转化生长因子-β受体抑制剂复合物C促进人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞定向诱导

目的 观察转化生长因子-β（TGF-β）受体抑制剂复合物 C对人胚胎干细胞（hESC）向视网膜色素上皮（RPE）细胞定向诱导效率的影响。方法 将H1 hESC分为对照组和实验组。对照组在细胞过度融合后,以去除碱性成纤维细胞生长因子的血清替代物培养体系诱导RPE细胞定向分化。实验组于诱导分化前6 d在培养体系中加入1 μmol/L 复合物 C。诱导分化第1、3、5周,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测两组人类配对盒基因（PAX6）、小眼球相关转录因子（MITF）、细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP）、RPE65 mRNA的表达。将hESC来源的RPE（hESC-RPE）细胞分离纯化,采用RT-PCR、蛋白免疫印迹法（Western blot）和细胞免疫荧光法对纯化的hESC-RPE细胞进行鉴定。结果 诱导分化第4周,实验组肉眼可见色素团块,对照组无色素团块出现。将实验组的色素细胞分离纯化后,可见100%的细胞表现为多角形色素化。RT-PCR检测结果显示,实验组PAX6 mRNA表达在诱导分化第1、3周显著高于对照组,差异有统计学意义（t=28.498、3.141,P＜0.05）;诱导分化第3、5周,实验组MITF（t=8.866、10.111）、CRALBP（t=5.293、5.394）和RPE65（t=9.263、9.504）的表达均明显高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。hESC-RPE细胞PAX6、MITF、CRALBP、RPE65 mRNA表达均显著高于hESC（t=9.154、17.284、18.204、44.194）和ARPE-19（t=7.605、16.770、18.190、44.190）细胞,差异有统计学意义（P＜0.05）。Western blot检测结果显示,hESC-RPE细胞高水平表达RPE标志蛋白PAX6、RPE65。荧光显微镜观察发现,hESC-RPE细胞表达RPE细胞特异性标志蛋白PAX6、紧密连接蛋白-1。结论 TGF-β受体抑制剂复合物C能显著提高hESC向RPE定向诱导效率。     

苯丙氨酸促进人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞高效分化的研究

目的 观察苯丙氨酸对胚胎干细胞(ESC)向视网膜色素上皮(RPE)细胞定向分化诱导效率的影响.方法 H1人ESC(hESC)分为对照组和实验组,以mTeSR培养基常规培养.细胞克隆过度融合后对照组以撤除碱性成纤维细胞生长因子、含10％ knockout血清替代物的培养基诱导hESC自主分化至第7周.实验组从第3周开始在诱导培养基中添加0.2 mmol/L苯丙氨酸培养至第7周.观察两组细胞形态学变化;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测人类配对盒基因6(Pax6)、小眼球相关转录因子(MITF)、RPE65、酪氨酸酶(tyrosinase)、Wnt配体(Wnt3a)、淋巴样增强因子-1(Lef1)、转录因子7(Tcf7)基因mRNA的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测MITF、RPE65蛋白的表达;流式细胞技术(FCM)检测RPE65阳性细胞比例.Sprague Dawley大鼠12只,随机分为对照组和治疗组;单眼内路法视网膜下腔注射,对照组注射2 μl 1倍磷酸盐缓冲液,治疗组注射2 μl纯化的hESC-RPE.治疗后6周行视网膜电图(ERG)检查,观察暗适应3.0 a-b波振幅.结果 诱导分化第7周,实验组出现大量肉眼可见的色素团块,明显多于对照组.色素化区域内可见多边形蜂窝状排列的单层细胞,胞质充满色素颗粒.RT-PCR检测结果显示,实验组Pax6、MITF、RPE65、tyrosinase(t=39.44、26.14、31.28、77.24)、Wnt3a、Lef1、Tcf7(t=46.11、27.69、17.42)mRNA表达量高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).Western blot检测结果显示,实验组MITF、RPE65蛋白表达量高于对照组.FCM检测结果显示,实验组、对照组RPE65阳性比例分为(18.91±1.76)％、(0.88±0.09)％;实验组RPE65阳性比较明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).ERG检查结果显示,治疗组大鼠暗适应3.0 a-b波振幅较对照组显著提高,差异有统计学意义(t=7.543,P＜0.01).结论 苯丙氨酸显著提高hESC向RPE定向诱导效率.hESC诱导来源的RPE细胞视网膜下移植能改善视网膜变性模型动物视功能.     

