内源性大麻素对缺氧缺糖视网膜神经节细胞损伤的保护作用

背景 急性视网膜缺血缺氧性损伤在眼科较为常见,如青光眼急性发作、视网膜中央动脉阻塞、缺血性视神经病变等,可引起视网膜的缺血缺氧损伤,并可致视网膜神经节细胞(RGCs)的死亡.内源性大麻素(CB)及其受体(CBR)参与中枢神经系统外伤、缺血、炎症及中毒等多种生理病理过程. 目的 探讨视网膜神经节细胞(RGCs)在缺氧缺糖损伤中内源性CB的作用及意义.方法 取6周龄正常C57BL/6J小鼠眼球,制备小鼠视网膜垂直冰冻切片,采用免疫荧光染色法检测和验证CB1R和CB2R在RGCs中的表达.10只C57 BL/6J新生鼠浸入75％乙醇消毒后取眼球,在冰上预冷的DMEM培养基中分离视网膜进行RGCs原代培养,采用免疫荧光技术检测培养细胞中RGCs标志物Brn3a的阳性表达并确定培养细胞中CB1R和CB2R的表达.将原代培养14 d的RGCs分为正常对照组和氧糖剥夺(OGD)组,分别用完整培养基+体积分数95％空气+体积分数5％ CO2和无糖培养基+体积分数95％ N2+4％ CO24+体积分数1％ O2条件下培养20 h.采用JC-1染色法检测细胞中线粒体结构变化和RGCs的形态变化.各组细胞分别给予1μmol/L CB1R拮抗剂SR141716A、1μmol/L CB2R拮抗剂SR144528以及5μmol/L、10 μmol/L CB1R和CB2R激活剂WIN 55212-2,采用MTT法比较各组RGCs存活率.结果 正常C57BL/6J小鼠视网膜全层均可见CBR的表达.正常对照组培养的RGCs大小均匀,多呈多角形,细胞间轴突细长并形成网络,细胞中Brn-3a表达阳性;OGD组培养的细胞皱缩或形成碎片,多数细胞轴突消失,Brn-3a表达荧光强度明显减弱.正常对照组RGCs中JC-1染色显示,线粒体的黄色荧光明显强于OGD组,表明OGD组线粒体膜电位明显下降.MTT法检测显示,正常对照组RGCs存活率为(100.00±13.87)％,明显高于OGD组的(89.52±18.16)％,差异均有统计学意义(q=8.065,P=0.008);SR141716A和SR144528作用后OGD组细胞存活率分别为(116.63 ±22.21)％和(112.61±19.02)％均明显高于同组的无药物处理细胞的存活率(89.52±18.16)％,差异均有统计学意义(q=29.780、17.391,均P＜0.01),而SR141716A和SR144528作用后正常对照组细胞存活率的变化差异均无统计学意义(均P＞0.05). 结论 细胞缺氧缺糖时上调CB在细胞中的表达和激活CB活性.在缺氧缺糖条件下,抑制细胞中CBR的激活过程对RGCs有保护作用.     

高糖对原代培养的视网膜神经节细胞中Toll样受体4表达的上调作用及其意义

背景 研究发现糖尿病性视网膜神经病变的发生早于糖尿病视网膜病变(DR),视网膜神经节细胞(RGCs)的损伤是DR的早期特征性改变.研究表明,Toll样受体4(TLR4)在糖尿病大鼠视网膜中呈高表达,但TLR4与糖尿病性RGCs损伤的关系尚不明确. 目的 研究高糖对原代培养的大鼠RGCs中TLR4表达的影响,为糖尿病性视网膜神经病变的预防和治疗以及靶向药物研究提供依据. 方法采用木瓜蛋白酶消化法从出生后1 ～3d的SPF级大鼠视网膜中分离RGCs并进行纯化培养,采用免疫荧光技术检测RGCs特异性标志物Brn3a的表达以鉴定培养的细胞.将培养的细胞分为正常对照组及10、20、30 mmol/L葡萄糖组,分别于不同浓度葡萄糖培养后24 h及48 h收集细胞,分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法测定RGCs中TLR4 mRNA及其蛋白的相对表达量.结果 细胞接种后贴壁生长并呈近圆形,纯化培养后24 h细胞体积逐渐增大且呈聚集样岛状生长,可见突触和轴突.培养的细胞中Brn3a为阳性表达.葡萄糖培养后24 h岛样细胞群周边细胞轮廓不清,反光弱,葡萄糖培养后48 h部分细胞内结构消失,仅残留细胞轮廓,可见大量细胞碎片.细胞培养后24 h,10、20和30 mmol/L葡萄糖组RGCs中TLR4 mRNA相对表达量分别为0.945±0.237、1.180±0.193和0.827±0.213,培养后48 h分别为1.509±0.422、2.433±0.617和1.435±0.410,均明显高于正常对照组的0.600±0.099和0.724±0.302,差异均有统计学意义(均P＜0.01).细胞培养后24 h,10、20和30 mmol/L葡萄糖组RGCs中TLR4蛋白相对表达量分别为0.442±0.147、0.626±0.128和0.330±0.153,培养后48 h分别为0.464±0.121、0.930±0.441和0.394±0.158,均明显高于正常对照组的0.090±0.050和0.094±0.070,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 高糖环境下大量体外培养的RGCs细胞内结构消失,同时细胞中TLR4表达量上调,提示RGCs中TLR4的过量表达可能与高糖诱导的RGCs损伤有关.     

