IL-1ra及地塞米松对IL-1β诱导的人RPE增生的抑制

目的:观察IL-1ra及地塞米松对IL-1β诱导的RPE增生的抑制作用.方法:通过MTT比色实验观察IL-1ra及地塞米松对IL-1β促RPE增生的抑制作用.结果:IL-1ra(20～200 μ g/L)对加入IL-1β(2 μ g/L)培养的人RPE增生有明显的抑制作用,抑制率为9.4%～24.5%(P＜0.05);地塞米松在低浓度(10 mg/L)时刺激RPE增生,而在高浓度(35～70 mg/L)则表现为对IL-1β诱导RPE增生的抑制作用,抑制率为31.2%～43.9%(P＜0.05);IL-1ra(100 μg/L)联合地塞米松(35 mg/L)对IL-1β诱导RPE增生的抑制率40.6%,较两者单独使用的抑制率均高(P＜0.05).结论:IL-1β能促进培养的人RPE的增生,而IL-1ra及地塞米松可以抑制这种促增生作用.     

姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞中核因子-κB相关炎性因子表达的抑制作用

背景 白细胞介素-1β(IL-1β)是增生性玻璃体视网膜病变(PVR)早期释放的重要炎性因子,研究证实姜黄素能抑制IL-1β诱导的兔视网膜色素上皮(RPE)细胞的增生,但其是否能够对PVR发挥抗炎作用尚不清楚. 目的 观察姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞移行的影响,探讨姜黄素对IL-1β诱导的RPE细胞中炎性因子表达的影响.方法 采用对数生长期原代培养的第4代兔RPE细胞进行实验,在无血清DMEM培养基中分别添加0、0.1、1.0和10.0 μg/L的IL-1β作用于细胞24 h,分别采用Western blot和逆转录PCR法检测细胞中环氧合酶-2(COX-2)蛋白和mRNA的表达以筛选IL-1β最佳质量浓度.将培养的RPE细胞分为IL-1β组和姜黄素+IL-1β组,分别在无血清培养基中添加1.0 μg/L IL-1β和1.0μg/L IL-1β联合10 μg/ml姜黄素作用于细胞24、48和72 h,仅用无血清培养基培养的细胞作为对照组.培养的细胞行苏木精-伊红染色,于光学显微镜下计算进入损伤区的细胞数,比较各组细胞的移行能力;分别采用Western blot法和逆转录PCR法检测各组RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量,采用Western blot法检测并比较各组细胞中核因子-κBp65(NF-κBp65)蛋白和核因子κB抑制蛋白-α(IκB-α)的相对表达量;采用免疫化学染色法检测NF-κBp65、IκB-α和COX-2在各组RPE细胞中的表达和定位. 结果 初分离的兔RPE细胞呈球形,细胞中可见大量黑色素颗粒;第4代细胞色素颗粒明显减少,接近融合的细胞形态为长梭形,呈拉网状分布.免疫细胞化学染色法结果显示,细胞角蛋白(AE1/AE3)在细胞质呈阳性表达.对照组在培养24、48和72 h移行的细胞数分别为(31.93±1.21)、(36.27±2.50)和(38.33±2.40)个,IL-1β组分别为(45.73±2.30)、(71.13±1.92)和(80.60±1.71)个,而姜黄素+IL-1β组分别为(13.13±2.20)、(14.93±1.10)和(12.60±1.51)个,各时间点IL-1β组细胞移行细胞数均明显高于对照组,而姜黄素+IL-1β组移行细胞数均明显低于对照组和IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β质量浓度为1.0 μg/L时,RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量达峰,以1.0 μg/L IL-1β的剂量进行后续实验.细胞培养后24、48和72 h,姜黄素+IL-1β组细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量均明显低于IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β作用于细胞后48 h,细胞中NF-κBp65蛋白的相对表达量最高,与IL-1β组相比,各时间点姜黄素+IL-1β组细胞中NF-κBp65蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β组药物作用于细胞后48 h细胞中IκB-α降至最低,各时间点姜黄素+IL-1β组细胞中IκB-α值均明显高于IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).免疫细胞染色结果显示,IL-1β组RPE细胞的细胞核及细胞质中NF-κBp65呈强阳性表达,对照组表达较弱,姜黄素+ IL-1β组细胞中NF-κBp65的表达强度较IL-1β组明显降低;与对照组相比,IL-1β组细胞的细胞质中IκB-α表达强度明显减弱,而COX-2表达明显增强;与IL-1β组比较,姜黄素+IL-1β组细胞中IκB-α表达明显增强,而COX-2表达明显减弱.结论 姜黄素可抑制IL-1β引起的兔RPE细胞的移行,IL-1β通过激活NF-κB信号通路刺激细胞中COX-2的表达,姜黄素可通过阻断这一途径而抑制炎性因子的表达,从而发挥抗炎作用.     

