血管能抑素基因转移抑制视网膜新生血管的实验研究

目的 观察血管能抑素真核表达质粒(pCMV-HA)对小鼠视网膜新生血管RNV形成的抑制作用.方法 将鼠龄为7 d的56只C57BL/6J新生小鼠随机分为正常对照组、氧诱导视网膜病变(OIR)模型组、治疗组和空载体组,每组14只.后3组小鼠置于(75±2)%浓度的氧环境中饲养5 d后,回到正常空气环境中建立氧诱导的RNV动物模型.治疗组小鼠在出生后第12天出氧箱时行玻璃体腔注射血管能抑素pCMV-HA,空载体组注射等量空质粒.出生后第17天行伊凡思蓝(Evans blue)灌注血管造影视网膜铺片观察血管变化.石蜡切片行苏木精-伊红染色,光学显微镜下观察并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数.结果 视网膜铺片结果显示,治疗组较OIR模型组和空载体组视网膜血管分布均匀,新生血管和无灌注区显著减少.治疗组突破内界膜的内皮细胞核数与OIR模型组及空载体组比较,差异有统计学意义(F=39.006,P<0.001).结论 血管能抑素pCMV-HA对氧诱导的RNV有显著的抑制作用.     

PEDF对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜MCP-1表达的影响

目的：观察色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)在氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy，OIR)中对小鼠视网膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)和单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)表达的影响，探讨PEDF对缺血缺氧性视网膜病变的保护作用和机制。

方法：取7日龄C57BL/6J新生小鼠160只，将120只7日龄小鼠与哺乳母鼠共同置于氧浓度为(75±2)%的氧环境内饲养5d，然后返回正常氧环境中饲养5d，建立OIR模型； 40只小鼠始终置于正常氧环境饲养。分别于12日龄和14日龄给予PEDF药物治疗组小鼠右眼玻璃体腔注射PEDF(2μg/μL)各1μL，给予PBS治疗对照组和正常对照组小鼠右眼玻璃体腔注射等量的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)。所有小鼠于17日龄麻醉处死后取视网膜，采用视网膜铺片和Lectin染色法观察各组小鼠病理性新生血管的生成情况； Western-blot检测PEDF和MCP-1蛋白在各组小鼠视网膜的表达； 实时荧光定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测各组小鼠视网膜PEDF和MCP-1 mRNA的表达。

结果：视网膜铺片和Lectin染色结果显示OIR模型组RNV面积较正常组显著增大，差异有统计意义(P<0.01)，PEDF药物治疗组RNV面积较PBS治疗对照组明显减小，差异有统计意义(P<0.01)。Western-blot和RT-PCR结果显示，OIR模型组MCP-1蛋白和mRNA的表达水平均明显高于正常组，差异有统计意义(均P<0.05)； OIR模型组PEDF蛋白和mRNA的表达水平均明显低于正常组，差异有统计意义(均P<0.01)； PEDF药物治疗组MCP-1蛋白和mRNA的表达量较PBS治疗对照组均显著减少，差异有统计意义(均P<0.05)； PEDF药物治疗组MCP-1蛋白和mRNA的表达量较正常对照组升高，但差异均无统计学意义(均P>0.05)。

结论：PEDF能够抑制OIR小鼠视网膜新生血管形成，同时下调MCP-1在OIR小鼠视网膜的表达，后者可能是其抑制新生血管形成从而发挥视网膜保护作用的机制之一。     

慢病毒介导聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管的抑制作用

目的观察慢病毒介导聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子(PSF)对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜新生血管的抑制作用。方法5日龄C57BL/6J小鼠112只随机分为正常对照组、单纯OIR模型组、OIR模型+慢病毒空载体处理组(以下简称Vec组)及OIR模型+PSF慢病毒处理组(以下简称PSF组),分别为16、32、32、32只。小鼠7日龄时,正常对照组小鼠常规环境饲养;单纯OIR模型组、Vec组及PSF组小鼠建立OIR模型。小鼠12日龄时,Vec组、PSF组小鼠玻璃体腔分别注射滴度为1×1011 TU/ml的空载体病毒或PSF慢病毒1μl。正常对照组和单纯OIR模型组小鼠不再做任何处理。小鼠17日龄时,采用HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核;作视网膜铺片,测量各组小鼠视网膜无灌注区相对面积;采用实时定量PCR检测各组小鼠视网膜中NF-E2相关因子2(Nrf2)和血红素氧合酶1(HO-1)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测各组小鼠视网膜中Nrf2、HO-1及PSF的蛋白相对表达量。组间比较采用单因素方差分析。结果正常对照组、单纯OIR模型组、Vec组、PSF组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数分别为0.00、14.36±5.50、15.67±4.96、8.13±2.09个;视网膜无灌注区面积分别为0.00%、(35.71±2.81)%、(36.57±4.53)%、(15.33±4.75)%。4组间小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数及视网膜无灌注区面积比较,差异均有统计学意义(F=24.87、165.70,P<0.05)。组间两两比较,单纯OIR模型组、Vec组较正常对照组突破内界膜的血管内皮细胞核数增多,视网膜无灌注区面积增大;PSF组较单纯OIR模型组、Vec组突破内界膜的血管内皮细胞核数减少,视网膜无灌注区面积减小,差异均有统计学意义(P<0.05)。实时定量PCR及Western blot检测结果显示,4组间小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量(F=53.66、83.54)以及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量(F=58.38、52.69、24.79)比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。组间两两比较,单纯OIR模型组、Vec组小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较正常对照组明显降低,PSF组小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较单纯OIR模型组、Vec组明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒介导的PSF可通过上调Nrf2及HO-1的表达抑制OIR小鼠视网膜新生血管形成。     