SD大鼠视网膜神经节细胞体外分离培养及高糖模型建立

目的：体外分离新生SD大鼠视网膜神经节细胞(RGCs),建立新生SD大鼠RGCs体外原代培养方法及高糖模型。

方法：取15～20只出生1～3d SD大鼠的视网膜组织,分离纯化RGCs进行原代培养。甲苯胺蓝法及免疫荧光细胞染色法进行鉴定。细胞连续培养48～72h后,随机分为6组并分别加入含不同葡萄糖浓度5.5、20、25、30、35、40mmol/L的培养基培养24、48、72h,采用CCK8法及TUNEL凋亡检测法分析各组细胞存活率及凋亡率。

结果：离体纯化原代培养的RGCs具有典型的细胞形态且生长良好,细胞之间呈小片状融合聚集生长,轴突相互交错成网络状,胞体周围可见细胞光晕。甲苯胺蓝着染细胞胞质中可见结构清晰的尼式小体,神经元率达95%以上。RGCs特异性抗体Thy-1、Brn-3a定体外纯化培养细胞,阳性率达90%以上。CCK8检测发现随着时间及葡萄糖浓度的增加,各组细胞的存活率降低; 在不同葡萄糖浓度干预细胞24h时,各分组之间OD值均小于正常对照组,但与正常对照组相比较OD值大小无差异(均P>0.05); 随着时间延长,35、40mmol/L葡萄糖浓度干预RGCs 48h,30、35、40mmol/L干预RGCs 72h时的OD值较正常对照组OD值明显降低(均P<0.05)。TUNEL检测发现随着葡萄糖浓度及时间的增加,RGCs凋亡率增加。其中葡萄糖浓度为30、35、40mmol/L培养RGCs 48、72h后RGCs细胞凋亡率与正常对照组相比较有差异(均P<0.05)。

结论：本研究建立的RGCs体外原代培养方法能获得典型且纯度较高的RGCs,随着葡萄糖浓度的增加,体外纯化培养的RGCs存活率降低,凋亡率增加。35mmol/L葡萄糖浓度干预RGCs 48h可为有效诱导RGCs建立高糖模型最佳干预浓度及时间。     

巨噬细胞培养液对离体培养的大鼠视网膜神经节细胞的作用研究

目的研究巨噬细胞培养液对离体培养的视网膜神经节细胞(retinal ganglioncells,RGCs)存活和生长的作用,探讨损伤晶状体促进RGCs存活和轴突再生的作用物质,为视神经损伤和再生的基础研究提供理论依据。方法制备大鼠巨噬细胞培养液,分别用巨噬细胞培养液及DMEM对RGCs进行离体培养,观察RGCs在体外存活的时间,测量培养1d、3d和5d有突起的RGCs数目及最长突起长度,进行组间比较。结果(1)对照组离体培养的细胞于培养5～6d崩解死亡,而巨噬细胞培养液组细胞能存活6～8d;(2)培养1d、3d和5d,巨噬细胞培养液组有突起的RGCs数目分别为(59.74±2.04)个.mm-2、(96.78±4.11)个.mm-2和(99.26±3.04)个.mm-2,均明显多于同期对照组,差异非常显著(P<0.01);(3)培养1d和3d,巨噬细胞培养液组RGCs最长突起长度分别为(39.70±0.71)μm和(76.19±1.56)μm,较对照组延长,差异非常显著(P<0.01)。培养5d,RGCs最长突起长度与对照组比较差异显著(P<0.05)。结论巨噬细胞培养液可促进离体培养的RGCs存活和生长。     

