Lumican及其在晶状体上皮细胞的上皮间质转分化中的作用

Lumican是在全身多种组织中广泛表达的一种蛋白质,在细胞增殖迁移分化及组织修复中起着重要作用。Lumican在晶状体上皮细胞（LECs）发生上皮间质转分化（EMT）中大量表达,并具有时间依赖性,有可能对该过程起着关键的调控作用。如果Lumican缺失,则LECs的上皮间质转分化受到明显抑制,从而对抑制后发性白内障的发生具有重要的意义。因此如何调控Lumican的表达已成为研究的热点,例如通过抑制转化生长因子p2的途径下调Lumican表达已被证实是调控的途径之一。但目前有关Lumican调控的研究大多集中于肿瘤和角膜,在LECs上皮间质转分化的调控作用靶点及如何量化还需要进一步研究。     

大鼠后囊膜混浊模型的建立

目的建立一种新的、具有实用价值的大鼠后囊膜混浊(posterior capsule opacification,PCO)动物模型。方法12只SD(Sprague Dawley)大鼠随机分为4组,每组3只,每只大鼠双眼施行晶状体囊外摘除术(extracapsular lens extrac-tion,ECLE);在手术后即刻、第1天、第7天、第14天摘除眼球,进行组织病理学观察,研究残留晶状体上皮细胞(lensep-ithelial cells,LECs)增殖、移行和后囊膜的动态变化;应用方差分析比较LECs增殖数量。结果所有大鼠均成功施行ECLE手术。手术后即刻可见前囊膜下及赤道部有单层的LECs排列;术后第1天赤道部形成由2～3层细胞组成的细胞团块,LECs沿着囊膜向后囊迁移;术后第7天囊袋赤道部及后囊膜下形成多层细胞结构,赤道部晶状体纤维样物质增加,部分后囊膜出现明显皱褶;术后第14天囊袋赤道部及后囊膜下LECs形成团块,赤道部形成晶状体纤维样结构,赤道部Soemmering环形成。随时间推移,单位面积LECs数量明显增加(P<0.05)。结论大鼠ECLE手术后可成功建立后囊膜混浊模型。     

Sprouty调控转化生长因子-β信号通路介导的上皮间充质转化抑制后囊膜混浊的研究进展

后囊膜混浊 (posterior capsular opacification，PCO) 是白内障手术的主要远期并发症，是由于手术切除纤维块后残留在囊袋中的晶状体上皮细胞（lens epithelial cell，LEC）的异常生长引起的。在成人术后2~5 a的发生率为20%~40%，儿童几乎为100%。大量研究表明LEC的上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)及增殖过程是PCO发展的主要病理改变，转化生长因子-β（transform growth factor-β,TGF-β）信号通路参与了LEC的EMT过程，其包括经典的Smad信号通路及非Smad信号通路。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路为主要的非Smad信号通路。Sprouty是RTK介导的Ras/ERK/MAPK 信号通路特异的抑制蛋白，并作为TGF-β诱导的EMT的负性调节因子抑制ERK信号通路，从而抑制EMT过程。本文将总结在PCO中LEC的EMT过程，以及Sprouty通过抑制TGF相关信号通路阻断PCO过程进行综述。     

转化生长因子-β2诱导的上皮间质转分化对人晶状体上皮细胞基因表型的影响

目的观察转化生长因子-β2（TGF-β2）诱导人晶状体上皮细胞（LECs）发生上皮问质转分化（EMT）时,其形态和基因表型所发生的变化。方法在体外培养的人LECs中,加入100pg／mL浓度的TGF-β2,诱导其发生EMT,处理0、6、24、48h后,观察其在形态上的变化,利用实时定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）于各时间点检测其标志性基因E-钙粘蛋白（CDHl）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（VIM）等在表达水平上所发生的变化,并与未处理的空白对照组进行比较。结果加人TGF-β2后,随着时间的推移,人LECs在形态上拉长,呈梭形;上皮细胞标志性基因如CDHl的表达水平逐渐下调,48h时相对表达量为1．10E-06,和对照组2．68E-06相比差异有统计学意义（P=0．002）;间质细胞标志性基因如VIM的表达水平逐渐上调,48h时相对表达量为1．64E-02,和对照组1．37E-02相比差异有统计学意义（P=0．006）;而α-SMA的表达水平也逐渐上升,48h时相对表达量为9．21E-03,虽和对照组8．67E-03相比差异无统计学意义（P=0．551）,但仍呈上升趋势。结论在TGF-132诱导下,人LECs发生EMT,其形态和基因表型均发生与间质细胞相符的变化。     