Arresten在氧诱导小鼠视网膜新生血管形成中的抑制作用及机制

目的　探讨Arresten在氧诱导小鼠视网膜新生血管形成中的抑制作用及机制。方法　选取48只出生后7 d健康清洁级C57BL/6J幼鼠,随机分为氧诱导视网膜病变（oxygen induced retinopathy,OIR）组、OIR+ Arresten组和常氧组,每组16只。OIR+Arresten组及OIR组幼鼠在体积分数为（75±2）％的高氧环境下饲养5 d,然后转移至正常氧气环境中饲养5 d,其中OIR+Arresten组幼鼠于高氧饲养刚结束时,给予双眼玻璃体内注射Arresten蛋白。常氧组幼鼠则在常规氧气环境中连续饲养10 d。在鼠龄17 d时,各组取6只幼鼠经股静脉注射异硫氰酸葡聚糖溶液处死并摘出眼球,视网膜铺片后观察视网膜的血管形态、计算无灌注区面积。同时对小鼠眼球视网膜行石蜡切片和HE染色,计算侵入玻璃体内血管内皮细胞核的数量。同时,通过细胞培养实验,利用MTT法检测Arresten蛋白对人血管内皮细胞增殖的抑制作用。结果　视网膜铺片结果显示,常氧组、OIR组、OIR+Arresten组视网膜无灌注区相对面积分别为（2.35±1.62）％、（57.28±9.36）％和（20.38±8.69）％,三组间总体比较,差异有统计学意义（F=18.732,P<0.05）,且OIR组无灌注区相对面积显著高于OIR+Arresten组,差异有统计学意义（P<0.05）。常氧组小鼠视网膜的内界膜结构仍保持平滑完整,未发现有新生血管侵入玻璃体内。OIR组和OIR+Arresten组每张切片上血管内皮细胞核的数量分别为 （15.18±4.83）个、（7.33±3.88）个,其中OIR+Arresten组侵入玻璃体内新生血管内皮细胞核的数量显著低于OIR组,差异有统计学意义（P<0.05）。Arresten蛋白对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制率随着其浓度的升高而增加,但当Arresten蛋白浓度达到1000 μg·L^-1时,人脐静脉内皮细胞的增殖抑制率达到顶峰,为（58.00±0.65）％。结论　Arresten蛋白能够抑制氧诱导的小鼠视网膜新生血管形成,通过抑制血管内皮细胞增殖来抑制新生血管形成。     

雷珠单抗对氧诱导视网膜病变模型小鼠视网膜色素上皮衍生因子和高迁移族率蛋白1表达的影响

目的 通过玻璃体腔内注射雷珠单抗，观察小鼠氧诱导视网膜病变模型(OIR)中视网膜色素上皮衍生因子(PEDF)和高迁移族率蛋白1(HMGB1)的表达，探讨雷珠单抗对缺血缺氧性视网膜病变的保护作用和机制。方法 取7日龄健康级C57/B6J新生小鼠60只，随机分为正常对照组、OIR组、OIR+雷珠单抗组，每组20只。正常对照组于出生后7 d在正常环境中饲养至17 d, OIR组及OIR+雷珠单抗组于出生后7 d放置于体积分数(75±2)%氧气中，在此环境中饲养至12 d,之后在正常常氧环境中饲养至17 d。期间OIR+雷珠单抗组于12 d行右眼玻璃体腔内药物注射雷珠单抗1μl,各组小鼠均于17 d用1%戊巴比妥钠腹腔注射过量麻醉处死。行HE染色观察细胞形态及新生血管情况；行Western blot检测视网膜中PEDF、HMGB1的表达。结果 HE染色结果显示：正常对照组视网膜各层结构清晰，未见血管内皮细胞核突破内界膜；OIR组视网膜各层结构排列紊乱，可见内皮细胞核突破内界膜。Western blot结果显示：与正常对照组比较，OIR组PEDF在视网膜中表达量下降，HMGB1在视网膜中表达量升...     