白细胞介素-1β促人视网膜色素上皮细胞分泌血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的研究

目的 观察炎前因子白细胞介素-1β(IL-1β)对培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的影响.方法 采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定IL-β浓度为0、1、10、20 ng/ml和时间为24、36、48 h作用下RPE细胞的VEGF和bFGF分泌量变化;采用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定10 ng/ml IL-1β作用48 h后RPE细胞的VEGF和bFGFmRNA变化;噻唑蓝(MTT)比色法测定IL-1β刺激后RPE细胞的增生状态.结果 相同刺激时间即36 h作用下,终浓度为1、10 ng/ml的IL-1β促进RPE细胞VEGF的分泌(q=32.79,42.56;P<0.01);10 ng/ml的IL-1β促进bFGF的分泌(q=7.514,P<0.01);与浓度为10 ng/ml的IL-1β刺激相比,增加IL-1β刺激浓度至20 ng/ml使RPE细胞VEGF和bFGF分泌量下降(q=9.35,6.92;P<0.01).相同浓度即10 ng/ml的IL-1β作用下,IL-1β作用时间与RPE细胞VEGF和bFGF分泌量具有正性时间-效应关系;浓度为10 ng/ml的IL-1β作用48 h可促进RPE细胞的VEGF和bFGF mRNA水平;MTT结果 证明IL-1β未明显影响RPE细胞的增生状态(F=0.317,P>0.05).结论炎前因子IL-1β可影响人RPE细胞VEGF和bFGF的分泌量,在一定的作用浓度和作用时间范围内具有显著的促进效应.     

姜黄素和苏拉明抑制兔RPE细胞增生的对比研究

目的 对比研究姜黄素和苏拉明对兔视网膜色素上皮(RPE)细胞增生的抑制作用.以苏拉明为对照药,探讨姜黄素防治增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的潜在价值.方法 MTT法检测不同质量浓度姜黄素和苏拉明在各时间段对体外培养的RPE细胞增生的抑制率.相关回归分析计算两种药物各时间段的半数抑制率(IC50)剂量.流式细胞仪检测姜黄素和苏拉明对RPE细胞周期及细胞凋亡的影响,并且检测姜黄素作用不同时间后RPE细胞的凋亡率.结果 姜黄素和苏拉明对RPE细胞均有明显的抑制作用,呈时间和质量浓度依赖性.姜黄素在24、48、72及96h的IC50均明显低于苏拉明.姜黄素使RPE细胞阻滞在G0/G1期,早于苏拉明的G2/M期.姜黄素可以诱导RPE细胞凋亡,苏拉明则不能.姜黄素15μg/mL作用24、48及72h后,RPE细胞的凋亡率分别为(12.83±0.13)%、(32.27±4.51)%、(56.81±8.67)%.结论 姜黄素通过诱导RPE细胞凋亡而有效抑制其增生,比苏拉明药效强且起效快,有望成为防治PVR的理想天然药物.     

应用反义寡核苷酸沉默PDGFR-α表达对RPE细胞增生和凋亡的影响

背景 视网膜色素上皮( RPE)细胞能分泌血小板源性生长因子(PDGF),又具有PDGF受体(PDGFR),已有研究表明PDGF对增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的形成起着关键性作用. 目的 应用反义寡核苷酸( ASODN)技术抑制血小板源性生长因子受体-α(PDGFR-α)基因的表达,观察其对RPE细胞增生和凋亡的影响.方法 将人RPE细胞株在含质量分数10％胎牛血清的低糖DMEM培养基中进行培养,取对数生长期细胞调节细胞密度为5×105个/孔,接种于96孔板,待细胞生长至80％～90％融合时进行转染.空白对照组不加PDGFR-α ASODN及阳离子脂质体Lipofectamine 2000,1.0μmol/L Lipo-ASODN组、2.0μmol/LLipo-ASODN组使用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将靶向PDGFR-α基因的ASODN转染至RPE细胞株.细胞转染48 h后,MTT法检测各组细胞的吸光度(A)值并以A490表示,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PDGFR-α mRNA在RPE细胞中表达的变化;hoechst 33258荧光染色观察培养细胞的凋亡情况;流式细胞仪检测RPE细胞的细胞周期和凋亡率. 结果 空白对照组、1.0 μmol/L Lipo-ASODN组及2.0μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞的A490值分别为1.45±0.12、1.07±0.06、0.65±0.05,差异有统计学意义(F=97.72,P=0.00),1.0μmol/L Lipo-ASODN组和2.0 μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞A490值明显低于空白对照组,差异均有统计学意义( P=0.00、0.00);2.0 μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞A490值明显低于1.0 μmol/L Lipo-ASODN组,差异有统计学意义(P=0.00).Hoechst 33258荧光染色显示,转染PDGFR-α ASODN后RPE细胞凋亡数量多于空白对照组.流式细胞仪检测表明,转染PDGFR-α ASODN后RPE细胞阻滞于G0/G1期(F=206.70,P=0.00),1.0 μmol/L Lipo-ASODN组和2.0μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞凋亡率均明显高于空白对照组(37.8±1.3 vs 10.5±0.1,61.2±1.9 vs 10.5±0.1)(F=1808.90,P=0.00).PDGFR-α在RPE细胞中的表达随PDGFR-α ASODN浓度的升高有降低的趋势. 结论 利用ASODN技术沉默PDGFR-α基因表达可以显著抑制PVR过程中RPE细胞的增生,并能诱导其凋亡,不同浓度PDGFR-α ASODN转染后能下调PDGFR-α mRNA的表达,PDGFR-α基因的ASODN靶向技术为PVR的基因治疗提供了实验依据.     

