGFβ1）与hTGFβ3逆转兔腰椎间盘细胞退变的生物学效应.方法分离、培养兔腰椎间盘髓核细胞和纤维环细胞,并传代建立退变早、晚期细胞模型.采用荧光标记的pSNⅡ型腺相关病毒（pSNAV2）,分别检测其对不同退变程度兔腰椎间盘细胞的转染效率,并在此基础上应用pSNAV2-hTGFβ1和pSNAV2-hTGFβ3转染不同退变程度的兔腰椎间盘细胞.通过细胞形态、胶原的免疫组织化学染色和35S标记蛋白多糖等方法,检测比较pSNAV2-hTGFβ1和pSNAV2-hTGFβ3对于退变早、晚期兔腰椎间盘细胞基质合成的影响.结果pSNAV2可高效转染退变早期兔腰椎间盘髓核细胞和纤维环细胞,而对于退变晚期兔腰椎间盘细胞的转染效率低.hTGFβ1和hTGFβ3可显著促进退变早期兔腰椎间盘细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成,其中hTGFβ1的作用较hTGFβ3强.hTGFβ1可促进退变早、晚期兔腰椎间盘纤维环细胞Ⅰ型胶原的合成.hTGFβ3可促进退变晚期兔腰椎间盘髓核细胞Ⅱ型胶原的合成.结论pSNAV2-hTGFβ1和pSNAV2-hTGFβ3可促进退变早期兔腰椎间盘髓核细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成以及纤维环细胞Ⅰ型胶原的合成,从而延缓和逆转椎间盘退变.对于退变晚期兔腰椎间盘髓核细胞,hTGFβ3可促进Ⅱ型胶原的合成.     

转化生长因子β对椎间盘细胞Ⅱ型胶原基因表达的调节作用

目的 探讨转化生长因子β（ＴＧＦ－β）对椎间盘细胞Ⅱ型胶原基因表达的调节作用。方法 应用原位杂交技术检测ＴＧＦ－β１对人胚椎间盘原代培养及传代培养的纤维环细胞、髓核细胞中Ⅱ型胶原ｍＲＮＡ的调节作用,其中ＴＧＦ－β１浓度分别为０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ和１０ｎｇ／ｍｌ;采用ＶＩＤＡＳ软件计算杂交涂片中细胞的平均光密度值,进行胶原ｍＲＮＡ相对定量。结果 （１）原代培养的椎间盘纤维环细胞,ＴＧＦ－β１浓     

转化生长因子β与椎间盘细胞Ⅰ型胶原基因调控的关系

目的：探讨ＴＧＦ－β在椎间盘Ⅰ型胶原代谢中的作用及作用机制。方法：应用斑点杂交和原位杂交技术检测了ＴＧＦ－β对椎间盘原代培养及传代培养的纤维环细胞、髓核细胞中Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ,ＴＧＦ－β１浓度为１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｍ／ｍｌ,其作用分别是０ｎｇ／ｍｌ组的１．１８倍及１．３７倍;对于传代培养４ 纤维环细胞,其调节作用分别是０ｎｇ／ｍｌ组的１．４８倍及２．０３倍。结论：ＴＧＦ－β可以按照剂量依赖方式正向     

转化生长因子β对椎间细胞Ⅰ,Ⅲ型胶原基因表达的调节作用

探讨转化生长因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒβ,ＴＧＦ－β）对椎间盘Ⅰ,Ⅲ型胶原基因表达的调节作用。方法应用斑点杂交和原位杂交技术检测了ＴＧＦ－β１对椎间盘原代培养及传代培养的纤维环细胞,髓核细胞中Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ的调节作用,采用ＶＩＤＡＳ软件计算杂交膜斑点及发校涂片中细胞的平均光密度值,进行胶原ｍＲＮＡ相对定量。结果（１）对于原代培养的椎间盘纤维环细胞Ⅰ型胶原ｍＲＮＡdisp     