玻璃体腔注射VAS2870对小鼠氧诱导视网膜病变的保护作用

目的：观察玻璃体腔注射VAS2870对C57小鼠氧诱导视网膜病变的影响。方法：将新生C57 BL/6 J小鼠随机分为3组,分别为正常对照组、VAS2870注射 OIR 组和无菌 PBS 缓冲液注射OIR组。将后两组小鼠在出生后第7 d ( P7)至P12置于体积分数为75%±2%的恒定高氧氧箱中以构建OIR模型,在 P12时给予幼鼠双眼玻璃体腔注射 VAS2870(0.5μL),另一组幼鼠双眼注射同等剂量的无菌PBS缓冲液。三组小鼠均在 P17时取右眼行视网膜铺片和Lectin染色,观察视网膜中央无血管区及病理性新生血管的情况;取右眼行视网膜组织定量检测 ROS/RNS 含量;取左眼应用RT-PCR检测Nox4 mRNA含量,并应用Western-blot测定视网膜组织中VEGF的表达。结果：VAS2870注射OIR组小鼠视网膜中央无血管区面积较无菌PBS缓冲液注射OIR组明显减少( P<0.05),病理性新生血管数目明显减少( P<0.05);VAS2870注射OIR组小鼠视网膜组织Nox4 mRNA的表达量明显低于无菌PBS缓冲液注射组;VAS2870注射OIR组小鼠视网膜组织ROS含量较无菌PBS缓冲液注射组明显降低( P<0.05);VAS2870注射OIR组小鼠视网膜组织VEGF的表达明显低于无菌PBS缓冲液注射组( P<0.05)。结论：在小鼠OIR模型中, VAS2870可抑制Nox4 mRNA的表达,减少ROS/RNS,下调VEGF的生成,在视网膜病变进程中具有保护作用。     

可溶性Tie2融合蛋白玻璃体腔注射对实验性视网膜血管新生和缺血性视网膜病变的影响

目的:观察可溶性Tie2融合蛋白(soluble Tie2 fusion pro-tein,sTie-Fc)对视网膜血管新生(retinal neovascularization,RNV)的抑制作用,同时分析其对缺血性视网膜病变的影响。方法:将生后7d的C57BL/6幼鼠置于高氧箱中饲养5d取回至正常空气环境诱导RNV模型,生后12d和14d选取一眼玻璃体腔注入人sTie-Fc0.67μg,对侧眼在相同时点注入人IgG作为对照。生后17d处死动物行视网膜铺片和免疫组织化学染色检查,测量视网膜血管无灌注区的面积,计数RNV内皮细胞核数目,定量分析sTie-Fc对于缺血性视网膜病变以及实验性RNV形成的影响。结果:对照组和实验组均成功建立了RNV模型,实验组RNV的形成受到抑制(P<0.05),同时sTie-Fc也加重了RNV模型的缺血过程(P<0.05)。结论:sTie-Fc可以抑制实验性RNV的发展,提示拮抗Tie2可能成为治疗RNV有效的生物学方法之一,其可能加重缺血性视网膜病变的潜在副作用需进一步探讨。     

氧诱导视网膜病变小鼠模型微小RNA表达谱分析

目的 分析氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型的微小RNA表达谱,筛选可能与视网膜新生血管(RNV)形成有关的微小RNA.方法 7日龄健康C57BL/6J小鼠52只随机分为正常对照组和OIR组,每组26只.OIR组建立OIR小鼠模型;正常对照组不做任何处理.小鼠17日龄时,行视网膜铺片,观察视网膜血管形态;行视网膜石蜡切片,计数突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数;行微小RNA芯片分析,检测具有差异表达的微小RNA,再应用实时聚合酶链反应(RT-PCR)进行验证.结果 正常对照组小鼠视网膜血管平滑、均匀有序分布;OIR组小鼠周边视网膜血管纡曲、紊乱并伴有新生血管芽,中央视网膜无灌注区明显.正常对照组、OIR组小鼠视网膜无灌注区的相对面积分别为(6.57±3.6)％、(25.81±2.12)％;OIR组小鼠视网膜无灌注区的相对面积较正常对照组明显增大,差异有统计学意义(t=28.71,P＜0.001).光学显微镜观察发现,正常对照组小鼠内界膜结构完整、平滑,血管内皮细胞排列整齐,偶见突破内界膜的血管内皮细胞核.正常对照组、OIR组平均每张切片突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数分别为(0.16±0.31)、(28.41±4.01)个.两组平均每张切片突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数比较,差异有统计学意义(t=54.45,P＜0.001).微小RNA芯片分析结果显示,与正常对照组比较,OIR组有21个微小RNA的表达发生了1.5倍以上的变化.其中,上调者9个,下调者12个.差异表达倍数≥3.0的微小RNA为miR-3078、miR-140、miR-29b、miR-29c.RT-PCR检测发现,差异表达倍数≥3.0的4个微小RNA,其表达趋势与芯片分析结果一致.与正常对照组比较,OIR组miR-3078的表达明显上调,差异有统计学意义(t=-2.380,P＜0.05);miR-140、miR-29b、miR-29c的表达明显下调,差异也有统计学意义(t=2.638、2.323、2,415,P＜0.05).结论 OIR小鼠模型的微小RNA表达谱中,miR-3078、miR-140、miR-29b、miR-29c的差异表达倍数≥3.0,其可能与RNV形成有关.     