缺氧和高糖对视网膜色素上皮细胞增生及VEGF、TGF-β1表达的影响

目的 探究缺氧、高糖环境对体外培养的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞生长、增生及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达变化的影响.方法 采用酶消化法进行C57小鼠RPE细胞的体外原代培养.通过组织形态学观察和免疫化学染色对培养的RPE细胞进行鉴定.实验缺氧组:在DMEM培养液中加入CoCl2,使其浓度分别为50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1;实验高糖组:在DMEM培养液中加入D-葡萄糖,使其浓度分别为15 mmol·L-1、30 mmol·L-1、45 mmol·L-1.分别向培养的RPE细胞中加入上述培养液,共6组,每组3份;正常对照组加入含5.5 mmol·L-1葡萄糖、不含CoCl2的培养液.观察各组细胞在不同培养条件下的活力、倍增时间及增生情况.采用ELISA法检测各组细胞在培养不同时间后(24 h、48 h、72 h)上清液中VEGF及TGF-β1表达量的变化.结果原代培养及传代早期的RPE细胞生长较为旺盛;在缺氧和高糖培养条件下所培养的细胞活力和分裂次数均较正常对照组有所降低或减少,而倍增时间较正常对照组延长.在缺氧和高糖培养条件下培养24 h、48 h、72 h后,细胞上清液中VEGF和TGF-β1表达量均较正常对照组高(P<0.05);当CoCl2浓度为100 μmol·L-1和D-葡萄糖浓度为30mmol·L-1时,VEGF和TGF-β1在24 h、48 h、72 h表达均高于其他浓度,缺氧状态下48 h表达量分别为(43.28±0.88)ng·L-1和(8.90±1.38)ng·L-1,高糖状态下分别为(39.76±0.56)ng·L-1和(8.81±0.92)ng·L-1;缺氧组2种细胞因子表达量在48 h达到高峰,而高糖组在72 h达到高峰.结论 应用酶联合消化法可获得纯度较高的体外C57小鼠培养RPE细胞;缺氧和高糖状态可对RPE细胞增生起到明显抑制作用,但能够明显上调RPE细胞的VEGF、TGF-β1表达量.     

压力升高诱导的视网膜神经节细胞-5的凋亡和自噬

背景 研究表明线粒体途径的凋亡和自噬均是影响青光眼视网膜神经节细胞(RGCs)存活的重要因素,但压力是否引发RGCs线粒体途径的凋亡和自噬尚未阐明. 目的 探讨压力对体外培养的RGCs线粒体途径凋亡和自噬的影响. 方法 将培养的RGC-5细胞分为正常对照组及0、20、40和60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)压力组,根据分组使用自制加压装置对离体培养的RGC-5细胞密闭加压处理4h,倒置相差显微镜下观察各组细胞的形态学变化,采用流式细胞仪检测细胞的凋亡和坏死率,采用JC-1荧光染料检测细胞线粒体膜电位的改变,采用Western blot法检测各组细胞中细胞色素C(Cyt-c)、微管相关蛋白轻链3(LC3)和Beclin-1的表达.结果 正常对照组和0 mmHg压力组培养的RGC-5细胞呈梭形,可见较多的树突,而20、40和60 mmHg压力组随着压力的增大,细胞密度变小,部分细胞树突缩短且变少,死亡细胞增多.正常对照组及0、20、40和60 mmHg压力组总凋亡和坏死细胞比例分别为(15.69±0.77)％、(15.77±1.14)％、(18.30±1.07)％、(23.28±1.33)％和(34.47±1.17)％,总体比较差异有统计学意义(F=150.90,P＜0.001),其中40 mmHg压力组和60 mmHg压力组总凋亡和坏死细胞率明显高于正常对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).正常对照组细胞线粒体膜电位呈橙色荧光,20 mmHg压力组和40 mmHg压力组细胞荧光强度减弱,橙色变淡,60 mmHg压力组细胞呈绿色荧光.与正常对照组比较,60 mmHg压力组细胞中Cyt-c蛋白相对表达量明显增加,40 mmHg压力组和60 mmHg压力组细胞中LC3-Ⅱ的相对表达量明显增加,20、40和60 mmHg压力组细胞中Beclin-1的相对表达量明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 压力升高可诱导体外培养的RGC-5细胞形态异常,导致细胞线粒体膜电位下降,并通过线粒体途径发生凋亡和自噬.     

低氧/高糖环境下间充质干细胞对RPE生物学特性的影响

目的：建立人骨髓间充质干细胞( hMSCs)与视网膜色素上皮细胞( RPE)低氧高糖培养的细胞共培养模型,研究在与hMSCs共培养条件下低氧及高糖时RPE细胞增殖、凋亡和移行等生物学特征的影响,对糖尿病刺激脉络膜新生血管( CNV)的机制进行初步探讨。
　　方法：使用Transwell间接共培养模型。将共培养模型按照培养氧浓度及糖浓度培养基类型分为4组：常氧常糖组(21% O2加5.56mmol/L葡萄糖培养液,A组)、常氧高糖组(21% O2加30mmol/L葡萄糖培养液,B组)、低氧常糖组(5% O2加5.56mmol/L葡萄糖培养液,C组)和低氧高糖组(5% O2加30mmol/L 葡萄糖培养液,D 组)。通过CCK-8检测间接共培养模型在12,24,48 h时RPE细胞的增殖能力、Transwell 检测间接共培养模型在24 h 时 RPE细胞的移行情况、流式细胞仪检测间接共培养模型中24 h时RPE细胞的凋亡情况。
　　结果：与对照组相比,12,24和48 h时, B组(1.61±0.41,1.80±0.34,1.91±0.35)、C 组(1.34±0.46,1.94±0.40,2.14±0.41)及D组(1.98±0.47,2.26±0.42,2.55±0.40)中的细胞增殖能力均较对照组(0.92±0.45,1.27±0.32,1.59±0.41)增强(P<0.05),并且低氧高糖联合作用组增殖能力最强。在24h时,B 组(149.5±9.19)、C 组(140±9.90)、D组(170.5±7.78)较对照组(114.5±7.78)的RPE
　　细胞移行能力增强(P<0.05)。而在24h时各组间的凋亡情况无明显差异(P>0.05)。
　　结论：与hMSCs共培养条件下,低氧及高糖环境促进RPE细胞的增殖和移行,而对其凋亡并无影响。     

