抗人AFP单抗及多抗与丝裂霉素联接物对肝癌细胞的杀伤作用

用本室制备的分泌IgG AFP McAb的杂交瘤株G2及G10,接种于BALB/c小鼠腹腔,取其腹水经硫酸铵及Sepharose 4B柱亲和层析纯化,获得抗人AFP单抗。将马抗人AFP血清经硫酸铵及Sepharose 4B柱亲和层析提取AFP抗体IgG,得到AFP多抗。将纯化     

重组人α2a型干扰素单克隆抗体的研制、特性鉴定及初步应用

应用常规方法建立了5株稳定分泌抗重组人α2a 型干扰素单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系1B8、2B6、3F1、4G5和5G10,并对其免疫学特性进行了较系统的鉴定.5株单抗均为 IgG1,特异性强,与重组人α1 型、γ型干扰素以及受体菌菌体蛋白成分无交叉反应.间接 ELISA 测定小鼠腹水单抗效价1:320,000～1:10,240,000,其中3F1和5G10单抗对重组人α2a 型干扰素具中和活性(中和效价均为1:10,000)。竞争结合 ELISA 证实5株单抗针对3种不同表位。用3F1和5G10单抗建立的夹心 ELISA 能检测到60pg/ml的重组人α2a 和α2b 型干扰素。3F1单抗用于制备亲和层析柱纯化重组人α2a 型干扰素结果与进口单抗NK2相当。     

单克隆抗体亲和层析法提纯人重组IL—2

本文用正辛酸沉淀法提纯了四株抗IL-2单克隆抗体(8H7、982、9812、9F5),并与溴化氢活化的Sepharose4B 偶联制成亲和层折柱纯化人重组IL-2(rhIL-2)。结果表明四根单抗亲和层析柱均可有效地纯化rhIL-2,其中9B12柱和9F5柱的提取率分别达到49.2%和37.5%,提取物纯度在95%以上,并具有较高的生物活性。     

抗重组人干扰素-α2b单克隆抗体的制备与应用

<正> 人α型IFN治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎及白血病有显著疗效。rHuIFN-α2b因其副作用小,疗效高,因而更为广泛使用。其生产过程中亲和层析纯化至关重要。为此我们制备了高特异性单克隆抗体3D9McAb用于分离纯化重组人干扰素α-2b(rHuIFN-α2b),现报道如下。1 材料和方法1.1 rHuIFN-α2b抗原制备 本所自制,用亲和层析柱纯化,比活2.0×10~8IU/mg,SDS-PAGE纯度达99％。1.2 单抗的筛选和制备 取8周龄雌Balb/c小鼠,用适当处理过的抗原免疫5次后进行细胞融合。ELISA法筛选,有限稀释法4次克隆后获得3D9细胞扩大培养,诱生腹水。     

一对高亲和力抗人肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备及鉴定

目的 获取抗人肌钙蛋白Ⅰ（cTnI）的单克隆抗体（McAb）.方法 以人cTnI作为抗原,免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备了抗人cTnI高亲和力、高特异性单克隆抗体.随后采用间接ELISA法测定抗血清效价,用protein G亲和纯化法纯化抗体,抗原竞争ELISA法鉴定抗体亲和力,SDS-PAGE法鉴定纯度,Western blotting鉴定抗cTnI单克隆抗体的特异性,竞争ELISA法分析抗原结合位点.结果 筛选出9株稳定分泌抗cTnI的单抗杂交瘤细胞株,其中A3、A9两株免疫球蛋白亚类均为IgG2a,分泌的抗体纯度高,与CK-MB、cTnT无交叉反应,效价均为：1：1024000,亲和力分别为4.21×10^8mol/L、1.07×10^8mol/L,抗原结合位点不同.结论 成功制备出了一对高亲和力、高特异性抗人cTnI单克隆抗体.     

单链尿激酶型纤溶酶原激活剂单克隆抗体的制备及应用

用 99%纯度的单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (scuPA )免疫BALB/c小鼠制备了 4株能稳定分泌抗scuPA的IgG1类单克隆抗体 (McAb )的杂交瘤细胞系G7、E8、D1和A9。检测了这四株单抗的特异性 ,它们与组织型纤溶酶原激活剂 (t PA )无反应 ,与双链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (uPA )的结合力很弱。其中G7细胞株单抗与单、双链结合的差异最大。取纯化G7单抗制备亲和层析柱。用此柱直接从培养上清纯化scuPA ,得到的scuPA纯度为 96 3% ,回收率为 85 4% ,纯化倍数 5 0倍左右 ,比活 1 2 9× 10 5。纯化方法简单、操作方便、避免了因步骤繁杂造成的scuPA的降解 ,同时降低了成本。     