上皮间充质转化在后囊膜下混浊中的研究进展

白内障是我国首位致盲性眼病,也是世界上多数国家致盲的主要原因,目前手术是唯一有效的治疗方法。而后囊膜下混浊即后发性白内障(PCO)是白内障术后常见的并发症,也是导致术后视力下降的主要原因。研究表明,术后残留的晶状体上皮细胞(LECs)发生上皮间充质转化(EMT)在PCO的发生发展中起到了重要的作用。本文主要概述了近些年来EMT在PCO中的研究进展。     

MeCP2对LECs生物学行为和上皮-间质转化的调控作用及其机制

目的探讨甲基化CpG集合蛋白2(MeCP2)对晶状体上皮细胞(LECs)生物学行为和上皮-间质转化(EMT)发生的作用及其可能机制。方法根据细胞中转染物序列不同将人晶状体上皮细胞株SRA01/04分为MeCP2类似物组、MeCP2-空质粒组和小干扰RNA-MeCp2(si-MeCP2)组,分别将相应序列的质粒转染SRA01/04细胞。转染后24 h采用逆转录PCR法检测各组细胞中MeCP2 mRNA相对表达量;于转染后48 h采用划痕试验检测细胞迁移率;采用免疫荧光染色测定细胞内Wnt3a蛋白表达;采用Western blot法检测细胞内β-catenin、钙黏附蛋白-E(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-7和分泌型卷曲相关蛋白5(SFRP5)蛋白表达。结果转染后24 h,MeCP2-拟似物组、MeCP2-空质粒组和si-MeCP2组细胞中MeCP2 mRNA相对表达量总体比较,差异有统计学意义(F=4773.00,P<0.001)。划痕试验结果显示,MeCP2-拟似物组、MeCP2-空质粒组和si-MeCP2组细胞迁移率分别为(57.45±5.20)%、(32.71±10.02)%和(17.77±9.22)%,总体比较差异有统计学意义(F=124.00,P<0.001),其中si-MeCP2组细胞迁移率明显低于MeCP2-拟似物组和MeCP2-空质粒组,差异均有统计学意义(均P<0.001)。MeCP2-拟似物组、MeCP2-空质粒组和si-MeCP2组细胞中Wnt3a蛋白荧光强度(A值)分别为75.92±6.10、52.03±5.22和28.75±3.39,总体比较差异有统计学意义(F=221.30,P<0.001),其中MeCP2-mimics组显著高于MeCP2-CN组,si-MeCP2组细胞中Wnt3a蛋白荧光强度明显低于MeCP2-空质粒组和MeCP2-拟似物组,差异均有统计学意义(均P<0.001)。si-MeCP2组细胞内E-cadherin蛋白相对表达量明显高于MeCP2-拟似物组和MeCP2-空质粒组,细胞中β-catenin、Vimentin、MMP-9和MMP-7蛋白相对表达量明显低于MeCP2-拟似物组和MeCP2-空质粒组,差异有统计学意义(均P<0.01)。MeCP2-拟似物组、MeCP2-空质粒组和si-MeCP2组细胞内SFRP5蛋白相对表达量分别为27.19±0.03、47.54±0.05和74.93±0.05,总体比较差异有统计学意义(F=183.49,P<0.001),其中si-MeCP2组细胞内SFRP5蛋白相对表达量明显高于MeCP2-拟似物组和MeCP2-空质粒组,差异均有统计学意义(均P<0.001)。结论MeCP2能刺激人LECs发生EMT,其作用机制可能与其靶向抑制SFRP5表达,继而激活Wnt3a/β-catenin信号通路有关。     