姜黄素对兔视网膜色素上皮细胞DNA含量、线粒体膜电位及胞质内钙离子的影响

目的 探讨姜黄素对兔视网膜色素上皮细胞(RPE)DNA含量(凋亡率)、线粒体膜电位(Aψm)和胞质内钙离子(Ca2+)的影响.方法 实验研究.选取体外培养的第4代RPE细胞进行试验,分为姜黄素组和空白对照组(10% FBS-DMEM含二甲基业砜0.5‰),姜黄素组设10、15、20 mg/L 3个质量浓度.噻唑蓝(MTT)法检测姜黄素10、15、20 mg/L 3个质量浓度分别作用24、48、72及96 h后对体外培养的RPE细胞增殖72及96 h后对体外培养的RPE细胞增殖的抑制率.相关回归分析计算24、48、72及96 h的半数抑制率(IC50)剂量.流式细胞仪检测姜黄素15 mg/L作用8、24、48及72 h,后RPE细胞DNA含量(凋亡率)、△Ψm和胞质内Ca2+的变化.对抑制率分别在同浓度不同时间组间、同时间不同浓度组间进行方差分析(多个样本问两两比较);采用相关回归分析计算姜黄素各时间段半数抑制率剂最;对凋亡率、线粒体△Ψm、细胞质内Ca2+等对照组与姜黄素组间进行两独市样本t检验;对凋亡率、线粒体△Ψm、细胞质内Ca2+等姜黄素不同时间组间进行方差分析(多个样本间两两比较).结果姜黄素对RPE细胞有明显抑制作用,呈时间和剂量依赖件.姜黄素在24、48、72及96 h对RPE细胞的IC50分别是29.31、17.50、13.24及10.99 mg/L.姜黄素作用8、24、48、72 h后,RPE细胞质内Ca2+浓度明显升高与空白对照组相比,差异有统计学意义(t=7.50,10.61,20.74,21.14;P＜0.01)△Ψm明显下降,与对照组相比均有统计学意义(t=7.50,11.74,14.91,15.29;P＜0.01).姜黄素作用8 h DNA含量未见明显下降,24、48及72 h DNA含量明显下降(即凋亡率升高),与空白对照组相比均有统计学意义(t=10.00,14.68,13.68;P＜0.01).结论姜黄素可以使RPE细胞质内Ca2+浓度升高,△Ψm下降,进而使DNA含量明显下降,诱导RPE细胞凋亡.姜黄素可以有效抑制RPE细胞增殖,有望成为防治增生性玻璃体视网膜病变的理想天然药物.(中华眼科杂志.2009,45:210-215)     

转化生长因子-β诱导视网膜色素上皮细胞增殖中NLRP3炎症小体的表达及意义

目的　探讨转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）刺激下Nod样受体蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体在视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）增殖中的表达变化及意义。方法　利用TGF-β刺激RPE细胞增殖模拟增生性玻璃体视网膜病变模型，随机分为空白对照组（Sham组）和TGF-β诱导RPE细胞增殖组（TGF-β组），TGF-β组再根据浓度（0.5 μg·L^-1、2.5 μg·L^-1、10.0 μg·L^-1、12.5 μg·L^-1）分组。利用MTT 微量酶比色法检测RPE细胞增殖情况；Western blot观察NLRP3蛋白的表达变化；利用标准ELISA试剂盒检测白细胞介素（interleukin，IL)-1β和 IL-18表达情况。结果　与Sham组比较，0.5 μg·L^-1 TGF-β组RPE细胞增殖不明显，差异无统计学意义（P>0.05），但NLRP3、IL-1β和 IL-18表达明显提高（均为P<0.01）；2.5 μg·L^-1、10.0 μg·L^-1和12.5 μg·L^-1TGF-β组RPE细胞增殖明显，NLRP3、IL-1β和 IL-18表达均提高（均为P<0.05）；与0.5 μg·L^-1 TGF-β组相比，2.5 μg·L^-1、10.0 μg·L^-1和12.5 μg·L^-1TGF-β组RPE细胞增殖显著增加，NLRP3、IL-1β和 IL-18表达均下降，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　不同浓度TGF-β诱导RPE细胞增殖中NLRP3炎症小体表达变化不同，两者可能相互调控影响RPE细胞增殖，在增生性玻璃体视网膜疾病发生发展中具有重要的作用。     

姜黄素对兔视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

目的 探讨姜黄素对兔视网膜色素上皮（RPE）细胞增生的抑制作用及其作用机制。方法 选取第4代RPE细胞进行实验,分为姜黄素组和空白对照组,姜黄素组设10、15、20 μg/ml 3个质量浓度。噻唑蓝比色(MTT)法检测姜黄素10、15、20 μg/ml分别在24、48、72 、96 h对体外培养的RPE细胞增生的抑制率。线性回归分析计算各时间段的半数抑制率（IC50）剂量。流式细胞仪（FMC）检测姜黄素15 μg/ml作用72 h后对RPE细胞周期的影响,并且检测姜黄素15 μg/ml作用24、48、72 h后RPE细胞增生细胞核抗原（PCNA）的表达量和凋亡率。透射电子显微镜进行RPE细胞形态学检测。结果 姜黄素24、48、72、96 h的IC50分别是29.31、17.50、13.24、10.99 μg/ml。姜黄素使RPE细胞阻滞在G0/G1期。姜黄素15 μg/ml作用24、48、72 h后,RPE细胞的PCNA表达量分别为（565.04±23.60）,（473.61±36.88）,（396.15±32.45）,凋亡率分别为（12.83±0.13）%,（32.27±4.51）%,（56.81±8.67）%,各浓度组与对照组相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）。透射电子显微镜显示RPE细胞出现凋亡特征。结论 姜黄素可以影响RPE细胞的PCNA合成,诱导其凋亡,从而有效抑制RPE细胞增生。姜黄素有望成为一种有效的防治PVR的天然药物。     