miR-375对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞功能的抑制作用及其机制

背景 研究表明miR-375抑制肿瘤细胞的增生、凋亡、迁移和黏附,并对肿瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)含量的变化进行调控,进而影响血管的生成,但miR-375是否干预视网膜新生血管的形成鲜见报道. 目的 探讨miR-375对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞(HRCECs)功能的影响及其可能的作用机制.方法 用IMDM完全培养液培养HRCECs,并将细胞分为正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2 +miR-375拟似剂组、CoCl2+miR-375拟似剂对照组、CoCl2+miR-375抑制剂组和CoCl2+miR-375抑制剂对照组,待细胞生长至对数生长期后用200 μmol/L CoCl2处理HRCECs以制备缺氧细胞模型;制备终浓度为50 nmol/L的miRNA-脂质体复合物和小干扰RNA(siRNA)-脂质体复合物将miR-375和卷曲蛋白4(FZD4) siRNA转染各组细胞48 h.采用MTT法检测各组细胞的增生情况(A值)并计算增生倍数;采用Transwell小室法检测各组迁移的细胞数目;采用ELISA法检测细胞培养液中VEGF和血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)含量;采用实时荧光定量PCR法检测细胞中miR-375 mRNA和FZD4 mRNA的相对表达量变化;采用Western blot法分析细胞中Wnt通路相关蛋白的相对表达量变化;采用Matrigel小管形成实验检测细胞的体外形成血管的长度.将培养的细胞分为正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2+mock组和CoCl2+FZD4 siRNA组,采用荧光素酶报告基因法探测miR-375靶基因FZD4的表达. 结果 miR-375处理组miR-375 mRNA相对表达量明显高于正常对照组,miR-375拟似剂组细胞中miR-375 mRNA相对表达量明显高于miR-375拟似剂对照组,miR-375抑制剂组细胞中miR-375 mRNA相对表达量明显低于miR-375抑制剂对照组,差异均有统计学意义(t=-19.237、8.764,均P＜0.01),提示miR-375的转染效率较高.正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2+ miR-375拟似剂组、CoCl2+miR-375拟似剂对照组、CoCl2+miR-375抑制剂组、CoCl2+miR-375抑制剂对照组间细胞增生倍数、迁移细胞数、细胞培养液中VEGF和VE-Cadherin含量以及体外小管形成长度的总体比较差异均有统计学意义(F=24.324、26.776、14.113、19.225、15.040,均P＜0.001),CoCl2 +miR-375拟似剂组细胞增生倍数、迁移细胞数体外小管形成长度及细胞分泌VEGF和VE-cadherin量均较CoCl2+miR-375拟似剂对照组明显减少,而CoCl2+miR-375抑制剂组较CoCl2+miR-375抑制剂对照组明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.01).正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2+miR-375拟似剂组、CoCl2+miR-375拟似剂对照组、CoCl2 +miR-375抑制剂组、CoCl2+miR-375抑制剂对照组细胞中β-catenin、cyclinD1、MMP2和VEGF蛋白表达量的总体比较差异均有统计学意义(F=11.753、13.283、16.770、10.334,均P＜0.001),CoCl2+ miR-375拟似剂组细胞中β3-catenin、cyclinD1、MMP2、VEGF蛋白表达量较CoCl2+miR-375拟似剂对照组均明显下降,CoCl2+miR-375抑制剂组较CoCl2+miR-375抑制剂对照组明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.01).CoCl2处理组和CoCl2+mock组细胞增生倍数、迁移细胞数和小管形成长度均较正常对照组明显增加,CoCl2+FZD4 siRNA组细胞增生倍数、迁移细胞数和小管形成长度均明显低于CoCl2+mock组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 miR-375抑制缺氧条件下HRCECs的增生、迁移以及血管形成能力,其作用机制与miR-375直接靶向FZD4调控Wnt通路活性有关.     