多聚赖氨酸与EDTA的交联物防治兔眼后囊膜混浊的研究

目的 观察在白内障术中应用多聚赖氨酸与EDTA的交联物对晶状体后囊膜混浊(PCO)的影响.方法 利用EDC将EDTA与多聚赖氨酸结合,制成交联物PLE.日本大耳白兔9只(18眼),随机分为3组.实验组在白内障囊外摘出术中分别于囊袋内注入药物:EDTA组注入EDTA 20 mmol/L;PLE组注入PLE其中含EDTA 10 mmol/L、NH2-10 mmol/L;对照组囊袋内不注入药物.术后用裂隙灯观察眼内组织的变化.28 d后处死兔子,摘除眼球,制作病理切片,光镜下观察晶状体上皮细胞(LECs)增生情况.结果 PLE组仅有少量细胞残留,未见细胞增生,其他组均可见不同程度的细胞残留及增生.结论 与EDTA相比,PLE可更有效地清除LECs.     

Mfn2在TGF-β2诱导的晶状体上皮细胞上皮-间质转化中的作用

目的研究线粒体融合蛋白基因2(mitofusin 2,Mfn2)在转化生长因子β₂(transforming growth factorβ₂,TGF-β₂)诱导的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLECs)发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程中的表达及作用。方法实时荧光定量PCR检测不同浓度(10 ng·mL^-1、50 ng·mL^-1、100 ng·mL^-1)TGF-β₂处理HLECs 24 h后,各TGF-β₂处理组与对照组(0 ng·mL^-1 TGF-β₂) Mfn2 mRNA表达量差异。选取最佳作用浓度后,免疫荧光细胞化学检测TGF-β₂处理组与对照组的Mfn2蛋白表达变化,实时荧光定量PCR和免疫荧光细胞化学检测分别验证TGF-β     

MG132对体外培养人晶状体上皮细胞增殖的抑制作用

目的 研究蛋白酶体抑制荆MG132对晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞增殖的影响,探讨其抑制细胞增殖的有效药物浓度及分子机制.方法 不同浓度的MG132分别处理SRA01/04细胞36h,通过MTT法检测MG132对SRA01/04细胞增殖的影响,通过流式细胞术检测MG132对SRA01/04细胞凋亡的影响,通过Annexin V-FITC/PI双染法在荧光显微镜下观察SRA01/04细胞早期凋亡形态.结果 随着MG132浓度的升高,对SRA01/04细胞增殖的抑制作用逐渐增强,半数有效抑制浓度IC50为2.48μmol·L-1.MG132可诱导SRA01/04细胞凋亡;流式细胞术结果表明:浓度为2.5μmol·L-1、5.0μmol.L-1的MG132作用SRA01/04细胞36h后,细胞早期凋亡率分别为6.55%±0.35%和13.75%±3.18%,而0μmol·L-1为0.75%±0.21%,差异均有统计学意义(均为P<0.05).凋亡细胞被Annexin V-FITC单独染色(绿色荧光),活细胞不被染色,坏死细胞被Annexin V-FITC和PI(红色荧光)同时染色.结论 蛋白酶体抑制剂MG132可通过诱导细胞凋亡来抑制SRA01/04细胞的增殖,起到防治后发性白内障的作用.     

兔晶状体超声乳化后囊膜混浊模型的建立与观察

目的 建立一种微创、安全、有效、快速的兔晶状体超声乳化后囊膜混浊模型,为更高要求的实验作准备.方法 新西兰大白兔11只(22只眼),行双眼超声乳化术,分别于术后1 d、3 d、1周、2周和术后1、2、3个月对术眼进行裂隙灯显微镜及组织病理学检查,观察兔眼前、后节反应,后囊膜混浊形成时间、部位、发展过程及组织形态学改变.结果 后囊膜混浊由周边部向中央区发展,伴Elschnig小体和晶状体纤维生成,其程度随时间推移日渐加重;术后3个月均出现不同程度的后囊膜混浊.结论 成功建立兔晶状体超声乳化后囊膜混浊模型,可为更高要求研究后囊膜混浊的实验做准备.     