Toll样受体4对氧诱导视网膜新生血管发生的促进作用及其机制

背景 研究发现,Toll样受体(TLRs)在视网膜新生血管的形成中发挥重要作用,但其作用机制尚不清楚. 目的 探讨TLR4对小鼠氧诱导视网膜病变(OIR)中新生血管生成的作用及其机制. 方法 将18只7日龄新生C57BL/6J小鼠以随机数字表法按小鼠窝别分为常氧组、OIR组及OIR+脂多糖(LPS)-EB组,常氧组小鼠在正常氧环境中饲养,OIR组及OIR+LPS-EB组小鼠于生后第7天(P7)与母鼠置于体积分数(75±2)％高氧氧箱中饲养5d以诱导OIR模型,于P12在正常氧环境中饲养,OIR+LPS-EB组P12小鼠腹腔内注射LPS-EB,剂量为1 mg/kg,OIR组同法注射PBS.各组摘取P17小鼠眼球于质量分数4％多聚甲醛中固定并行视网膜铺片和Lectin染色,计算视网膜无血管区和新生血管区面积占全视网膜的百分比.各组制备P17小鼠眼后节组织冰冻切片并行免疫荧光检测,计数小鼠5 mm视网膜全长活化小胶质细胞数目;采用CD11b和TLR4免疫荧光双标记法检测各组小鼠视网膜小胶质细胞中CD11b、TLR4的表达及其分泌血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平.结果 常氧组P17小鼠视网膜血管分布和形态正常,OIR组和OIR+LPS-EB组P17小鼠视网膜中央均出现无血管区和新生血管簇,OIR+LPS-EB组小鼠视网膜无血管区面积比为(18.47±1.32)％,新生血管面积比为(3.29±0.85)％,分别大于OIR组的(15.78±1.44)％和(1.77±0.19)％,差异均有统计学意义(t=3.36,P=0.01;t=4.22,P=0.00).免疫荧光结果显示,常氧组P17小鼠视网膜中活化小胶质细胞数量极少,OIR组和OIR+LPS-EB组P17小鼠视网膜中活化小胶质细胞荧光强度增强,活化小胶质细胞数量增加,其中OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中小胶质细胞数明显多于OIR组,差异有统计学意义[(95.50士4.77)/5 mm与(74.83±4.17)/5 mm,t=8.00,P＜0.01].常氧组小鼠视网膜中TLR4阳性小胶质细胞数量极少,OIR组和OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中TLR4荧光增强,TLR4阳性小胶质细胞数量明显增加,OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中TLR4阳性小胶质细胞数目明显多于OIR组,差异有统计学意义[(49.50±6.38)/5 mm与(28.17±6.24)/5 mm,t=5.86,P＜0.01)].常氧组P17小鼠视网膜中CD11b和VEGF/IL-1β/TNF-α共表达的小胶质细胞数量分别为(1.17±0.75)/5 mm、0和0,而OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中共表达CD11b和VEGF/IL-1β/TNF-α的小胶质细胞数量多于OIR组,差异有统计学意义[(44.50±8.78)/5mm与(28.50±5.61)/5 mm,F=44.07,P＜0.01;(24.10±6.49)/5 mm与(16.00±3.46)/5 mm,F=11.31,P＜0.01;(33.83±14.82)/5 mm与(23.00±2.83)/5 mm,t=19.92,P＜0.01]. 结论 TLR4可促进OIR小鼠视网膜新生血管的生成,其作用机制可能与TLR4激活视网膜小胶质细胞中相关的下游信号通路,促进血管生长因子及炎性因子的释放有关.     

玻璃体腔注射塞来昔布抑制大鼠视网膜新生血管的作用

目的:通过对大鼠氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)模型进行玻璃体腔注射塞来昔布,探讨塞来昔布在OIR中对视网膜新生血管的作用及其机制.方法:选取7天龄SD乳鼠96只随机分为6组:Z组:正常组;O组:OIR组;A组:OIR+溶媒对照组;B组:OIR+塞来昔布5μg组;C组:OIR+塞来昔布20μg组;D组:OIR+塞来昔布80μg组.除Z组在正常环境饲养外,其余各组乳鼠均建立OIR模型.乳鼠于生后第12 d出氧箱后给予玻璃体内注射二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)及相应剂量的塞来昔布,于生后第17 d处死,做组织切片HE染色观察视网膜组织形态并计数突破内界膜的血管内皮细胞核数,石蜡切片行免疫组化染色检测VEGF蛋白的表达.结果:HE染色显示,Z组、O组、A组、B组、C组、D组突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数分别为0.44±0.18、30.60±5.36、28.05±4.68、19.58±4.58、10.13±1.93、7.58±2.68个;除O组与A组外,各组间差异均有统计学意义(P<0.05),经塞来昔布治疗后,突破内界膜的血管内皮细胞核明显减少,且与剂量正相关;免疫组化结果显示,Z组VEGF蛋白表达呈阴性,表达率为10%,其余各组可见VEGF蛋白的阳性表达,O、A组阳性表达较高,阳性率分别为90%、86%,表现为棕褐色颗粒或团块,均高于B、C、D组,且三组的阳性表达依次减低为68%、42%、30%.结论:塞来昔布能够有效抑制大鼠OIR模型视网膜新生血管的生长,且抑制效果与剂量正相关,其作用可能通过抑制VEGF表达实现.     