氩激光对培养的牛视网膜色素上皮细胞损伤的扫描电镜观察

目的采用扫描电镜观察氩激光对体外培养的牛视网膜色素上皮(RPE)细胞表面的损伤情况。方法培养牛视网膜色素上皮细胞,将第4代细胞传代成融合状态后,用氩激光对RPE细胞进行照射,激光能量为0.8W,曝光时间为0.2s,光斑直径为200μm,激光照射后用扫描电镜观察色素上皮细胞表面超微结构变化。结果激光照射后,可见光斑中央区的细胞脱失,光斑周边损伤细胞主要表现为表面微绒毛的减少或消失,微绒毛卷曲,有些细胞边缘卷曲及细胞膜破裂出现不规则小孔。结论激光对体外培养的RPE细胞照射可造成色素上皮细胞脱失,细胞膜损伤及微绒毛损伤。     

两步酶分层消化法用于大鼠视网膜色素上皮细胞的培养

目的 探索体外分离、培养大鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞的方法，建立其体外培养模式。方法 采用两步酶分层消化法分离获取大鼠RPE细胞，F12培养液培养；生长曲线、细胞分裂时间等指标观察细胞生存活力及增生状态；光镜、免疫组织化学法形态学鉴别及细胞鉴定，电镜观察超微结构。结果 收获的大鼠RPE细胞纯度高，量多，体外生长旺盛，达到融合的时间较短。原代细胞呈多角形，含大量色素；传代细胞呈梭形。电镜显示胞浆内含黑色素颗粒及各种细胞器。结论 两步酶分层消化法是分离培养大鼠RPE细胞的理想方法，培养的细胞可用于RPE的体外实验研究。     

苏拉明对体外培养的视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的探讨苏拉明(suram in)对体外培养的猪视网膜色素上皮(retinal p igm ent ep ithelium,RPE)细胞增殖的影响。方法不同浓度苏拉明(0.05、0.1、0.2、0.4g/L)作用于RPE细胞,采用生长曲线法及MTT比色法检测苏拉明对RPE细胞增殖的影响,台盼蓝染色检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期变化;透射电镜观察各浓度苏拉明作用后细胞超微结构变化。结果苏拉明对RPE细胞增殖有抑制作用(P<0.05),且呈时间剂量效应;流式细胞术检测示苏拉明将细胞阻滞于G2/M期(P<0.01);透射电镜结果示苏拉明浓度为0.05~0.2 g/L时,RPE细胞结构无明显变化,而苏拉明0.4g/L时,细胞表面微绒毛减少,染色质边集。结论苏拉明能够抑制体外培养的猪RPE细胞增殖,但随浓度增加,对细胞有潜在毒性作用。     

缺氧条件下共培养时观察Müller细胞对RPE细胞生长的影响

背景 视网膜色素上皮(RPE) 细胞和Müller细胞在维持视网膜的正常代谢中起重要作用,多种生理、病理过程与二者的相互作用有关.目的 利用Transwell小室体外共培养兔Müller细胞与RPE细胞,观察缺氧条件下Müller细胞对RPE细胞增生和迁移的影响.方法 应用组织块培养法和酶消化法分别培养原代兔Müller细胞和RPE细胞,免疫组织化学法鉴定2种细胞.取第3代培养良好的细胞进行试验.应用CoCl2培养细胞以建立细胞化学缺氧模型,分为常氧组和缺氧组,每组又分为对照组(RPE细胞单独培养)、共培养组(Müller细胞与RPE细胞共同培养).利用Transwell小室建立Müller细胞和RPE细胞的共培养模型,各组分别培养3、6、24、48h,利用MTT法和结晶紫染色法对培养存活的RPE细胞进行计数,检测常氧及缺氧条件下Müller细胞对RPE细胞增生和迁移的影响.结果 原代培养的RPE细胞符合RPE细胞的特征,90%以上呈现CK-18阳性反应.培养的Müller细胞对胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S-100染色呈阳性反应.与常氧培养条件比较,缺氧条件下单独培养的RPE细胞增生数量增加,细胞迁移数量增加,差异有统计学意义(P＜0.01);缺氧条件下与Müller细胞共培养的RPE细胞增生数量和迁移数量明显增加,与常氧组和单细胞培养情况下比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).缺氧条件下,与RPE细胞单细胞培养组比较,共培养组RPE细胞的增生和迁移增加,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 缺氧可以促进RPE细胞的增生和迁移,Müller细胞可以加重缺氧引起的RPE细胞的增生和迁移.