密闭囊袋冲洗系统模拟抑制人晶状体上皮细胞的研究

目的 利用密闭囊袋冲洗系统和人后发性白内障(PCO)囊袋模型,研究三氧化二砷(As2O3)在短时间内对PCO的防治作用.方法 实验研究.严格将时间控制在2 min时,在细胞培养条件下,四甲基偶氮唑盐比色法观察As2O3对人晶状体上皮细胞(LEC)系FHL124细胞的抑制作用;乳酸脱氢酶释放实验观察As2O3对FHL124细胞的损伤作用;荧光显微镜动态检测细胞内Ca2+浓度的变化.建立人PCO囊袋模型,应用密闭囊袋冲洗系统观察As2O3对原代人LEC的作用.浓度反应曲线用Hill公式求IC50值.所有实验数据结果用均数±标准差表示,采用SPSS 13.0软件处理,组间差异用单因素方差分析,组间两两比较用Dunnett检验.结果 As2O3在作用仅2 min的情况下,就可以抑制人LEC和清除残留于囊袋内的人原代LEC.As2O3(10、30、100、300、1000 μmol/L)对FHL124细胞的作用呈剂量依赖性,100 μmol/L以上浓度的As2O3对FHL124细胞具有明显的毒性作用.与对照组比较,差异有统计学意义(t=5.217,P＜0.01),半效抑制量(IC50)=130 μmol/L.乳酸脱氢酶检测显示,As2O3可影响细胞膜结构的完整性.细胞内动态Ca2+检测显示,As2O3对细胞内Ca2+作用呈剂量依赖性.高浓度As203可引起细胞内Ca2+库释放,同时抑制细胞的Ca2+内流,最终导致细胞内Ca2+稳态的破坏而引起细胞的死亡.1×104 μmol/L As2O3作用2 min后,使Ca2+内流的幅值及速度分别降低了(43.24±2.98)%(t=3.134,P＜0.01)和(46.27±6.01)%(t=3.521,P＜0.01).人PCO囊袋模型显示,联合应用As2O3和密闭囊袋冲洗系统可以在2 min内清除残留于囊袋内的原代人LEC.结论 As2O3可以在短时间内彻底清除白内障手术中存留于囊袋内的人LEC,与密闭囊袋冲洗系统结合可能抑制PCO的发生.     

后发性白内障的防治新进展

后囊膜混浊(posterior capsule opacification,PCO)又称后发性白内障是现代白内障囊外摘出或超声乳化吸除联合人工晶状体植入术后最常见的晚期并发症,如何防治后发性白内障一直是眼科学者关注的焦点,并不断在此领域取得新的进展。拟对近年来后发性白内障防治中手术方式的改进、人工晶状体自身特性的影响、囊袋张力环的应用、密封囊灌洗技术的开展和基因治疗等方面的研究进展和发展趋势加以综述。     