微小RNA-133b对紫外线诱导的晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用及其调控机制

背景 研究证实紫外线B照射是白内障发生的主要原因之一,其机制与晶状体上皮细胞(LECs)凋亡有关.微小RNA-133b(miR-133b)参与氧化应激诱导的LECs凋亡的调控过程,但其是否参与紫外线诱导白内障的发病过程及其机制尚未阐明. 目的 观察miR-133b对紫外线诱导白内障LECs凋亡的抑制作用及其调控机制.方法 将20只8周龄SPF级C57 BL/6小鼠采用随机数字表法分为白内障模型组和正常对照组,其中白内障模型组小鼠用波长302 nm的紫外线直接照射眼部5 min,照射强度为300 W/cm2,每天照射1次,共照射1周;正常对照组小鼠不给于任何干预.于末次照射后24 h处死各组小鼠并摘出10只眼球以制备全眼球切片.取人LECs细胞系(SRA01/04)紫外线照射25 min,并继续培养4h作为紫外线照射组,正常对照组细胞不作任何干预.取紫外线照射模型组细胞接种于96孔板并分为miR-133b模拟物组、模拟物阴性对照组、miR-133b抑制物组和抑制物对照组,分别用lipofectamine2000联合50 nmol/L miR-133b模拟物、miR-133b模拟物对照剂、100 nmol/L miR-133b抑制物或miR-133b抑制物对照剂瞬时转染细胞.采用实时荧光定量PCR法检测小鼠晶状体组织和不同转染组入LECs中miR-133b mRNA及其预测靶基因BCL2L2mRNA的表达以评估转染效率;采用TUNEL凋亡检测试剂盒检测小鼠晶状体组织中LECs和不同转染组人LECs的凋亡情况.结果 正常对照组小鼠晶状体前囊膜LECs排列规则,未发现TUNEL染色阳性细胞,白内障模型组小鼠LECs排列稀疏,可见凋亡细胞呈红色荧光.紫外线照射组细胞凋亡率为(43.90±9.30)％,明显高于正常对照组的(1.08±0.49)％,差异有统计学意义(t=-7.963,P=0.015).白内障模型组小鼠晶状体组织和紫外线照射组细胞中miR-133b mRNA的相对表达量分别低于正常对照组小鼠和正常人LECs,差异均有统计学意义(t=-2.958,P=0.042;t=-6.195,P=0.003).白内障模型组小鼠晶状体组织和紫外线照射组细胞中BCL2L2 mRNA的相对表达量分别高于正常对照组小鼠和正常人LECs,差异均有统计学意义(t=3.761,P=0.020;t 12.437,P=0.000).miR-133b模拟物组人LECs中miR-133b mRNA的相对表达量明显高于miR-133b模拟物对照组,而BCL2L2 mRNA的相对表达量明显低于miR-133b模拟物对照组,差异均有统计学意义(t=10.883、-5 927.617,均P＜0.01);miR-133b抑制物组人LECs中miR-133b mRNA的相对表达量明显低于miR-133b抑制物对照组,而BCL2L2 mRNA的相对表达量明显高于miR-133b抑制物对照组,差异均有统计学意义(t=-1 606.622、17.556,均P＜0.01).miR-133b模拟物组LECs凋亡率明显低于miR-133b模拟物对照组[(17.55±4.24)％与(43.62±9.19)％],miR-133b抑制物组LECs凋亡率为(78.23±12.42)％,明显高于miR-133h抑制物对照组的(48.01±9.68)％,差异均有统计学意义(t=-4.462,P=0.011;t=3.324,P=0.029).结论 miR-133b可防止紫外线照射所致的白内障的形成,其机制可能与靶向负性调控BCL2L2基因从而调控LECs的凋亡过程有关.     

小干扰RNA-TLR9对高糖下大鼠视网膜神经节细胞凋亡的抑制作用及其机制

目的探讨Toll样受体9(TLR9)对高糖下大鼠视网膜神经节细胞(RGC)-5凋亡的影响及小干扰RNA-TLR9(si-TLR9)对凋亡的抑制作用。方法将体外培养的RGC-5细胞分为正常对照组、高糖组、高糖+阴性对照组和高糖+si-TLR9组,分别行正常培养、高糖培养、高糖下空质粒转染和高糖下siRNA-TLR9质粒转染细胞。采用实时PCR法检测各组细胞中TLR9 mRNA表达;采用MTT法检测各组细胞存活率;采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;采用caspase-3活性检测试剂盒检测各组细胞中含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)活性;采用Western blot法检测TLR9及B淋巴细胞瘤-2(bcl-2)、bcl-2相关X蛋白(bax)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和磷酸化(p)-p38MAPK蛋白的表达。结果与高糖+阴性对照组比较,高糖+si-TLR9组细胞中TLR9 mRNA和蛋白的相对表达量明显下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖组和高糖+阴性对照组细胞存活率分别为(78.36±5.13)%和(75.12±4.25)%,较正常对照组的(95.48±7.25)%明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);高糖+si-TLR9组细胞存活率为(86.58±5.32)%,明显高于高糖+阴性对照组的(75.12±4.25)%,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖组和高糖+阴性对照组细胞凋亡率分别为(13.23±1.22)%和(12.52±1.38)%,较正常对照组的(2.26±0.15)%明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);高糖+si-TLR9组细胞凋亡率为(7.15±0.24)%,明显低于高糖+阴性对照组的(12.52±1.38)%,差异有统计学意义(P<0.05)。与高糖+阴性对照组比较,高糖+si-TLR9组细胞中bax蛋白表达量明显下降,bcl-2蛋白相对表达量明显增加,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖+si-TLR9组细胞中caspase-3活性明显低于高糖+阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与高糖+阴性对照组比较,高糖+si-TLR9组细胞中p-p38MAPK蛋白相对表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论下调TLR9表达可抑制高糖诱导的RGC-5细胞凋亡,其作用机制可能与抑制p38MAPK信号通路活化有关。     