Abstract：

Background More and more evidences suggest that the interaction of retinal progression of retinal diseases.Objective Present study was to investigate the primarily cultured and digested using explant culture method and trypsas acidic protein(GFAP) staining,S-100 staining and cytokine-18 staining co-cultured under the normoxia and hypoxia using transwell chamber,and the proliferation and migration of cultured RPE cells were examined using MTT and compared with only RPE cells cultured group at 3, 6, 24 and 48 hours.Results Over 90% of primarily cultured RPE cells showed the positive response for S-100.The proliferation and migration of RPE cells were significantly increased in hypoxia condition compared with normoxia condition (P＜0.01).In hypoxia group,amount of proliferation and migration of RPE cells in co-culture group were higher than the only RPE cells cultured group(P＜0.01).Conclusion Hypoxia appear to aggravate the proliferation and migration of RPE cells under the hypoxia status.     

THP-1细胞对体外培养的人视网膜色素上皮细胞c—fos表达的上调作用

目的 检测与单核/巨噬细胞株THP-1细胞共培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞c-fos的表达.方法 在Transwell小室中共培养THP-1细胞和人RPE细胞迭不同的时间(0,2 h,3 h.24 h,48 h,72 h),采用免疫荧光染色法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察RPE细胞c-fos蛋白和mRNA的表达变化.结果 在未与THP-1细胞共培养的RPE细胞中,c-fos表达微弱或不表达,细胞浆和部分细胞核为浅黄绿色荧光.与THP-1细胞共培养达2 h时,RPE细胞的荧光强度逐渐增强并出现核移位.随着与THP-1细胞共培养时间的延长,RPE细胞c-fos mRNA的表达(0 h,0.40±0.07)开始逐渐增强,于2 h时达峰值(2 h,0.91±0.10,P=0.002),随后表达减弱,至3 h时(3 h,0.51±0.08)降至近未共培养时的水平.结论 与THP-1细胞共培养可在短期内迅速上调体外培养的人RPE细胞c-fos蛋白和mRNA的表达,且蛋白表达出现核移位现象,提示THP-1细胞可引起RPE细胞c-fos的活化.     

高血压大鼠视网膜色素上皮细胞超微结构及其屏障功能观察

目的 观察高血压大鼠视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞超微结构的改变及其屏障功能受损情况，探讨其与神经视网膜病变的关系。方法 用胶体镧示踪结合透射电镜观察5、6、7个月龄自发性高血压大鼠RPE细胞超微结构改变及脉络膜视网膜屏障渗透性的改变，并与同月龄正常京都种大鼠作对照。结果 ①高血压大鼠RPE细胞中线粒体肿胀，内质网扩张，基底部皱褶减少，微绒毛变稀疏。这些退行性改变随鼠龄增大与血压的增高而加重。②6、7个月龄大鼠脉络膜视网膜屏障破坏，脉络膜毛细血管中的胶体镧进入到RPE细胞内褶及细胞间隙，且能通过紧密连接到达细胞顶部进入视网膜下间隙，而5个月龄高血压大鼠及各种正常大鼠、胶体镧不能通过此屏障，仅到达RPE细胞之间。结论 高血压大鼠视网膜病变的早期RPE细胞已有缺血、缺氧所致的退行性改变，且伴有脉络膜视网膜屏障的渗透性增加。     

体外培养的成年兔眼色素上皮细胞屏障功能的研究

目的 研究体外培养的成年兔眼视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞的血-视网膜外屏障功能.方法 对成年兔眼RPE 细胞进行原代培养,免疫组织化学通过MNF116和S-100鉴定细胞纯度.将细胞接种于铺有层粘连蛋白的Transwell滤膜上,分别于培养过程中不同时间点进行跨膜电阻测定,待电阻达到平台期后对膜切面行透射电子显微镜观察;并通过细胞ZO-1免疫荧光化学法了解紧密连接的形成情况.结果 成功原代培养了兔眼RPE 细胞并且无其他细胞污染.接种于Transwell后,RPE 细胞TER值3周达到最高值约88.14 Ω·cm2,维持1周并开始下降.透射电镜可见细胞表面有大量微绒毛并形成紧密连接.ZO-1免疫荧光化学结果可见细胞形态基本呈多边形,紧密连接基本形成.结论 成年兔眼RPE细胞通过培养于铺有层粘连蛋白的Transwell滤膜上可以成功建立细胞屏障功能模型.     