Wnt3a诱导人晶状体上皮细胞细胞外基质合成和胶原凝胶收缩的机制研究

背景 晶状体上皮细胞(LECs)的细胞外基质(ECM)的产生、异常沉积和收缩是PCO发生的重要病理机制.Wnt3a蛋白参与机体组织上皮细胞ECM的产生和纤维化过程,但Wnt3a对晶状体组织中上皮间质转化(EMT)相伴行的ECM的产生和收缩的影响尚不清楚. 目的 研究Wnt3a对体外培养的人LECsECM合成的影响,并探讨其介导胶原凝胶收缩的相关分子机制. 方法 用脂质体介导转染技术将Wnt3acDNA表达载体瞬时转染人LECs系SRA01/04细胞作为Wnt3a转染组,对照组转染pcDNA3-HA表达载体.细胞转染后48 h,采用Western blot法测定各组细胞中Wnt3a、ECM主要成分Ⅰ型胶原纤维(Col-Ⅰ),Ⅳ型胶原纤维(Col-Ⅳ)和整合素β1(integrin β1)的表达;采用免疫荧光法检测α-SMA、细胞纤维状肌动蛋白(F-actin)在胞中的表达和分布.将SRA01/04细胞与Ⅰ型胶原凝胶混合,观察胶原收缩情况.结果 Wnt3a转染48 h,SRA01/04细胞内Wnt3a蛋白相对表达量(相对灰度值)明显升高,对照组细胞和Wnt3a转染组细胞中Wnt3a蛋白表达量分别为0.290±0.066和0.703±0.105,差异有统计学意义(t=5.782,P＜0.01).Western blot法检测显示,Wnt3a转染组SR A01/04细胞中的Col-Ⅰ和integrin β1蛋白的相对表达量分别为0.697±0.021和0.875±0.055,明显高于对照组的0.370±0.020和0.580±0.030,差异均有统计学意义(t=19.600、8.156,均P＜0.01),Wnt3a转染组Col-Ⅳ蛋白相对表达量为0.430±0.020,高于对照组的0.383±0.031,但差异无统计学意义(t=2.514,P＞0.05).免疫荧光检测显示,对照组细胞中F-actin和α-SMA蛋白主要表达于细胞膜,而Wnt3a转染组细胞中F-actin和α-SMA蛋白表达于细胞膜、细胞质和细胞核周围,阳性染色程度较对照组明显增强.Col-Ⅰ凝胶收缩试验结果显示,细胞与Col-Ⅰ胶原凝胶混合后24 h凝胶收缩面积比率明显低于混合后8h(64.1％±2.3％与98.9％±1.0％),Wnt3a转染组凝胶收缩面积比率明显低于对照组(64.1％±2.3％与93.9％±3.1％),差异均有统计学意义(均P＜0.01). 结论 Wnt3a过表达可诱导SRA01/04细胞ECM合成和细胞骨架重建,促进细胞收缩.     

晶状体囊袋张力环在预防后囊膜混浊中的应用

后囊膜混浊是白内障摘出联合后房型人工晶状体植入术后导致视力下降的最常见并发症之一 ,而术中植入囊袋张力环可有效地降低后囊膜混浊的发生 ,我们就囊袋张力环在白内障术中的应用及发展情况加以综述     

三种不同材料人工晶状体的囊膜生物相容性比较

背景 研究表明,后囊膜混浊(PCO)的发生与人工晶状体(IOLs)的材料有关,然而不同材料的IOLs对PCO发生率的影响存在争议. 目的 研究不同材料IOLs表面人晶状体上皮细胞(LECs)的黏附、增生、上皮-间充质转化(EMT)和相关细胞因子分泌情况,探讨不同材料IOLs的囊膜生物相容性.方法 将人LECs系HLE-B3细胞分别接种于疏水性丙烯酸酯(Acrysof SA60AT) IOLs、硅凝胶(Crystalens) IOLs、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA) IOLs的表面培养6h和24 h,观察不同IOLs表面黏附的细胞数目及其形态;采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测IOLs表面细胞的增生反应;采用免疫荧光技术检测不同IOLs表面人LECs间质细胞标志物d-平滑肌肌动蛋白(o-SMA)的表达,计算IOLs表面人LECs的EMT转化率;采用ELISA法检测不同材料IOLs表面细胞培养液中转化生长因子-β2(TGF-β2)、白细胞介素-6(IL-6)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及MMP-9的质量浓度. 结果 细胞接种于不同材料IOLs并培养6h,Acrysof IOLs和Crystalens IOLs表面黏附的细胞以多边形和椭圆形为主,而PMMA IOLs表面黏附的细胞形态以纺锤形为主;培养后24 h,IOLs表面细胞全部伸展,Acrysof IOLs和Crystalens IOLs表面黏附的细胞为多边形,长梭形细胞增多,PMMA IOLs表面细胞呈典型的纤维纺锤样细胞,部分细胞聚集成团.培养后24 h Acrysof IOLs、Crystalens IOLs和PMMA IOLs表面的增生相对细胞数A值分别为0.238 4±0.007 1、0.178 1±0.0066和0.158 9±0.0069,总体比较差异均有统计学意义(F=475.947,P=0.000),其中Acrysof IOLs表面的细胞数明显多于Crystalens IOLs和PMMAIOLs,差异均有统计学意义(均P＜0.001).Acrysof IOLs、Crystalens IOLs和PMMA IOLs表面人LECs的EMT转化率分别为(9.99±3.80)％、(17.33±5.71)％和(84.16±10.48)％,组间总体比较差异有统计学意义(F=127.411,P=0.000),其中PMMA IOLs表面人LECs的转化率明显高于Crystalens IOLs和Acrysof IOLs,差异均有统计学意义(均P＜0.001).ELISA检测结果显示,Acrysof IOLs、Crystalens IOLs和PMMA IOLs细胞培养液中TGF-β2、IL-6、MMP-2和MMP-9质量浓度的比较差异均无统计学意义(F=0.846、0.947、0.255、0.922,均P＞0.05). 结论 在临床上常用的3种材料的IOLs中,疏水性丙烯酸酯的囊膜生物相容性最佳.     