人源抗人干扰素α1b全抗体在昆虫细胞中的表达、纯化和鉴定

目的克隆、杆状病毒/昆虫表达系统表达人源抗人干扰素α1b(huIFN-α1b)全抗体基因,获得全抗体蛋白。方法利用PCR技术以gIII-scFv融合表达的噬菌粒质粒为模板,分别克隆了5株抗体基因的轻链和重链;经Nco I/Xho I和Sac I/Hind III分别酶切,与经过相同酶切的pAC-K-CH3载体连接构建了昆虫细胞sf9表达载体pAC-K-CH3-H-L;经测序鉴定正确后,转染进入昆虫细胞sf9进行异源表达。采用免疫荧光(IFA)和ELISA对全抗体的表达和结合情况进行初步鉴定。采用Protein-A亲和层析柱对收获的全抗体IgG蛋白进行纯化,将纯化后的抗体蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定。结果成功扩增了人源抗人干扰素α1b抗体轻链和重链基因;免疫荧光(IFA)鉴定表明5株重组质粒在昆虫细胞sf9表达出了全抗体蛋白,ELISA鉴定表明其中3株与huIFN-α1b特异性结合;经Protein-A亲和层析柱纯化后每升细胞培养上清收获了5~20 mg的蛋白,Western blotting鉴定表明3株纯化的全抗体蛋白和huIFN-α1b特异性结合。结论通过杆状病毒/昆虫表达系统获得了3株人源抗人干扰素α1b(huIFN-α1b)全抗体蛋白。     

重组人γ-干扰素单克隆抗体的制备与纯化研究

本文报道重组人γ-干扰素单克隆抗体的制备与纯化研究。用常规法将分泌重组人γ-干扰素(γHu2FN-γ)单克隆抗体(McAb)细胞株(A_3和B_3E_7)接种组织相容性的动物体内,诱生有活性的IFN-γ-McAb,其中一株A_3杂交瘤分泌抗Hu2FN-γ-McAb的性能非常稳定。它比B_3E_7杂交瘤分泌的McAb效价高5～10倍。为提供较高纯度的A_3、B_3E_7 McAb制品、本     

兔抗单克隆个体基因型抗体的制备鉴定

利用具有抑制恶性疟原虫生长能力的94D_1株单克隆抗体(McAb)免疫家兔。得到抗血清后,经Seharose 4 B—正常BALB/c小鼠IgG固相反复吸附3次以上,以除去其抗同种型和同种异型抗体,然后再经Sepharose4 B—9~4D_1株McAb亲和层析柱提纯,得到抗9_4D_1个体基因型抗体。这种抗体经免疫双扩散、IFA封闭试验、SPRIA等方法鉴定,证明具有较高的特异性。在双扩散中,仅与9_4D_1株McAb产生沉淀线;在IFA封闭试验中,能抑制     

抗rhEPO单克隆抗体的制备及初步应用

目的 :研制抗人促红细胞生成素的特异性单克隆抗体 (mAb) ,对其生物学特性进行初步鉴定 ,并用于转基因羊乳中重组人促红细胞生成素 (rhEPO)的提纯。方法 :以自制的rhEPO粗品免疫BALB/c小鼠 ,制备抗rhEPO的mAb。以Westernblot和间接ELISA法 ,对所获mAb进行初步鉴定。以纯化的mAb同预活化的Sepharose 4B偶联 ,制得mAb亲和层析柱 ,并用于转基因羊乳中rhEPO的提纯。结果 :获得两株可分泌特异性抗rhEPO的mAb的杂交瘤细胞株 (1E7和 2E6 )。Ig亚类 (型 )的鉴定分别为IgG1和IgG2b ,轻链均为κ型。用Westernblot证实 ,获得的mAb可特异性地识别rhEPO。用自制的免疫亲和层析柱用于转基因羊乳中rhEPO的提纯 ,具有很好的吸附作用 ,回收率达 70 %。结论 :成功地获得两株可分泌特异性抗rhEPO的mAb的杂交瘤细胞。用自制的免疫亲和层析柱提纯转基因羊奶中的rhEPO具有较高的吸附效率     

重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)单克隆抗体,为rLZ-8的药效学及药代动力学研究奠定基础.方法:以纯度99%的rLZ-8免疫BALB/c小鼠;应用常规的细胞融合技术建立一种能够稳定分泌抗rLZ-8单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用小鼠腹腔接种法制备腹水;Protein A Sepharose 亲和层析柱在AKTA纯化仪上对抗体进行纯化;间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价;Western blot胶片曝光方法对rLZ-8单克隆抗体特异性进行分析.结果:