缺氧条件下共培养时观察Mtiller细胞对RPE细胞生长的影响

背景视网膜色素上皮（RPE）细胞和Mtiller细胞在维持视网膜的正常代谢中起重要作用,多种生理、病理过程与二者的相互作用有关。目的利用Transwell小室体外共培养兔Mtiller细胞与RPE细胞,观察缺氧条件下Moller细胞对RPE细胞增生和迁移的影响。方法应用组织块培养法和酶消化法分别培养原代兔Mtiller细胞和RPE细胞,免疫组织化学法鉴定2种细胞。取第3代培养良好的细胞进行试验。应用CoCl2培养细胞以建立细胞化学缺氧模型,分为常氧组和缺氧组,每组又分为对照组（RPE细胞单独培养）、共培养组（MOiler细胞与RPE细胞共同培养）。利用Transwell小室建立Mtiller细胞和RPE细胞的共培养模型,各组分别培养3、6、24、48h,利用MTT法和结晶紫染色法对培养存活的RPE细胞进行计数,检测常氧及缺氧条件下Miiller细胞对RPE细胞增生和迁移的影响。结果原代培养的RPE细胞符合RPE细胞的特征,90％以上呈现CK．18阳性反应。培养的Miiller细胞对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S-100染色呈阳性反应。与常氧培养条件比较,缺氧条件下单独培养的RPE细胞增生数量增加,细胞迁移数量增加,差异有统计学意义（P〈0．01）;缺氧条件下与MUller细胞共培养的RPE细胞增生数量和迁移数量明显增加,与常氧组和单细胞培养情况下比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。缺氧条件下,与RPE细胞单细胞培养组比较,共培养组RPE细胞的增生和迁移增加,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论缺氧可以促进RPE细胞的增生和迁移,Mtiller细胞可以加重缺氧引起的RPE细胞的增生和迁移。     

解读视网膜外层及色素上皮层的3D—OCT图像和临床意义

目的解读三维相干光学断层扫描（3D—OCT）图像上视网膜外界膜（OLM）、视细胞的内外节连接带（IS／OS）和视网膜色素上皮（RPE）层的三条高反射带的组成及其临床意义。方法应用视网膜胚胎学、组织学的知识,结合3个病例的3D—OCT图像特征．解读视网膜外层及RPE层的反射带组构。结果视网膜RPE层内侧极高反射带是由RPE细胞顶端的绒毛突、黑色素颗粒和可能还有闭锁小带,以及嵌入RPE细胞顶端绒毛突中视细胞外节末端的盘膜共同形成;外侧的极高反射带是由RPE基底细胞膜的大量内伸的皱褶和玻璃膜共同形成;而RPE层中间的细窄的较高反射带可能主要是由RPE细胞核组成。结论视网膜的显微结构知识及临床病例的图像研读对认知三维相干光学断层扫描图像的视网膜外层反射带的组成,具有重要的意义。     

视网膜色素上皮移植细胞超微结构的观察

目的 观察视网膜色素上皮移植细胞的超微结构,为临床应用提供实验基础。方法 取有色兔眼球后段,去除视网膜的神经上皮层,获得视网膜色素上皮细胞作为移植的供体细胞。以１０只无色兔为移植的受体,内路法将供体色素上皮细胞移植到视网膜下腔,电镜观察移植细胞的超微结构。结果 移植的１０只眼,细胞成功移植到视网膜下腔,可见移植细胞粘附于受体的Ｂｒｕｃｈ膜并形成基底内褶,细胞间紧密连接,细胞内可见吞噬体。结论 内路     

兔视网膜色素上皮细胞移植及长期形态学的研究

视网膜色素上皮（ＲＰＥ）功能失调或发生病理改变，可导致许多视网膜疾病，包括年龄相关性黄斑变性，青年性遗传性黄斑变性及视网膜色素变性等，严重危害人类视力。能否通过移植正常、健康的ＲＰＥ细胞治疗这类视网膜疾病，是当前眼科界关注的重要研究课题。我们采用了改良式玻璃体密闭式移植术，术中增加了玻璃体切割，应用带有色素标记的兔ＲＰＥ细胞移植于无色素性兔的视网膜下间隙。结果显示，移植长达１年后的ＲＰＥ细胞不但存活，结构形态正常，并且与邻近的ＲＰＥ细胞（包括移植的与自体的）建立了闭锁小带。移植的ＲＰＥ细胞与受体的感光细胞紧密结合，受体眼的神经外节盘正常脱落，被移植的ＲＰＥ细胞吞噬，且未发生排异反应。上述结果显示，本实验兔ＲＰＥ细胞移植的成功，为临床治疗某些视网膜疾病开辟了新的治疗途径，提供了可靠的实验室根据和应用前景。     