RNA干扰技术干扰信号通路在后发性白内障防治中的应用

后发性白内障即后囊膜混浊(PCO),是白内障超声乳化摘出联合人工晶状体植入术后常见的并发症.白内障术后残留的晶状体上皮细胞(LECs)向后囊膜表面移行、增生及上皮-间质转化(EMT)等细胞生物学行为的改变可引起LECs纤维化、PCO及囊袋皱缩.转化生长因子β2(TGF-β2)是目前已知的参与诱导LECs的EMT及组织病理性纤维化关键的细胞因子,它可通过Smad经典通路参与诱导LECs的EMT过程.除此之外,PI3 K/AKT/mTOR信号通路也参与了TGF-β2诱导的EMT过程.RNA干扰(RNAi)技术作为基因调控手段之一,在通过干扰信号通路而抑制LECs的纤维化及增生、迁移等生物学行为中有一定的应用前景.本文就RNAi技术通过干扰PI3 K/AKT/mTOR信号通路和TGF-β2/Smad信号通路对LECs的生物学行为的影响,及其在PCO防治中的作用进行综述.     

糖尿病兔晶状体后囊膜混浊模型的建立

背景实验性糖尿病动物模型的制作是对糖尿病性眼病进行实验研究的关键环节,目前国内普遍应用的方法是链脲佐菌素和四氧嘧啶（ALX）注射,但前者价格昂贵,后者造模过程中动物的死亡率较高。目的探讨ALX注射制作糖尿病兔晶状体后囊膜混浊（PCO）模型并降低死亡率的方法,并观察高血糖对晶状体PCO形成的早期影响。方法将清洁级健康新西兰雄性大白兔40只随机分为2组;其中20只兔经耳缘静脉一次性注射ALX90mg／kg建立糖尿病模型作为高血糖组,另20只兔以同样的方法注射等量生理盐水作为正常血糖组。药物注射后2周时高血糖组兔血糖升高到12．0mmol／L以上可判断为建模成功,2组分别行兔右眼透明晶状体囊外摘出术并对晶状体PCO进行分级。于术后第6、10、14天取眼球,应用免疫组织化学法观察增生细胞核抗原（PCNA）在后囊膜晶状体上皮细胞（LECs）中的表达情况。结果ALX注射后糖尿病兔的成模率为70％。术后第6、10、14天时,高血糖组兔体质量均明显低于正常血糖组,但血糖明显高于正常血糖组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。高血糖组术后14d时观察的3只兔中,2只兔出现后囊膜2级混浊,另1只兔出现1级混浊。正常血糖组术后14d时观察的3只兔后囊膜均出现1级混浊。免疫组织化学染色显示,术后第10天高血糖组可见PCNA在LECs的细胞核中表达,但正常血糖组未见PCNA的表达。术后第14天时高血糖组PCNA增生指数为0．86±0．04,明显高于正常血糖组的0．25±0．03,差异有统计学意义（t=-16．171,P=0．000）。结论90mg／kg的ALX静脉注射能形成稳定的糖尿病兔PCO模型;高血糖是促进PCO发生发展的重要因素之一。