夜间光照对氧诱导的视网膜病变小鼠视网膜新生血管形成的影响

背景 氧诱导的视网膜新生血管形成是多种视网膜血管性疾病的病理学基础,预防视网膜新生血管的形成可缓解视网膜病变对视网膜的损害程度.研究表明夜间睡眠时给予光照可能对早期糖尿病视网膜病变(DR)患者有利,但其对早产儿视网膜病变(ROP)患者视网膜新生血管有无影响报道较少.目的 观察夜间光照对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜新生血管形成的影响.方法 将64只SPF级新生C57BL/6J小鼠按随机数字表法随机分为正常对照组、单纯夜间光照组、OIR模型组、OIR联合夜间光照组,每组16只小鼠.正常对照组和单纯夜间光照组小鼠生长于正常空气(氧体积分数21％);OIR模型组和OIR模型联合夜间光照组小鼠于出生后第7天置于高氧环境(75％±2％)生长,出生第12天调整氧体积分数为正常;OIR联合夜间光照组和单纯夜间光照组于出生后第12～17天给予夜间光照,光照度为100 Ix.各组小鼠均于出生后第17天摘除眼球,采用ADP酶法制备视网膜铺片,了解视网膜血管的改变情况;视网膜组织切片行苏木精-伊红染色并计数突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数;免疫组织化学法观察各组小鼠视网膜中血管内皮生长因子(VEGF)的表达,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测各组视网膜中VEGFmRNA的表达.实验动物的使用和喂养遵循ARVO声明.结果 正常对照组和单纯夜间光照组小鼠视网膜血管形态均无明显差异.OIR模型组视网膜铺片显示视网膜中央部大片无血管区,大量结构异常的新生血管形成.与OIR模型组相比,OIR模型联合夜间光照组视网膜中央无血管区面积以及新生血管分布密度减少.在实验后第17天时,正常对照组和单纯夜间光照组视网膜新生血管内皮细胞核数分别为(0.97±0.83)个和(1.00±0.72)个,OIR模型组为(38.57±5.01)个,而OIR联合夜间光照组小鼠视网膜新生血管内皮细胞核数为(16.92±3.39)个,总体差异有统计学意义(F=78.767,P=0.000),OIR联合夜间光照组视网膜新生血管内皮细胞核数明显少于OIR模型组,差异有统计学意义(t=20.446,P＜0.01).免疫组织化学法检测显示OIR模型联合夜间光照组中VEGF蛋白表达明显少于OIR模型组.正常对照组、单纯夜间光照组、OIR模型组和OIR联合夜间光照组小鼠视网膜VEGF mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、0.94±0.07、2.08±0.50和1.43±0.21,各组间的总体差异有统计学意义(F=11.268,P=0.003),OIR模型联合夜间光照组表达较OIR模型组下调,差异有统计学意义(t=20.163,P＜0.05).结论 夜间光照可减少OIR小鼠视网膜新生血管的形成.     

抗血管内皮生长因子对氧诱导视网膜新生血管病变模型小鼠视网膜多巴胺含量的影响

目的　研究抗血管内皮生长因子（VEGF）融合蛋白康柏西普（Conbercept）玻璃体内注射对小鼠氧诱导视网膜新生血管病变（OIR）模型中视网膜多巴胺（DA）含量的影响。方法　普通级7 d龄C57BL/6小鼠100只,随机分为空白对照组、OIR组、OIR+生理盐水（NS）组及OIR+ Conbercept组,每组25只。其中空白对照组小鼠在常氧环境中饲养至17 d龄。OIR组、OIR+NS组及OIR+ Conbercept组小鼠通过高流量吸氧建立OIR模型,并在此环境中饲养至12 d龄,OIR+NS组和OIR+Conbercept组小鼠分别行右眼玻璃体内注射1 μL NS、1 μL Conbercept后,在常氧环境中饲养至17 d龄,处死。取各组小鼠右眼眼球行HE染色及视网膜铺片,观察突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数及血管分布;行Western blot检测各组小鼠视网膜中酪氨酸羟化酶（TH）、血管内皮生长因子（VEGF）表达量;行高效液相色谱仪检测各组小鼠视网膜DA含量。结果　空白对照组小鼠视网膜各层清晰,未见明显无灌注区及新生血管。与空白对照组相比,OIR组小鼠视网膜各层排列紊乱,视盘周围可见大片无灌注区,突破内界膜的血管内皮细胞核数、VEGF相对表达量均增加,TH相对表达量、DA含量均减少,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;OIR+NS组与OIR组相比,小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数、DA含量及VEGF、TH相对表达量差异均无统计学意义（均为P>0.05）;与OIR组及OIR+NS组相比,OIR+ Conbercept组小鼠视网膜各层排列较清晰,视盘周围可见小片状无灌注区,突破内界膜的内皮细胞核数、DA含量及VEGF、TH相对表达量均减少,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　OIR模型中视网膜DA含量及TH相对表达量均降低;玻璃体内注射Conbercept后,视网膜新生血管及VEGF相对表达量均减少,TH相对表达量、DA含量均进一步降低。     