年龄相关性黄斑病变易感因子2蛋白在正常人眼组织中的表达和定位

背景研究表明,年龄相关性黄斑病变易感因子2（ARMS2）基因A69S位点的变异与年龄相关性黄斑变性（AMD）的发病及病变的进展高度相关,但ARMS2蛋白在正常成人眼组织中的定位仍存在争议,相关功能尚未完全明确。目的研究ARMS2蛋白在正常成人视网膜和脉络膜各层的表达定位及其在视网膜色素上皮（RPE）细胞的分布,为进一步从蛋白水平研究ARMS2基因的功能提供实验基础。方法收集死亡后立即摘除的正常供体眼球10只,来自年龄为28～42岁的男性,将其中3只眼球的视网膜和脉络膜组织制作冰冻切片,采用组织免疫荧光法在激光共焦显微镜下检测ARMS2蛋白在视网膜和脉络膜各层的分布。另7只眼球用于分离视网膜组织,并用组织块培养法进行RPE细胞的原代培养,培养的细胞用CK32抗体进行免疫荧光染色鉴定。应用荧光显微镜检测ARMS2蛋白在RPE细胞内的表达及定位情况。结果激光共焦显微镜下可见ARMS2蛋白在正常人视网膜血管、RPE层、Bruch膜、脉络膜血管内呈强阳性表达,而在视网膜神经节细胞层、内核层、外丛状层、外核层、内丛状层ARMS2蛋白表达较弱。组织块法培养的RPE细胞呈多角形,细胞质中可见大量的棕褐色色素颗粒,CK32染色表明原代培养RPE细胞的细胞质中可见大量的绿色荧光颗粒。在RPE细胞内ARMS2阳性蛋白呈簇状红色荧光,主要分布于细胞质中,细胞核为蓝色荧光。结论成年人正常眼视网膜血管中、RPE层、Bruch膜、脉络膜血管内均有ARMS2蛋白的强表达,此外,RPE细胞的细胞质中也可见呈簇状分布的ARMS2蛋白。     

苏拉明联合地塞米松对体外培养的视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的:探讨苏拉明(suramin,Sur)联合地塞米松(dexamethasone,Dex)对体外培养的猪视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞增殖的影响。方法:选择0.05,0.1,0.2,0.4g/L Sur单独作用及联合0.2g/LDex作用于RPE细胞4d,MTT比色法检测对RPE细胞增殖的影响;0.2g/L Sur和0.2g/L Dex分别作用于RPE细胞,流式细胞术检测细胞周期变化;Sur浓度为0.2g/L,0.4g/L及0.2g/L Sur联合0.2g/L Dex时,透射电镜观察细胞超微结构情况。结果:MTT比色法检测表明各浓度Sur对RPE细胞有抑制作用(P<0.05),呈剂量效应关系;0.2g/L Dex与各浓度Sur联合应用对RPE细胞的抑制率由单独应用Sur的16.0%,27.3%,40.5%,64.1%增至42.3%,52.1%,65.6%,78.8%。流式细胞检测提示Sur将细胞阻滞于G2/M期(P<0.01);Dex将细胞阻滞于S期(P<0.01)。透射电镜结果显示,Sur浓度为0.2g/L时,单独应用及联合0.2g/L Dex应用,RPE细胞结构无明显变化,而Sur0.4g/L时,细胞表面微绒毛减少,细胞核皱缩。结论:Sur联合Dex能有效抑制体外培养的RPE细胞增殖。     

Vitreoretinal surgical technique for transplanting retinal pigment epithelium in rabbit retina.

Transplantation of retinal pigment epithelial (RPE) cells has been proposed as a potential remedial procedure for previously untreatable retinal diseases. In this study, a vitreoretinal surgical technique was used to transplant pigmented RPE cells obtained from pigmented rabbits into the subretinal space of New Zealand White rabbits. At the time the animals were sacrificed, the retina was re-attached in all but 4 of the 24 experimental eyes. Histologically, by one week the transplanted RPE cells had formed a monolayer in patchy areas beneath the attached retina. By electron microscopy, RPE cells with prominent melanin granules were found attached to Bruch's membrane. Three weeks after transplantation, grafted RPE cells had formed apical microvilli and tight junctions with adjacent cells. The nucleus of the cells containing pigment had become oval, and their contact with Bruch's membrane appeared to be composed of bsal infoldings that were well formed. Our findings demonstrated the functional appearance of the transplanted RPE cells.     