慢性高眼压大鼠模型视网膜中Brn-3a表达的动态变化

背景Brn-3a是最近发现的一种视网膜神经节细胞（RGCs）特异性标记物。高眼压的视功能损害主要与RGCs损伤有关,但高眼压大鼠视网膜损伤与Brn-3a表达的关系尚不清楚。目的观察慢性高眼压大鼠不同时期眼压、视网膜的形态学和Brn-3a表达的变化。方法将35只健康成年SD大鼠用随机数字表法随机分为正常对照组5只和模型组30只,术前测量眼压。模型组大鼠一侧眼用Shareef—Sharma手术方法建立慢性高眼压模型,对侧眼只切开结膜,不烙闭巩膜表层静脉作为伪手术眼。按照术后不同处理时间随机将模型组分为术后1、3、5、7、14、28d组共6个亚组,每组5只。分别于术前及术后30min,1、3、7、14、28d用Tono—Pen接触式眼压笔测量双眼眼压。各模型组于术后各相应时间点与正常对照组分别取5只大鼠过量麻醉处死,制作视网膜石蜡切片行常规组织病理学检查,评价视网膜形态变化,用甲苯胺蓝染色法计数RGCs,采用免疫组织化学法检测各时间点各组大鼠Brn-3a在RGCs中的表达。结果高眼压模型组大鼠术后各时间点眼压均明显高于术前,差异有统计学意义（F=95．631,P=0．001）,术后28d时眼压是正常对照组大鼠眼压的1．59倍。与伪手术眼相比,模型眼术后各时间点眼压均明显升高,差异均有统计学意义（q=18．418、15．261、10．987、6．931、4．975、2．962,P〈0．05）。正常对照组RGCs数量为（29．08±1．98）个／高倍视野,造模后3、5、7、14、28d组大鼠RGCs计数逐渐下降,差异均有统计学意义（t=5．943、8．034、15．023、17．004、19．371,P〈0．05）。免疫组织化学染色表明,随着造模时间的延长,各组Brn-3a阳性RGCs数量逐渐下降,差异有统计学意义（F=127．583,P=0．000）。结论采用Shareef—Sharma法可成功建立大鼠慢性高眼压动物模型,其眼压为中等程度升高;高眼压持续时间越长,RGCs的丢失越多。Brn-3a仅在RGCs层表达,随眼压持续时间的增加,Brn-3a的表达减少。     

microRNA-125b对人视网膜母细胞瘤多药耐药性影响的实验研究

目的 探讨microRNA-125b（miR-125b）在人视网膜母细胞瘤细胞中多药耐药的作用及其机制。设计 实验研究。 研究对象 人视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞。方法 用RT-PCR方法检测miR-125b视网膜母细胞瘤细胞株SO-RB50和耐药细胞株SO-Rb50/VCR中的表达变化;化学合成的miR-125b过表达（miR-125mimic 组）和抑制载体（miR-125inhibitor组）转染SO-Rb50细胞株,用MTT法和Annexin V-FITC法检测在药物长春新碱、依托泊苷和卡铂,依次作用上述转染细胞后,细胞增生力和细胞凋亡的变化;用蛋白印迹法检测miR-125b过表达和抑制表达后细胞株SO-RB50中 MAGE-A/P53蛋白的表达变化。主要指标 细胞存活率和细胞凋亡率。结果 SO-Rb50/VCR组与SO-RB50组相比,miR-125b的表达显著增高（P=0.002）;长春新碱、依托泊苷和卡铂依次作用于转染后的SO-RB50细胞株后,miR-125mimic组与miR-125inhibitor组相比,细胞存活率显著增高（P=0.000）,细胞凋亡率显著下降（P=0.000）,P53蛋白表达水平显著下降（P=0.001）,MAGE-A蛋白表达水平显著增高（P=0.004）。结论 在SO-RB50细胞中,下调miR-125b后提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性,且miR-125b可能是通过MAGE-A/P53通路调控视网膜母细胞瘤多药耐药性。     