姜黄素对IL-1β诱导视网膜色素上皮细胞分泌IL-8和sICAM-1的影响

目的:研究姜黄素对IL-1β诱导RPE细胞分泌IL-8和sICAM-1的影响。方法:RPE细胞经含4mL/LFBS的DMEM/F12同步后分为四组:①rhIL-1β干预组;②rhIL-1β 姜黄素组,姜黄素分5mg/L和10mg/L两个浓度;③姜黄素组,只分别加入5mg/L和10mg/L姜黄素;④空白对照组(4mL/LFBS DMEM/F-12)。所有样本干预24h后收集培养上清液和该孔细胞蛋白裂解液。ELISA法检测rhIL-1β(5μg/L)和姜黄素诱导hfRPE细胞分泌IL-8和sICAM-1的量。结果:rhIL-1β(5μg/L)组RPE细胞分泌的IL-8和sICAM-1分别比空白对照组升高了20倍和8倍,加入姜黄素能显著抑制其分泌。5mg/L姜黄素使IL-8和sICAM-1含量分别降低了36.88%和14.90%,10mg/L则分别达到55.73%和41.78%。姜黄素本身不刺激hfRPE细胞分泌IL-8和sICAM-1。结论:姜黄素可显著抑制IL-1β刺激的RPE细胞分泌炎前因子IL-8和sICAM-1,有可能防止PVR的发生。     

丹参单体、三氟拉嗪对视网膜色素上皮细胞增殖抑制的研究

目的研究丹参单体(IH764-3)和三氟拉嗪对体外培养的兔视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞增殖的抑制作用。方法将传代培养的RPE细胞分别加药培养24h、48h、72h、96h、120h,应用二甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测不同剂量丹参单体和三氟拉嗪对RPE细胞的抑制作用,进一步检测两药半数抑制剂量(IC50)联合应用对RPE细胞的抑制作用。结果丹参单体和三氟拉嗪对RPE细胞的增殖均有抑制作用,呈时间及剂量依赖性,各剂量及各时间点相比差异均有显著统计学意义(均为P<0.01),丹参单体的IC50为15.22μmol·L-1(2.4mg·L-1),三氟拉嗪的IC50为18.09μmol·L-1。联合用药120h对RPE的抑制率达87.23%,联合用药后各时间点与单独应用丹参单体及三氟拉嗪的抑制率比较,差异也均有显著统计学意义(均为P<0.01)。结论丹参单体和三氟拉嗪对RPE细胞的增殖均有抑制作用,两药联合后可产生协同作用,为以后两种药物的联合体内试验提供了一定的实验基础。     

三氧化二砷对表皮生长因子诱导的视网膜色素上皮细胞增生和迁移的影响

背景 细胞因子失衡所导致的视网膜色素上皮(RPE)细胞的异常增生和迁移是增生性玻璃体视网膜病变( PVR)的主要病理变化之一.三氧化二砷(As2O3)是中国传统中药中的有效成分,可有效抑制肿瘤细胞的增生和迁移.但As2O3对细胞生长因子引起的RPE细胞增生和迁移的影响尚未明确. 目的 探讨As2O3对表皮生长因子(EGF)诱导的ARPE-19细胞增生和迁移的影响.方法 用无血清培养基对RPE细胞系ARPE-19细胞进行培养,将终浓度为0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 μmol/L的As2O3分别加入到无血清培养基和含10 mg/L EGF的ARPE-19细胞培养液中作用24 h和48 h,通过噻唑蓝(MTT)比色法检测各培养组ARPE-19细胞活性的吸光度(A)值,以探讨As2O3对细胞的药物毒性作用,并筛选安全、有效的As2O3作用浓度.用10 mg/L EGF加入培养基诱导ARPE-19细胞迁移,分别在培养板中加入0、0.5、1.0、2.0μmol/L As2O3 作用24 h和48 h,并通过划痕试验和Transwell试验检测As2O3对EGF诱导的ARPE-19细胞迁移的影响.结果 MTT法检测发现不同浓度As2O3组作用24 h和48 h后,无血清培养组细胞A值随As2O3浓度的升高而逐渐下降,总体差异有统计学意义(F浓度=38.269,P=0.000;F时间=0.874,P=0.358).与空白对照组(0μmol/LAs2O3组)比较,0.5～ 5.0 μmol/L As2O3组ARPE-19细胞A值的差异均无统计学意义(P＞0.05).对含10 mg/LEGF组的ARPE-19细胞,药物对细胞A值的影响呈现浓度和时间依赖性(F浓度=152.155,P=0.000;F时间=51.649,P=0.000).与对照组比较,0.5～2.0μmol/L As2O3加入24 h和48 h后,A值的变化差异均无统计学意义(P＞0.05),而0.5、1.0、2.0μmol/L As2O3加入10 mg/L EGF诱导的ARPE-19细胞中作用24h和48 h后,A值的变化差异均无统计学意义(F浓度=2.215,P=0.126;F时间 =2.230,P=0.155).5.0 ～20.0 μmol/L As2O3作用于EGF诱导的ARPE-19细胞中作用后,细胞A值明显下降,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),5.0～20.0 μmol/L As2O3作用24 h后,对EGF诱导的ARPE-19细胞增生抑制率分别为12％、32％、37％;作用48 h后细胞抑制率分别为39％、44％和53％.划痕试验结果显示,0.5～2.0 μmol/L As2O3对EGF诱导的ARPE-19细胞的横向迁移具有抑制作用.Transwell试验结果表明,0.5～2.0 μmol/L As2O3对10 mg/L EGF诱导的ARPE-19细胞纵向迁移有明显的抑制作用,0.5、1.0、2.0μmol/L As2O3作用12h对ARPE-19细胞的抑制率分别为22％、33％和46％. 结论 As2O3在一定浓度范围内对ARPE-19细胞无毒性作用,2.0 μmol/L以下浓度的As2O3对EGF诱导的ARPE-19细胞增生无明显影响,但可影响细胞的迁移能力,5.0 μmol/L以上浓度的As2O3可明显抑制ARPE-19细胞的增生.     