VEGF165基因转染骨髓源性血管内皮祖细胞的体外实验研究

目的探讨血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）转染骨髓源性血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）后，EPC分泌VEGF及活性以及EPC特性的影响。方法体外获取大鼠骨髓，分离单个核细胞，经培养，鉴定为EPC。用脂质体介导pcDNA3．0-hVEGF165转染，转染后EMSA法测培养上清VEGF蛋白水平，培养上清液对ECV304细胞生长的影响，以评价VEGF蛋白活性，MTY法评价转染对细胞活性的影响，免疫细胞化学检测EPC表达VEGF、vWF（血友病因子）、VEGF—R2（血管内皮生长因子受体2）的变化。结果转染后的第7天表达的VEGF蛋白浓度达1280pg／ml，转染对EPC的增殖无影响，表达VEGF、vWF、VEGF—R2的比率随时间而逐渐升高，至第7天时分别为88．52％、82．65％和95．97％。结论VEGF转染的EPC能表达一定浓度有功能的VEGF蛋白，能帮助EPC保持内皮细胞特性，向成熟内皮细胞分化。     

兔退变椎间盘体内转染hTGF-β1、β3的生物学效应

目的 应用重组腺相关病毒2(recombinant adeno-associated virus,rAAV2)介导人转化生长因子β1(human transforming growth factor-β1,hTGF-β1)和β3(hTGF-β3)单基因或双基因联合体内转染退变兔髓核细胞,观察基因产物的表达及其对基质成分...     

移植肾组织TGF-β1和MMP-2表达及Ⅳ型胶原沉积与慢性移植肾肾病的关系

目的 探讨移植肾组织中转化生长因子β1（TGF-β1）和基质金属蛋白酶2（MMP-2）的表达及Ⅳ型胶原沉积与慢性移植肾肾病（CAN）的关系。方法 对18例CAN患者进行了移植肾切除术。光镜下观察切除的肾组织标本并根据其纤维化的程度进行分期，用免疫组织化学技术和图像分析法检测移植肾组织中TGF-β1和MMP-2表达量及Ⅳ型胶原沉积情况，并分析患者血肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）的水平与移植肾纤维化程度的关系。结果 随着患者移植肾纤维化程度的加重，血清肌酐、尿素氮及肾组织中TGF-β1、Ⅳ型胶原基因表达量均增加，MMP-2表达量于移植肾纤维化早期明显升高，并随移植肾纤维化程度加重而逐渐降低。结论 移植肾组织中TGF-β1表达量增高及Ⅳ型胶原沉积可以促进CAN的进程，而MMP-2则可抑制其进展。     

成人颈椎间盘中转化生长因子β及其受体的测定及意义

目的：探讨转化生长因子β(TGF-β)及其受体在成人颈椎间盘中的分布规律及其意义。方法：将颈椎病、椎间盘突出症患者及对照组按年龄分为40岁以下组，40～60岁组，60岁以上组，同时采用Chistina椎间盘MRI退变分级法对所有患者进行退变分级，免疫组化染色方法测定椎间盘中的TGF-β及其受体，观察各分组、分级中TGF-β及其受体的分布及变化情况。结果：TGF-β及其受体大量存在于40岁以下患者间盘纤维环纤维软骨细胞中，髓核的脊索样细胞中染色较弱。随着年龄成长，逐渐减少。60岁以上患者间盘中，TGF-β及其受体几乎消失。MRI退变分级为Ⅰ～Ⅱ级的椎间盘TGF-β及受体阳性率高，Ⅲ级以上开始明显减弱。结论：TGF-β及其受体在成人颈椎间盘中的分布与患者年龄、椎间盘退变程度有关。其含量减少可能是颈椎间盘退变原因之一。     