经房角镜光凝小梁网法建立慢性高眼压大鼠模型及其与经角膜缘光凝法的比较

背景 慢性高眼压动物模型的建立是青光眼发病机制研究的基础,以往激光光凝建立慢性高眼压动物模型的方法存在模型眼压波动大,需要重复光凝和并发症多的问题,造模方法的改良对于顺利开展相关的实验研究具有重要意义. 目的 用经房角镜光凝小梁网法建立大鼠慢性高眼模型,并与以往的经角膜缘光凝法进行比较. 方法 选取8 ～12周龄清洁级Fischer344大鼠36只,将动物分为正常对照组、经角膜缘光凝组和经房角镜光凝组,每组12只,经角膜缘光凝组采用532 nm YAG激光经角膜缘光凝大鼠右眼小梁网建立慢性高眼压模型,激光能量为440 ～ 500 mW,激射光斑40 ～ 60个;经房角镜光凝组激光能量为800 ～850 mW,激射光斑100～120个.光凝后用Tonolab眼压计测量并观察各组大鼠眼压变化;于光凝后第3周每组处死5只大鼠,分离视网膜,采用免疫荧光技术检测并比较各组大鼠视网膜中Tuj-1阳性的视网膜神经节细胞(RGCs)数目.实验动物的使用及喂养遵循ARVO声明.结果 造模后3周各组大鼠一般情况可,眼表无明显损伤.经角膜缘光凝组和房角镜光凝组慢性高眼压模型的成模率分别为75％和100％.正常对照组、经角膜缘光凝组和经房角镜光凝组大鼠模型眼造模后3周的平均眼压分别为(11.0±1.3)、(23.4±12.6)和(25.3±4.9)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),峰眼压分别为(12.3±1.0)、(50.5±7.3)和(44.3±12.3)mmHg,组间总体比较差异均有统计学意义(F=25.496、80.762,均P＜0.001),其中经角膜缘光凝组和经房角镜光凝组大鼠模型眼平均眼压均明显高于正常对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.001),而2个组间平均眼压和峰眼压差异均无统计学意义(P=1.000、0.195).正常对照组、经角膜缘光凝组和经房角镜光凝组大鼠视网膜中Tuj-1阳性RGCs数目分别为(2 048.2±148.5)、(645.2±177.1)及(1 223.7±148.6)/mm2,总体比较差异有统计学意义(F=98.767,P＜0.001),其中经角膜缘光凝组和经房角镜光凝组大鼠视网膜中Tuj-1阳性RGCs数目均明显少于正常对照组,且经角膜缘光凝组大鼠视网膜中Tuj-1阳性RGCs数目明显少于经房角镜光凝组,差异均有统计学意义(均P＜0.01). 结论 经房角镜光凝小梁网能够诱导大鼠慢性高眼压并导致RGCs损害,但眼压升高模式及RGCs损害程度与经角膜缘光凝法有所不同,经房角镜光凝法建立慢性高眼压模型成模率更高.     

miR-26a对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及机制研究

目的 分析miR26a在葡萄膜黑色素瘤中的表达及对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响.方法 对葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5、M23及正常葡萄膜上皮细胞系ARPE-19行RT-PCR实验,检测3种细胞系中miR-26a的相对表达差异;将葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5分成miR-26a模拟物组和NC组,分别转染miR-26a mimics和对照序列scramble,用CCK-8实验和流式细胞术分别检测两组细胞增殖和凋亡;采用细胞划痕实验及Transwell实验分别检测两组细胞的迁移和侵袭能力;采用Western blot检测其下游蛋白组蛋白甲基化转移酶果蝇zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)的表达水平.结果 葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5中miR-26a相对表达量为0.250±0.029,细胞系M23中为0.350±0.017,正常葡萄膜上皮细胞系ARPE-19中miR-26a相对表达量为1.0,在细胞系SP6.5及M23中miR-26a的相对表达量均低于正常葡萄膜上皮细胞系ARPE-19中miR-26a的相对表达量(均为P＜0.001).miR-26a模拟物组在培养72 h、96 h、120 h OD450值(0.69 ±0.09、1.23 ±0.15、2.12±0.23)均显著低于NC组(1.39±0.11、2.35 ±0.25、3.53±0.27),差异均有统计学意义(均为P＜0.05).miR-26a模拟物组细胞凋亡率(15.60±2.30)％高于NC组(5.00±0.70)％(P＜0.01);miR-26a模拟物组划痕愈合率(23.7±2.1)％低于NC组(68.9 ±5.1)％(P＜0.01);侵袭细胞数(45.1±3.9)个低于NC组(115.3±8.9)个(P＜0.O1).miR-26a模拟物组EZH2蛋白相对表达量(0.39±0.09)低于NC组(1.0;P＜0.01).结论 miR-26a在葡萄膜黑色素瘤中低表达,过表达miR-26a显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖,促进凋亡,并抑制迁移和侵袭,其可能是通过下调EZH2的表达来发挥作用的.     