雷帕霉素对人视网膜色素上皮细胞增生和凋亡的影响

背景雷帕霉素（RAPA）是哺乳动物RAPA靶蛋白（mTOR）特异性抑制剂,能有效抑制晶状体上皮细胞（LECs）及多种肿瘤细胞增生并具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用,研究其对视网膜色素上皮（RPE）细胞是否具有类似作用对临床上预防和治疗增生性玻璃体视网膜病变（PVR）具有重要意义。目的研究RAPA对体外培养的人RPE细胞增生和凋亡的影响。方法对人RPE细胞（D407细胞株）进行体外传代培养,按照培养基中加入药物的不同将培养的细胞分为9组,空白对照组进行常规培养;二甲基亚砜（DMSO）对照组在培养基中加入质量分数0．1％。DMSO;实验各组将5、10、20、40、80、160、320nmol／LRAPA分别加入培养基中并分别培养12、24、48h。应用噻唑蓝（MTT）法检测各组吸光度（A490）值并计算各组人RPE细胞增生的抑制率,应用Hoechst染色法检测各组人RPE细胞的凋亡率,评价上述各浓度RAPA作用不同时间后对人RPE细胞增生和凋亡的影响。结果不同浓度RAPA组对人RPE细胞的抑制率随浓度的增高而明显升高,差异有统计学意义（F=484．451,P〈0．01）,20～320nmol／LRAPA组在各时间点所测细胞增生抑制率均明显高于DMSO溶剂对照组,差异均有统计学意义（P〈0．01）。RAPA对细胞增生的抑制率随作用时间的延长明显增加,差异有统计学意义（F=232．262,P〈0．01）,各浓度的RAPA作用24h和48h后细胞增生的抑制率均明显高于12h,差异均有统计学意义（P〈0．05）。与空白对照组及溶剂对照组比较,10nmol／LRAPA作用12、24、48h均有诱导细胞凋亡的作用,差异均有统计学意义（P〈0．05）;20～320nmol／LRAPA组细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义（P〈0．叭）。各浓度RAPA组随作用时间的延长人RPE细胞的凋亡率明显增加（F=625．584,P〈0．01）。Hoechst33258染色可见凋亡细胞核碎裂并呈块状致密浓染,染色质固缩。结论RAPA以浓度和时间依赖的方式抑制体外培养的人RPE细胞增生并诱导其凋亡。     

shRNA抑制人RPE细胞中HIF-1α表达下调后IGF-1对VEGF表达的影响

背景 增生性玻璃体视网膜疾病(PVD)是一组眼底视网膜血管性疾病,主要由视网膜色素上皮( RPE)细胞增生所致,胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和血管内皮生长因子(VEGF)与RPE细胞的异常增生和病理性新生血管生成有关,但其信号机制及功能尚不完全明了. 目的 探讨利用小发卡环核糖核酸( shRNA)使人RPE细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)基因沉默后,IGF-1对VEGF表达的影响. 方法 收集健康男性供体眼球4只,分离、收集、培养RPE细胞,用SABC法行抗人角蛋白免疫细胞化学染色进行鉴定.用体外转录法合成针对HIF-1α mRNA序列靶点的shRNA,对3～5代RPE细胞的HIF-1α进行干扰后再经50 μg/L IGF-1处理24 h,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测人RPE细胞中HIF-1α及VEGF mRNA的表达,采用Western blot法检测人RPE细胞中HIF-1α及VEGF蛋白的水平.结果 分离培养的细胞呈扁平不规则多角形,97％的细胞对人角蛋白呈阳性反应.50 μg/L IGF-1作用后,人RPE细胞HIF-1α mRNA表达量(1.49±0.18)与0 μg/L IGF-1组(1.46±0.17)比较差异无统计学意义(t=0.335,P=0.743),而HIF-1α蛋白表达量(1049.86±172.54 vs 0.00±0.00)、VEGF mRNA(0.95±0.15 vs 0.35±0.07)及VEGF蛋白(391.98±56.77 vs 214.36±37.15)表达量均明显增高,差异均有统计学意义(t=16.098、9.935、6.928,P＜0.05).shRNA干扰HIF-1α mRNA表达后,RNAi转染组HIF-1α、VEGF mRNA及其蛋白水平较RNAi空白对照组及RNAi-C转染组明显下降,3个组间各指标的总体比较差异均有统计学意义(F=68.679、89.904、21.770、6.205,P＜0.05). 结论 IGF-1可通过促进人RPE细胞中HIF-1α蛋白的累积诱导VEGF的表达,是导致PVD重要的细胞因子之一.     