特异性抑制富含半胱氨酸蛋白61干扰RNA对小鼠视网膜新生血管形成的抑制作用观察

目的 观察特异性抑制富含半胱氨酸蛋白61(CCN1)对氧诱导视网膜病变(OIR)模型小鼠视网膜新生血管(RNV)的抑制作用.方法 7日龄C57BL/6J小鼠120只,随机分为对照组和实验组,每组各60只.参照文献方法制备OIR模型.小鼠出氧箱前1d即鼠龄11d时,对照组、实验组小鼠玻璃体腔分别注射空载体质粒、CCN1siRNA表达质粒各1μl.视网膜铺片观察视网膜血管形态,病理切片计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数,免疫组织化学、蛋白免疫印迹法、实时定量聚合酶链反应检测CCN1、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白及mRNA的表达情况.结果 与对照组比较,实验组小鼠视网膜血管分布规则、分支良好、新生血管密度减少.两组间突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数量比较,差异有统计学意义(t=8.756,P＜0.05);CCN1、VEGF蛋白表达量比较,差异均有统计学意义(t=3.253、5.365,P＜0.05);CCN1、VEGF蛋白相对表达量比较,差异均有统计学意义(t=4.573、5.323,P＜0.05);CCN1、VEGFmRNA相对表达量比较,差异均有统计学意义(t=6.724、9.153,P＜0.05).结论 特异性抑制CCN1能有效抑制OIR模型小鼠RNV形成.     

氧诱导视网膜病变小鼠模型中参与p21调控的miRNA表达谱分析

目的观察氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜组织中miRNA的表达, 筛选与p21及视网膜新生血管(RNV)形成相关的miRNA。方法实验研究。40只健康7日龄C57BL/6J小鼠随机分为正常组和OIR组, 每组20只。OIR组构建氧诱导RNV模型, 正常组不做任何处理。小鼠17日龄时, 处死小鼠, 视网膜荧光铺片观察小鼠RNV发生情况;光学显微镜下计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核。取视网膜组织行miRNA芯片分析, 检测正常组与OIR组之间差异表达的miRNA。所得差异miRNA靶基因分别进行基于基因注释(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)的富集分析;通过Targetscan、MiRanda、MicroT-CDS数据库比对筛选可能与p21有关的miRNA及通路。组间两两比较采用独立样本t检验。结果与正常组比较, OIR组小鼠视网膜无灌注区面积、RNV及突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数量增加, 差异均有统计学意义(t=18.800、9.025, P<0.05)。与正常组比较, OIR组有统计学差异表达的miRNA 54个, 其中, 上调、下调者分别为47、7个。从...     

CCN1在氧诱导小鼠视网膜新生血管形成中的表达及意义

目的:研究富含半胱氨酸蛋白61(CCN1/Cyr61)在氧诱导小鼠视网膜新生血管(retinal neovascularization,RNV)中的表达及意义,探讨特异性抑制CCN1对RNV形成的抑制作用。方法:取C57BL/6J小鼠200只,随机分为对照组、高氧组、高氧对照组和CCN1治疗组,每组各50只。高氧对照组和CCN1治疗组分别玻璃体腔内注射空载体质粒和CCN1siRNA表达质粒。ADP酶视网膜铺片观察视网膜血管形态,HE染色计数突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数,免疫组织化学、Western blot和RT-PCR法检测CCN1蛋白及mRNA的表达情况。结果:高氧组和高氧对照组视网膜可见大片无灌注区和大量突破内界膜的新生血管内皮细胞核(25.25±1.26个;23.12±1.16个),CCN1治疗组较高氧组和高氧对照组的无灌注区及新生血管内皮细胞核数(8.47±1.15个)明显减少。高氧组和高氧对照组较对照组相比,CCN1蛋白及mRNA表达显著增高,CCN1治疗组较高氧组和高氧对照组显著减弱,均有统计学意义(均为P<0.05)。结论:CCN1的异常表达可能与RNV形成密切相关,特异性抑制CCN1能有效抑制RNV的形成,为预防和治疗ROP提供新的思路及对策。     