Retinal pigment epithelial cells from Royal College of Surgeons dystrophic rats can take up melanin granules

· Background: Many successful pigment epithelium transplantation studies involving pink-eyed Royal College of Surgeons (RCS) dystrophic rats showed highly pigmented transplanted cells forming a double layer with slightly pigmented cells, attached to Bruch’s membrane. Since it is not clear whether transplanted pigmented cells can displace retinal pigment epithelial (RPE) host cells from Bruch’s membrane, we suggested that RPE cells of RCS dystrophic rats can phagocytize melanin granules, possibly derived from perished transplanted cells. · Methods: In a series of three experiments, RPE cells of nine pink-eyed, 2-month-old RCS dystrophic rats were isolated by trypsinization and mechanical dissection and cultivated in Dulbecco’s modified Eagles’ medium. These cells were then fed with melanin granules, isolated from bovine RPE cells, double-trypsinized after phagocytosis and viewed by light and electron microscopy. We also transplanted iris pigment epithelial (IPE) cells of 20-day-old Long-Evans rats into the subretinal space of pink-eyed RCS dystrophic rats of the same age, shown in light-microscopic photography after 42 days. · Results: Living RPE cells were heavily pigmented after feeding with isolated melanin granules in all three experiments as viewed by light microscopy. In addition, we identified melanin granules phagocytized by dystrophic RPE cells in electron microscopy. After transplantation of pigmented IPE cells into the subretinal space of pink-eyed RCS dystrophic rats’ eyes, a layer of slightly pigmented cells was seen on Bruch’s membrane below the transplanted IPE cells, shown in light microscopy. · Conclusion: We have shown by phagocytosis assay that dystrophic RPE cells can take up melanin granules in vitro. Our results assume that pigmented cells in transplantation studies, found as a monolayer, attached to Bruch’s membrane, cannot automatically be identified as transplanted cells. Instead, the possibility of perished transplanted cells serving as melanin donors for RPE host cells must be taken into consideration. Received: 11 March 1998 Revised version received: 5 May 1998 Accepted: 26 May 1998     

Modification of Isolation and Culture of Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Purpose: To modify the isolation of human retinal pigment epithelial (RPE) cells and to increase the purification and production of cultured RPE cells.Methods: The human eyecups were fixed on a rubber holder. After digestion by trypsin, RPE cells were collected, then cultured and identified by morphology, im-munohistochemistry and electron microscopy.Results: The cultured RPE cells grew actively in the early stage with transparent nucleus and abundant melanin particles in cytoplasm. These cells were positive in DOPA oxidase reaction and in anti-pancytokeratin antibody staining. Cellular microvilli and tight junctions could be seen through transmission electron microscopy. Conclusion: We developed a rubber holder to fix the eyecup. Using this holder, more and purer cultured RPE cells can be obtained. These cultured RPE cells are similar to those in vivo in morphology and immunohistochemical staining. Eye Science 1999; 15: 187 - 190.     

鼠视网膜光化学损伤中的主要组织化学改变

目的：观察大鼠视网膜光化学损伤的主要组织化学改变。方法：对动物模型进行视网膜超微结构观察、丙二醛含量测定、细胞色素氧化酶及镁激活三磷酸腺苷酶活性的组织化学观察。结果：超微结构发现光照后6小时，光感受器细胞核肿胀，内节线粒体肿胀，外节水肿，视网膜色素上皮(retinal pigment epithelitis,RPE)顶端微绒毛消失，溶酶体增多，6天反应加重。14天光感受器细胞及内节已基本正常，外节再生但盘膜排列稀疏，RPE顶端出现微绒毛。观察到光照后6小时及６天，视网膜细胞色素氧化酶及镁激活三磷酸腺苷酶活性下降，丙二醛含量增高，至１４天均有所恢复。结论：脂质过氧化使光感受器细胞膜系统损伤崩解，引起细胞超微结构及酶活性改变，可能与视网膜光化学损伤的发病有关。 (中华眼底病杂志,1998,14:38-40)