缺氧条件下1-磷酸鞘氨醇对人视网膜色素上皮细胞的促增生和抗凋亡作用

背景 1-磷酸鞘氨醇(S1P)是一种具有生物活性的脂质,是细胞内重要的信使分子,参与多种生物过程的调节,如细胞增生、迁移、分化、凋亡等.缺氧不仅是脉络膜新生血管(CNV)的关键始发因素,也是许多眼部疾病的病理基础,而视网膜色素上皮(RPE)细胞也参与缺氧后新生血管的形成,缺氧条件下S1P对人RPE细胞增生和凋亡的影响尚不清楚. 目的 观察缺氧条件下S1P对人RPE细胞增生和凋亡的影响,从而揭示S1P在CNV中的作用机制.方法 体外培养人RPE细胞株并进行传代,3～5代的RPE细胞分为6个组,空白对照组细胞进行常规培养,缺氧组细胞用200.00 μmol/L CoCl2培养细胞2h,不同浓度S1P干预组(0.01、0.10、1.00、10.00 μmol/L)用200.00 μmol/L CoCl2培养细胞2h后加入相应浓度的S1P,采用WST-1试剂盒检测各组细胞的吸光度(A)值;采用Hoechst染色检测各组细胞的凋亡情况,计算并比较各组细胞的凋亡率.结果 培养的细胞生长良好,可见细胞质内的色素颗粒.WST-1试剂盒检测显示,空白对照组细胞增生值(A值)为0.91 ±0.08,缺氧组为0.37±0.09,0.01、0.10、1.00和10.00 μmol/L S1P组分别为0.46±0.08、0.52±0.09、0.61 ±0.06和0.70±0.10,各组间的差异有统计学意义(F=21.104,P=0.000),不同浓度S1P组A值均明显高于缺氧组,且随S1P浓度的升高而增加,差异均有统计学意义(均P＜0.05);不同浓度的S1P组细胞存活率均明显高于缺氧组.Hoechst染色显示,空白对照组RPE形态正常,可见少数凋亡细胞;缺氧组可见大量凋亡细胞,细胞核呈淡蓝色,染色质浓缩;S1P干预后凋亡细胞数较缺氧组减少,随着S1P浓度的增加,凋亡细胞数逐渐减少.空白对照组凋亡率为(1.21±0.08)％,缺氧组为(8.99±0.09)％,0.01、0.10、1.00和10.00 μmol/L S1P组的细胞凋亡率分别为(6.60±0.08)％、(5.95±0.09)％、(4.81±0.06)％和(3.96±0.10)％,6个组间细胞凋亡率的总体差异有统计学意义(F=25.070,P=0.000),与缺氧组比较,各S1P组细胞凋亡率均明显降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05),且随S1P的浓度升高其凋亡率逐渐降低.结论 缺氧条件下S1P对人RPE细胞的增生有促进作用,对细胞凋亡有抑制作用.     

肝细胞生长因子对培养的视网膜色素上皮 细胞移行及增生的作用

目的研究肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)对视网膜色素上皮 (retinal pigment epitheliaum, RPE) 细胞的促增生和促移行作用。方法在无血清培养液培养的人RPE细胞中分别加入1、2、10、50、100 μg/L不同浓度的HGF,四唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)测定促细胞增生情况; 采用RPE细胞损伤愈合模型,在无血清培养液中分别加入1、2、10、50、100 μg/L 不同浓度的HGF,培养20 h后计数进入刮痕区的细胞,观察HGF对RPE细胞移行的作用。结果HGF浓度处于10 ～100 μg/L时对RPE细胞具有促增生作用(P<0.05或P<0.01), 增生率为18.2 %～34.8 %,其中浓度为50 μg/L作 用3 d达到最大促增生效果(P<0.01）,增生率为32.8 %;HGF可明显促进RPE细胞移行,促移行能力分别为113.0 %(10 μg/L), 91.7 %(50 μg/L) 和50.3 %(100 μg/ L )。浓度自2 μg/L开始出现促细胞移行作用(P<0.05),促移行能力为9.3 %。结论HGF可促进RPE细胞增生和移行,是RPE细胞的有丝分裂原和强力的促移行因子。(中华眼底病杂志,2001,17:307-310)     