转化生长因子β对椎间盘细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达的调节作用

目的 探讨转化生长因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒβ,ＴＧＦ－β）对椎间盘Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达的调节作用。方法 应用斑点杂交和原位杂交技术检测了ＴＧＦ－β１ 对椎间盘原代培养及传代培养的纤维环细胞、髓核细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原ｍＲＮＡ 的调节作用,采用ＶＩＤＡＳ软件计算杂交膜斑点及杂交涂片中细胞的平均光密度值,进行胶原ｍＲＮＡ相对定量。结果 （１）对于原代培养的椎间盘纤维环细胞Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ,ＴＧＦ－β１ 浓度为１ ｎｇ／ｍｌ 及１０ ｎｇ／ｍｌ 时,其调节作用分别是０ ｎｇ／ｍｌ 组的１．１８ 倍及１．３７倍;对于传代培养的纤维环细胞,其调节作用分别是０ ｎｇ／ｍｌ 组的１．６ 倍及１．８４ 倍;对于传代培养的髓核细胞,其调节作用分别是０ ｎｇ／ｍｌ 组的１．４８ 倍及２．０３ 倍。（２） 对于原代培养的椎间盘纤维环细胞Ⅲ型胶原ｍＲＮＡ,ＴＧＦ－β１ 浓度为１ ｎｇ／ｍｌ 及１０ ｎｇ／ｍｌ 时,其调节作用分别是０ ｎｇ／ｍｌ 组的１．０８ 倍及１．２２ 倍;对于传代培养的纤维环细胞,其调节作用分别是０ ｎｇ／ｍｌ 组的１．２２ 倍及１．４０ 倍;对于传代培养的髓核细胞,其调节作用分别是０ ｎｇ／ｍｌ 组的１．２０ 倍及１．     

血管内皮生长因子(VEGF)基因转染促进成骨细胞成骨活性的实验研究

目的了解外源性血管内皮生长因子(VEGF)基因表达对成骨细胞成骨活性的影响。方法利用阳离子脂质体Lipofectamine转染将pBLAST49-mVEGF基因导入体外培养的成骨细胞,与对照组比较,观察外源性VEGF在成骨细胞内的表达,及其对成骨细胞合成分泌骨钙素、Ⅰ型胶原的影响。结果pBLAST49-mVEGF基因转染组第1～5代细胞合成分泌骨钙素浓度和Ⅰ型胶原的表达均明显高于对照组,二者间比较差异具有显著性(P<0.05)。结论pBLAST49-mVEGF基因转染能促进成骨细胞生成骨钙素和合成Ⅰ型胶原的能力。     

转化生长因子β1基因单独转染及与胰岛素样生长因子1基因联合转染治疗兔膝骨关节炎

目的 观察重组大鼠转化生长因子β1(transforming growth factor beta-l,TGF-β1)基因单转染及与胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)基因共转染兔膝关节后对骨关节炎(osteoarthritis,OA)的治疗效果.方法 新西兰白兔24只,随机分为4组,Ⅰ组为空白对照组,Ⅱ组为手术对照组,Ⅲ组为TGF-β1基因转染组,Ⅳ组为TGF-β1和IGF-1双基因转染组.前十字韧带切断法制成兔膝关节OA模型,向膝关节内注射转染不同重组基因的阳性克隆软骨细胞.4、8周后,取关节标本进行Mankin评分,AB-PAS染色,TGF-β1、IGF-1、Ⅱ型胶原原位杂交和免疫组化检测,透射电镜观察.结果 Ⅱ组软骨损伤程度较大,其Mankin评分明显高于Ⅰ组和Ⅲ、Ⅳ组.各因子原位杂交和免疫组化染色,Ⅰ组及Ⅲ、Ⅳ组的灰度值均高于Ⅱ组,Ⅳ组的灰度值较Ⅲ组高;8周时各对应组灰度值较4周有明显下降.透射电镜观察显示,Ⅱ组的超微结构较Ⅰ组明显紊乱,治疗4周后,超微结构逐渐恢复正常,但在8周后紊乱程度又逐渐加重.结论 关节内注射转基因软骨细胞对OA有一定治疗作用;TGF-β1和IGF-1双基因治疗效果优于TGF-β1单基因;基因治疗4周后,基因表达逐渐减弱,基因治疗具时效性.     