两种常用大鼠视神经钳夹伤模型造模效果的比较

背景 视神经钳夹伤(ONC)动物模型是外伤性视神经损伤致病机制及治疗方法相关基础研究的主要工具,目前常用的造模方法有经眼眶上缘开神经鞘膜视神经钳夹法和经球结膜外眦部夹伤视神经法,但关于2种模型优劣评价的研究很少. 目的 比较2种常用大鼠ONC模型的造模效果,为相关的实验研究中造模方法的选择提供依据.方法 采用随机分配方法将8～10周龄健康成年雄性SD大鼠24只分为经眶上缘开神经鞘膜ONC组和经眶上缘开神经鞘膜ONC 20 s、40 s、60 s组,分别采用经眶上缘开神经鞘膜视神经夹伤法(20 s)及经球结膜外眦部夹伤视神经法在大鼠的一侧眼建立ONC动物模型,各组大鼠的正常对侧眼作为对照.于造模后14 d记录各组大鼠闪光视觉诱发电位(F-VEP)P1波;制备大鼠视神经组织切片,采用苏木精-伊红染色法观察大鼠视神经的组织病理学改变;采用免疫荧光法观察并计数大鼠视网膜组织中Brn-3α阳性视网膜神经节细胞(RGCs).对2种造模方法的造模过程和检测结果进行比较.结果 造模后14d,经眶上缘开神经鞘ONC组和经球结膜ONC 20 s组、40 s组、60 s组大鼠的F-VEP P1波潜伏期较各自的正常对侧眼均明显延长,差异均有统计学意义(t=-11.64、-8.04、-6.50、-10.84,均P＜0.01);经眶上缘开神经鞘ONC组大鼠P1波潜伏期与经球结膜ONC 20 s、40 s、60 s组大鼠比较均明显延长,差异均有统计学意义(P=0.01、0.02、0.05);各组大鼠术眼P1波振幅与其正常对侧眼比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).造模后14 d,免疫荧光检测显示各组大鼠模型眼视网膜上Brn-3α表达阳性RGCs数均较正常对侧眼明显减少,经眶上缘开神经鞘ONC组大鼠视网膜上Brn-3α表达阳性RGCs数为(13.60±2.14)个/视野,为其正常对侧眼的47.49％,经球结膜ONC 20 s、40 s和60 s组中Brn-3α阳性RGCs数分别为(18.74±3.61)、(15.84±2.31)和(14.58±3.23)个/视野,分别为其正常对侧眼的67.70％、56.69％和50.17％,经眶上缘开神经鞘ONC组大鼠视网膜中Brn-3α阳性RGCs数与经球结膜ONC 40 s和60 s组比较,差异均无统计学意义(均P＞0.05).组织病理学检查显示,各组大鼠造模眼神经胶质细胞核排列紊乱,细胞基质空泡化,可见大量炎性细胞浸润,以眶上缘开神经鞘ONC组更为严重.结论 与经球结膜ONC模型鼠比较,经眶上缘开视神经鞘ONC模型大鼠视神经形态结构损害更为严重,视神经的传导功能更为迟缓,RGCs的存活率更低.     

晶状体损伤对视神经损伤后RGCs的保护作用及其机制

背景大鼠Miiller细胞提取液能够促进离体培养的视网膜神经节细胞（RGCs）存活及轴突的再生,伴晶状体损伤的视神经外伤眼RGCs存活率提高,但Milller细胞和晶状体损伤在促进RGCs存活方面的关系鲜见报道。目的探讨伴晶状体损伤的视神经外伤眼Mtiller细胞对RGCs存活的促进作用及其机制。方法清洁级成年Wistar大鼠48只按随机数字表法随机分为伪手术组、视神经损伤组、晶状体联合视神经损伤组。伪手术组大鼠手术中暴露但不损伤视神经,视神经损伤组大鼠行视神经横断伤,晶状体联合视神经损伤组行视神经横断伤联合晶状体针刺伤,并导致晶状体混浊。术后7d及14d各组分别取8只大鼠处死后制备视网膜标本。采用苏木精一伊红染色观察各组大鼠视网膜和RGCs的形态学改变,采用免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜内核层胶质纤维酸性蛋白（GFAP）标记的Muller细胞,光学显微镜下计数各组大鼠RGCs数量及GFAP阳性标记的Muller细胞数量。结果术后7d及14d,伪手术组大鼠RGCs的数量分别为（52．98±1．90）个／高倍视野和（51．81±3．09）个／高倍视野,差异无统计学意义（t=0．910,P=0．378）;术后14d视神经损伤组大鼠RGCs数量为（22．67±1．94）个／高倍视野,明显少于术后7d的（36．61±1．69）个／高倍视野,差异有统计学意义（t=15．312,P=0．000）;术后14d晶状体联合视神经损伤组RGCs数量为（35．69±1．80）个／高倍视野,明显少于术后7d的（50．76±2．77）个／高倍视野,差异有统计学意义（t=12．920,P=0．000）。术后7d及14d,晶状体联合视神经损伤组存活的RGCs数量均多于视神经损伤组,差异均有统计学意义（7d：t=102．840,P=0．000;14d：t=164．020,P=0．000）;术后14d晶状体联合视神经损伤组存活的RGCs：牧量少于伪手术组,差异有统计学意义（t=187．04,P=0．034）。术后7d及14d,伪手术组大鼠视网膜内核层均未见GFAP阳性标记的Muller细胞;视神经损伤组大鼠内核层GFAP阳性标记Muller细胞数量分别为（29．38＋2．04）个／高倍视野和（19．07±2．14）个／高倍视野,差异有统计学意义（t=-9．868,P=0．000）。晶状体联合视神经损伤组大鼠内核层GFAP阳性标记的Muller细胞数量分别为（48．96±2．80）个／高倍视野和（46．73±1．50）个／高倍视野,差异无统计学意义（t=1．987,P=0．067）。术后7d及14d,晶状体联合视神经损伤组大鼠内核层GFAP阳性Muller细胞数量均较视神经损伤组增多,差异均有统计学意义（7d：t=-15．997,P=0．000;14d：t=-29．938,P=0．000）。结论在视神经损伤合并晶状体刺伤时,晶状体损伤可诱导Muller细胞活化,进而促进视神经损伤后RGCs的存活。