靶向血管内皮生长因子的RNA干扰抑制氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管生成的研究

目的探讨玻璃体腔注射靶向血管内皮生长因子（VEGF）的RNA干扰慢病毒抑制氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠视网膜新生血管生成的作用及其机制。方法实验研究。构建4对针对靶基冈小鼠VEGF的siRNA干扰载体,筛选并进行慢病毒包装。60只C57Bif6J小鼠分成4组（每组15只）：正常对照组．OIR模型组,OIR＋空载体组,OIR＋VEGF-RNA干扰组。OIR＋空载体组和OIR＋VEGF-RNA干扰慢病毒组的小鼠在生后第5天玻璃体腔注射相应的1μ1的7.5×10^7空载体慢病毒和VEGF-RNA干扰慢病毒。后3组小鼠在生后第7天建立OIR模型。第17天时FITC-Dextran灌注视网膜铺片观察4组小鼠视网膜血管形态及面积变化,视网膜铺片免疫荧光染色检测紧密连接蛋白Claudin-5和Occludin的分布变化．Westernblot检测VEGF、磷酸肌醇3激酶（P13K）、酪氨酸蛋白激酶SRC、磷酸化细胞外信号调节激酶（P-ERK）蛋白表达量的变化。数据采用单因素方差分析进行比较。结果FITC-Dextran灌注视网膜铺片显示正常组视网膜血管分布呈均匀网状;RNA干扰组新生血管面积（0．271399mm^2）明显较OIR模型组（1.212782mm^2）、空载体组（1．152504mm^2）少（F=449．924,P〈0．01）。OIR模型组和空载体组间差异无统计学意义,其余两两间差异均有统计学意义（P〈0．01）。视网膜铺片免疫荧光染色显示紧密连接蛋白Claudin-5和Occludin在RNA干扰组中与正常组相似,呈均匀光滑线性分布,而在OIR模型组、空载体组的分布中断、不均匀,在新生血管团中可见团块状的强荧光;VEGF的RNA干扰组中VEGF、P13K、酪氨酸蛋白激酶SRC和p-ERK的蛋白表达量较OIR模型和空载体组低。结论玻璃体腔注射靶向VEGF的RNA干扰慢病毒能有效抑制OIR小鼠模型中VEGF及其下游通路蛋白的表达．从而抑制视网膜新生血管的形成．为临床上早产儿视网膜病变的防治提供了新思路和新途径。     

苏拉明防治兔外伤性增生性玻璃体视网膜病变的研究

目的研究生长因子抑制剂苏拉明对外伤性增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)玻璃体中生长因子的影响及防治作用。方法将40只健康新西兰大白兔随机平均分为5组,除空白组外,其余均制备外伤性PVR模型。然后分别将生理盐水(0.1mL)和浓度分别为40g.L-1、60g.L-1和80g.L-1苏拉明(0.1mL)注入模型组和实验1、2、3组玻璃体腔内,空白组不进行注射。对眼底连续观察28d并对PVR进行分级,采用双抗夹心ELISA法和放射免疫方法分别检测玻璃体液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)的含量。结果造模后第28天,空白组、模型组及实验1、2、3组玻璃体腔中TNF-α含量分别为(0.245±0.346)μg.L-1、(3.984±0.302)μg.L-1、(3.024±0.163)μg.L-1、(2.038±0.239)μg.L-1、(1.285±0.151)μg.L-1;EGF含量分别为(0.180±0.385)μg.L-1、(1.025±0.092)μg.L-1、(0.540±0.073)μg.L-1、(0.274±0.069)μg.L-1、(0.242±0.322)μg.L-1。实验1、2、3组和空白组玻璃体腔中TNF-α和EGF含量均低于模型组,差异均有显著统计学意义(均为P<0.01)。实验1、2、3组玻璃体腔中TNF-α的含量均高于空白组,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。实验1组玻璃体腔中EGF的含量高于空白组,差异有显著统计学意义(P<0.01)。实验2、3组玻璃体腔中EGF的含量与空白组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。实验2、3组玻璃体腔中TNF-α和EGF含量均低于实验1组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。形态学上未发现明显视网膜毒副作用。结论苏拉明玻璃体腔注射安全有效,通过降低玻璃体中细胞因子TNF-α和EGF的含量,有效抑制了兔外伤性PVR的发展,为以后临床应用提供可靠的理论依据。     

两种检测小鼠氧诱导视网膜新生血管方法的比较

目的比较异凝集素视网膜铺片染色和硫氰酸葡聚糖荧光素心脏灌注视网膜铺片两种方法检测氧诱导视网膜病变(OIR)新生血管的优缺点,探讨视网膜新生血管染色方法的合理选择。设计实验研究。研究对象C57BL/6J乳鼠OIR模型8只,正常对照8只。方法 OIR组和正常对照组各4只鼠视网膜铺片异凝集素染色,各4只鼠硫氰酸葡聚糖荧光素心脏灌注视网膜铺片。3位观察者盲法利用图像分析软件计算视网膜铺片上视网膜血管无灌注区和新生血管面积。主要指标不同观察者计算的视网膜新生血管及无灌注区面积的一致性(α值)。结果异凝集素染色视网膜铺片上,不同观察者计算的视网膜新生血管及无灌注区面积α值分别为0.858、0.959;硫氰酸葡聚糖荧光素心脏灌注视网膜铺片上,不同观察者计算的视网膜新生血管及无灌注区面积α值分别为0.626、0.972。结论利用OIR模型研究视网膜新生血管时,异凝集素染色视网膜铺片和硫氰酸葡聚糖荧光素心脏灌注视网膜铺片均能清晰显示新生血管和无灌注区,前者在量化视网膜新生血管和无灌注区面积时均较可靠,而后者只适合于评价视网膜新生血管的灌注情况。     