Ⅱ型胶原、转化生长因子β1和碱性成纤维细胞生长因子在脊柱侧凸患者关节突软骨中分布及表达的实验研究

目的研究青少年特发性脊柱侧凸（AIS）和先天性脊柱侧凸（CS）畸形最严重部位一顶椎凸、凹侧下关节突软骨中Ⅱ型胶原、转化生长因子β1（TGF—β1）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达特点。方法22例AIS患者,18例CS患者作为研究对象。取两组患者的顶椎和端椎凸、凹侧的下关节突,采用苏木素-伊红（HE）染色、免疫组化和原位杂交方法观察关节突的病理改变和Ⅱ型胶原、TGF-β1及bFGF在关节突中分布的特点。将所得的免疫组化和原位杂交图像输入图像分析系统,进行半定量分析,并作统计学分析。结果Ⅱ型胶原、TGF-β1、bFGF在AIS和CS中的有基本相似的表达特点,免疫组化和原位杂交方法均显示顶椎凹侧的表达高于凸侧,差异有统计学意义（P〈0．05）;上下端椎的凸凹侧之间及凸凹侧的上下端椎之间的表达差异无统计学意义,顶椎、上下端椎各对应部位在AIS与CS之间的表达差异无统计学意义;Ⅱ型胶原在凸侧与凹侧顶椎的表达高于同侧上、下端椎,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论AIS和CS顶椎关节突软骨呈现退变及发育不全等征象,凹侧较凸侧明显。AIS和CS中Ⅱ型胶原、TGF—β1及bFGF在顶椎凹侧表达的增高可能为脊柱畸形后异常的生物力学引起了关节突细胞间基质重建而进行代偿的结果。压应力可引起TGF—β1及bFGF的表达增高;压应力和张应力均可以引起Ⅱ型胶原的表达增高,但顶椎凹侧压应力比凸侧张应力的影响更大。     

人VEGF165基因转染人外周血内皮祖细胞的实验研究

目的 探讨人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)基因转染对人外周血内皮祖细胞(EPCs)的影响.方法 体外分离、培养、鉴定人外周血EPCs.实验分脂质体介导pcDNA3.1-hVEGF165质粒转染组,pcDNA3.1空质粒转染组,窄白对照组.ELISA法和硝酸还原酶法分别测定各组上清液中VEGF和一氧化氮(NO)的含量;噻唑蓝(MTT)检测它们对EPCs增殖的影响.结果 FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3.1-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清液中VEGF和NO表达量明显高于其他两组(P＜0.01);VEGF质粒转染对EPCs的增殖无明显影响.结论 人外周血EPCs可以成功转染hVEGF165基因.同时能表达一定浓度的VEGF蛋白,并可促进NO的分泌,而对EPCs的活性无明显影响.该研究为进一步研究VEGF165基因和EPCs结合治疗缺血性疾病提供了实验依据.     

血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体的构建及转染内皮祖细胞的实验研究

目的：利用细菌内同源重组法构建含血管内皮生长因子（VEGF）165基因的重组腺病毒，并观察其在内皮祖细胞（EPCs）中的表达，为进一步研究其在慢性肾脏病中的作用奠定基础。方法：用限制性内切酶XbaⅠ＋HindⅢ从质粒载体中切出VEGFl65基因片段，与KpnⅠ＋HindⅢ双酶切的pAdTrack-CMV形成转移质粒pAdTrack-CMV-VEGFl65，PmeI酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183，由人胚肾293细胞包装成Ad-VEGFl65，PCR和westem blot法鉴定其表达。贴壁法体外培养获得大鼠骨髓来源的EPCs，Ad-VEGFl65基因体外转染EPCs，检测转染后目的基因的表达情况。结果：利用CSCI，法由pAdTrack-VEGFl65和pAdEasy-1共转化BJ5183感受态茵，可获得阳性重组体细菌克隆。PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因，病毒滴度1．4×10^10pfu／ml。Ad-VEGFl65转染培养第6天的EPCs后24h开始，培养上清中VEGF蛋白表达较对照组和转染前增加。结论：成功制备的重组体腺病毒Ad-VEGFl65转染体外培养的EPCs后，在体外能有效高表达目的基因产物，为今后VEGF在肾脏病中的深入研究奠定了基础。     

TGF-β增强rhBMP-2诱导成骨中Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA及碱性磷酸酶的表达