曲安奈德对缺氧条件下培养人RPE细胞HSP47表达的影响

目的 探讨曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)对体外缺氧培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞热休克蛋白47(heat shock protein 47,HSP47)表达的影响.方法 使用化学缺氧诱导剂CoCl2模拟人RPE细胞缺氧环境,人RPE细胞分别在不同浓度TA的条件下培养,将其分为0 μg·L-1 TA组、0.05 μg·L-1 TA组和0.20 μg·L-1 TA组,均加入含150 μmool·L-1 CoCl2的DMEM完全培养液采用RT-PCR检测HSP47表达,使用Western-blotting检测HSP47的蛋白水平.结果 0 μg·L-1 TA组、0.05 μg·L-1 TA组和0.20 μg·L-1 TA组HSP47 mRNA的表达量分别为1.53±0.21、1.15±0.20、1.07±0.17,HSP蛋白表达量分别为748.62±79.03、643.76±63.18、615.62±61.77,3组间HSP47 mRNA及蛋白表达量差异均有统计学意义(F=14.729,P=0.000;F=9.438,P=0.001);0.05 μg·L-1 TA组与0 μg·L-1 TA组比较,HSP47 mRNA及蛋白的表达量均显著下降(P=0.000、P=0.003);0.20 μg·L-1 TA组与0 μg·L-1 TA组比较,HSP47 mRNA及蛋白的表达量也均显著下降(均为P=0.000);而0.05 μg·L-1 TA组与0.20 μg·L-1 TA组比较,HSP47 mRNA及蛋白的表达量差异均无统计学意义(P=0.373、P=0.392).结论 HSP47对胶原的成熟起着重要的作用,TA能有效地抑制缺氧条件下人RPE细胞HSP47的表达,可能是其防治增生性玻璃体视网膜病变的一个重要机制.     

表皮生长因子对人视网膜色素上皮细胞增生及移行的影响

目的　观察表皮生长因子 (epidermalgrowthfactor,EGF)及血清对体外培养的人视网膜色素上皮 (retinalpigmentepithelium ,RPE)细胞增生及移行的影响。 方法　对培养的人 3～ 6代RPE细胞采用MTT比色法观察不同浓度的EGF(0 .1、1、10、5 0、10 0 μg·L-1)及血清对人RPE细胞增生的影响 ;应用RPE细胞损伤模型 ,计数进入缺损区的细胞 ,定量观察EGF及血清对RPE细胞移行的影响。结果　在细胞增生的实验中 :无血清组 ,10～ 10 0 μg·L-1EGF达到最佳刺激浓度 ,其增生率为 81.8% ;5 0mL·L-1血清组 ,1～10 μg·L-1EGF的刺激作用最强达到 12 2 .7% ;无血清组与 5 0mL·L-1血清组间有显著性差异 (P <0 .0 0 1) ,且 5 0mL·L-1血清可明显促进人RPE细胞的增生 (P <0 .0 0 1)。在细胞的移行实验中 :无血清组 ,1～ 10 0 μg·L-1EGF可促进RPE细胞移行 ,但作用较弱 ;10 0mL·L-1血清组中 1～ 10 μg·L-1EGF促移行作用最强达 4 38.9% ;1～ 10 0 μg·L-1EGF的促进基础RPE细胞移行能力 (最强为 36 % )低于 10 0mL·L-1血清诱导的RPE细胞的移行能力 (强度为 14 7% ) ;无血清组与 10 0mL·L-1血清组间有显著性差异 (P <0 .0 0 1)。结论　EGF对体外培养的人RPE细胞具有浓度依赖性促增生和移行的作用 ;血清自身也具有此作用     

姜黄素对人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

背景姜黄素是从姜的根茎中提取的物质,可抑制多种内皮细胞和上皮细胞的增生,但其抑制视网膜色素上皮（RPE）细胞增生的作用及机制鲜见报道。目的研究姜黄素对体外培养的人RPE细胞增生的抑制作用及机制。方法第5代人RPE细胞株接种于96孔板,分别加入5、10、15、20mg／L姜黄素分别作用24、48和72h,未加入姜黄素的作为对照,采用水溶性四氮唑-1（WST-1）检测各组人RPE细胞的增生情况和细胞活性（A值）;采用流式细胞术检测姜黄素作用后RPE细胞的凋亡率、坏死率和不同细胞周期的细胞比例;透射电子显微镜（TEM）观察细胞超微结构的变化;采用Westernblot法检测RPE细胞中促凋亡因子p53、p21WAF1/CIPI和增生细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达。结果WST-1检测显示,随着姜黄素质量浓度的增加,人RPE细胞的』4值逐渐降低,差异有统计学意义（Fm质量浓度=96．55,P=0．00）;随着姜黄素作用时间的延长A值逐渐增加,差异有统计学意义（FH目=4634．28,P=0．00）。流式细胞术检测表明,15mg／L姜黄素作用48h早期凋亡细胞率为（13．37±1．26）％,明显高于对照组的（7．03±0．37）％,差异有统计学意义（t=8．33,P=0．00）,姜黄素作用72h,早期凋亡细胞率及中晚期凋亡细胞率分别为（15．97-＋0．16）％和（0．26-＋0．03）％,明显高于对照组的（7．29±0．37）％和（O．14±0．02）％,差异均有统计学意义（t=37．80、7．44,均P=0．00）。15mg／L姜黄素作用48h后人RPE细胞处于G。／G,期细胞比例为（57．17±1．17）％,明显低于对照组的（67．73±1．10）％,差异有统计学意义（t=11．40,JP=0．00）。姜黄素作用后人RPE细胞可见线粒体肿胀和空泡样变性。Westernblot检测显示,15mg／L姜黄素作用24、48、72h后p53和p21WAF1/CIPI蛋白相对表达值均明显高于对照组,差异均有统计学意义（均P〈0．05）,而15mg／L姜黄素作用24、48、72hPCNA蛋白的相对表达水平明显低于对照组,差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论姜黄素可有效抑制体外培养的人RPE细胞增生,其抑制作用呈剂量和时间依赖性,其作用机制可能与p53信号通路有关。     