重组腺相关病毒-色素上皮衍生因子抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管的作用

目的 观察重组腺相关病毒-色素上皮衍生因子(rAAV2-PEDF)对氧诱导小鼠视网膜新生血管(RNV)的作用.方法 选择3日龄C57/BL6小鼠22只,左眼为实验服,右眼为对照眼,微量注射器玻璃体腔分别注射rAAV2-PEDF和rAAV2-绿色荧光蛋白1μl.注射后立即将小鼠放入氧箱,建立氧诱导血管增生性视网膜病变模型.取13日龄小鼠4只提取视网膜总蛋白,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测色素上皮衍生因子(PEDF)蛋白表达.17日龄小鼠12只,荧光素心脏灌注视网膜铺片观察血管形态和分布.17日龄小鼠6只,视网膜冰冻切片外源凝集素标记后染色观察血管形态和分布.Image-Pro Plus5.1软件测量分析无荧光素灌注区和RNV的绝对面积和相对面积.结果 实验眼PEDF蛋白表达显著高于对照眼.视网膜铺片定量结果显示,实验眼和对照跟绝对无灌注区面积分别为(0.96±0.22)、(1.96±0.34)mm2,差异有统计学意义(t=-8.554,P<0.01);相对无灌注区面积分别为(8.64±1.52)%、(17.27±2.98)%,差异有统计学意义(t=-8.97,P<0.01).实验眼和对照眼绝对新生血管面积分别为(0.37±0.11)、(1.26±0.38)mm2,差异有统计学意义(t=-7.8,P<0.01);相对新生血管面积分别为(3.96±0.66)%、(11.45±2.06)%,差异有统计学意义(t=-8.51,P<0.01).外源凝集素标记定量结果显示,实验眼和对照眼RNV面积分别为(0.11±0.003)、(0.41 4-0.02)mm2,差异有统计学意义(t=-5.14,P<0.01).结论 rAAV2-PEDF可成功转染小鼠视网膜组织并稳定表达PEDF蛋白,不仅可以减少氧诱导血管增生性视网膜病变小鼠视网膜无灌注面积,而且可显著抑制RNV生成.     

改良视网膜墨汁灌注法观察先天性静止性夜盲对视网膜新生血管的影响

背景 先天性静止性夜盲(CSNB)是一种常见的眼科遗传性疾病.CSNB较少见到视网膜新生血管,其如何影响视网膜新生血管尚需深入探讨. 目的 改进视网膜墨汁灌注方法,并用于观察CSNB对视网膜新生血管生成的影响. 方法 选取清洁级7日龄SD大鼠和CSNB大鼠各18只,任意选取其中12只制作氧诱导视网膜病变(OIR)模型作为OIR模型组,其余6只作为正常对照组.OIR模型组SD大鼠和CSNB大鼠各9只按照随机数字表法随机分为体积比1∶1墨汁灌注组、体积比2∶1墨汁灌注组和单纯墨汁灌注组,分别灌注体积比1∶1墨汁灌注液、体积比2∶1墨汁灌注液和单纯墨汁灌注液各10 ml.取单侧眼球制作视网膜铺片,取另一侧眼球制作石蜡切片.观察并比较不同体积比墨汁灌注组视网膜血管成像质量.另取SD大鼠和CSNB大鼠OIR组各3只幼鼠与正常对照组幼鼠均按照此法灌注体积比2∶1墨汁灌注液.取各组石蜡切片行组织病理学观察并计数每张切片中突破内界膜细胞核的数量.免疫组织化学法检测视网膜中血管性血友病因子(v-WF)的表达.结果 体积比2∶1墨汁灌注组视网膜铺片中血管网成像质量较体积比1∶1墨汁灌注组和单纯墨汁灌注组高.组织病理学检查显示,正常对照组大鼠视网膜各层组织结构未见明显异常,SD大鼠和CSNB大鼠均未见突破内界膜的细胞核;OIR模型组可见大量内皮细胞核突破内界膜,OIR模型组中SD大鼠和CSNB大鼠突破内界膜的细胞核数量分别为(23.08±2.99)个/切片和(41.12±9.36)个/切片.CSNB大鼠突破内界膜的细胞核数量略高于SD大鼠,但差异无统计学意义(q=1.70,P=0.50).免疫组织化学检查结果显示,SD大鼠和CSNB大鼠突破内界膜的细胞v-WF均表达阳性. 结论 体积比2∶1墨汁明胶灌注液对大鼠视网膜血管成像质量优于单纯墨汁灌注液,是一种重复性好、操作简单的视网膜铺片方法.高氧可诱导CSNB大鼠视网膜新生血管生成.