目的：对TGF-β增强rhBMP-2诱导成骨中Collagen Ⅰ、ⅡmRNA及碱性磷酸酶(ALP)的表达进行研究。方法：BALB／c小鼠110只随机分2组，每组55只。rhBMP-2／TGF-β为实验组，rhBMP-2为对照组，于术后3～21d 8个时间点取材，用原位杂交方法对新生骨组织中的Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA进行检测；对ALP活性进行定量分析，观察2组在诱导成骨中CollageⅠ、ⅡmRNA及ALP的表达情况。结果：(1)Ⅱ型胶原mRNA的出现是和成软骨、软骨细胞的出现相伴随的；(2)做为成骨细胞成熟标志物的I型胶原mRNA、ALP在软骨形成期即有表达，随着成骨细胞的出现，骨组织的形成Ⅰ型胶原mRNA仍表现为高表达，而ALP的表达则呈下降趋势；(3)实验组CollagenⅠ、ⅡmRNA及ALP的表达早于对照组。结论：TGF-β增强了rhBMP-2诱导成骨中CollagenⅠ、ⅡmRNA及ALP的表达。     

腺病毒介导人胰岛素样生长因子1基因转染退变椎间盘的实验研究

退变性椎间盘病是下腰痛最为常见的病因，其发生与椎间盘退变密切相关。椎间盘退变时活细胞数量减少，蛋白多糖和水的含量减低，胶原的排列和类型发生改变，Ⅱ型胶原减少而Ⅰ型胶原增多。如果能调节椎间盘细胞的生物学特性，促进退变椎间盘的细胞分裂增殖，再生蛋白多糖和胶原，恢复水分含量，就有可能阻止退变发展。     

转化生长因子β1及其Ⅰ型受体在胆囊癌发病及预后中的研究

转化生长因子（TGFβ）是一类有多种生物学功能的生长因子,可抑制上皮细胞生长.转化生长因子βⅠ型受体（TβRⅠ）在TGFβ信号传递中不可缺少,否则TGFβ无法实现其功能.……     

转化生长因子-β诱导活化蛋白-1活化及促进NIH3T3细胞α2Ⅰ型胶原表达的研究

目的 研究活化蛋白-1(AP-1)在转化生长因子-β(TGF-β)促进Ⅰ型胶原基因表达中的作用，探讨病理性瘢痕的形成机制。方法 用5μg/LTGF—β刺激鼠成纤维细胞株NIH3T3细胞,分别采用凝胶迁移变动分析(EMSA)和逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)技术研究TGF—β对AP-1的活化及其对α2Ⅰ型胶原mRNA水平的影响。结果 5μg／LTGF—β刺激NIH3T3细胞，0．5h即可检测到AP-1被活化，随时间推移AP-1的活性逐渐增强，6h达到峰值，而后活性逐渐减弱，24h仍然可检测到AP-1的活性。用TGF-8刺激NIH3T3细胞，24h后提取总RNA，经RT—PCR分析。与对照组相比α2Ⅰ型胶原mRNA水平明显增高。结论 TGF—β刺激NIH3T3细胞，可激活AP-1并可以上调α2Ⅰ型胶原的表达。     

hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞椎间盘移植术后的表达

目的 检测腺病毒介导的hTGF-β1基囚转染骨髓间充质干细胞椎间盘移植后hTGF-β1基因的表达。方法 兔骨髓间充质干细胞体外分离培养扩增,Ad-hTGF-β1转染后采用组织工程方法自体移植于椎间盘中,在术后1周、2周、4周、6周、8周取材,RT-PCR和免疫组化方法检测hT-GF-β1的表达。结果 在Ad-hTGF-β1转染MSCs移植组,RT-PCR可检测到hTGF-β1mRNA的表达,对照组未检测到hTGF-β1mRNA的表达,免疫组织化学染色结果显示,与对照组比较Ad-hT-GF-β1转染MSCs移植各组阳性细胞数量和灰度值均有非常显著性差异（P〈0．01）。结论 腺病毒介导的hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞椎间盘移植后hTGF-β1基因的可高表达。