植物凝集素诱导甲状腺相关眼病患者外周单核细胞与眼眶成纤维细胞共培养体系分泌IL-6、IL-17A的研究

背景 甲状腺相关眼病(TAO)的致病机制尚未明确,目前认为其是一种自身免疫性疾病,研究证实白细胞介素-17A(IL-17A)在多种自身免疫性疾病的发生和发展中起着重要作用,但其是否参与TAO的发病过程目前尚不明确. 目的 探讨培养外周血单个核细胞(PBMCs)与眼眶成纤维细胞(OFs)共培养体系中分泌的IL-17A是否参与TAO的发病过程及其可能的作用机制. 方法 采集2014年4-12月在中南大学湘雅医院确诊的12例TAO患者的外周血及眼眶结缔组织作为TAO组,并采集同期因先天性眼球萎缩行义眼台植入术的8例患者外周血及眼眶结缔组织作为对照组,采用密度梯度离心法提取所有受试者血中PBMCs,采用组织块培养法培养OFs.采用流式细胞仪检测PBMCs中T淋巴细胞纯度,分别用Giemsa染色法和免疫组织化学法鉴定培养的OFs.以1∶20的比例将OFs与PMBCs在U型96孔板中共培养以建立共培养体系,分别在各组共培养体系中加入0、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/ml植物凝集素(PHA)刺激72 h,用ELISA法检测共培养体系上清液中IL-6、IL-17A质量浓度以及共培养体系细胞膜中总IL-17A受体(IL-17RA)的质量浓度.比较不同质量浓度PHA作用后各组共培养体系上清液中IL-6、IL-17A、IL-17RA质量浓度的差异. 结果 TAO组和对照组PBMCs中T淋巴细胞的纯度分别为(81.10±0.21)％和(80.05 ±0.38)％,组间差异无统计学意义(t=0.923,P＞0.05).体外培养的OFs对Vimentin呈阳性反应,Giemsa染色阳性,证实为成纤维细胞.1.0 μg/ml PHA作用后共培养体系中PBMCs和OFs增生能力最强,PHA质量浓度＞1.0μg/ml时,PBMCs出现凋亡,OFs增生明显减弱,相同质量浓度PHA作用下,TAO组的PBMCs和OFs增生均较对照组快.不同质量浓度PHA作用下TAO组与对照组共培养体系IL-6、IL-17A和IL-17RA质量浓度总体比较,差异均有统计学意义(IL-6:F分组=12.561,P=0.000;F质量浓度=23.356,P=0.001.IL-17A:F分组=12.037,P=0.000;F质量浓度=19.206,P=0.000.IL-17RA:F分组=16.216,P=0.000;F质量浓度=4.627,P=0.018).1.0μg/ml PHA作用后各组共培养体系上清液中IL-6、IL-17A和IL-17RA质量浓度均达峰值,随着PHA质量浓度的增加,IL-6、IL-17A和IL-17RA质量浓度均逐渐下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05);相同质量浓度PHA作用下TAO组共培养体系上清液中IL-6、IL-17A、IL-17RA质量浓度明显高于对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 1.0 μg/ml PHA刺激可增强共培养体系中PBMCs和OFs的增生及免疫炎性因子的分泌,IL-17A能够放大细胞免疫反应和炎症反应,从而参与TAO的发病过程.     

炎性细胞因子对色素上皮细胞衍生因子表达的影响

目的 观察肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素（IL）-6、IL-8等炎性细胞因子对视网膜色素上皮细胞衍生因子（PEDF）表达的影响。方法 原代培养人视网膜色素上皮 (RPE）细胞，取3～5代细胞分别以浓度为20.00、2.00 、0.20 、0.02 ng/ml的TNF-α、IL-6、IL-8干预6、12、24、48 h，蛋白免疫印迹方法检测培养液中PEDF蛋白质的表达水平。 结果 TNF-α、IL-6、IL-8对人RPE细胞PEDF的分泌均有抑制作用，并且其抑制作用随着3种炎性细胞因子浓度的增加和作用时间的延长而增强；在浓度0.02 ng/ml、作用时间6 h（F=7.14，P＜0.05)，浓度2.00ng/ml、作用时间48 h（F=14.05，P＜0.01)，浓度20.00ng/ml、作用时间24 h（F=11.53，P＜0.01) 3种作用条件下,对PEDF分泌抑制作用的差异具有统计学意义，其中TNF-α干预组PEDF的表达量最低，对人RPE细胞PEDF的分泌抑制作用最明显（F＝14,P＜0.01）。结论 TNF-α、IL-6、IL-8能够下调体外培养的人RPE细胞PEDF蛋白质的表达。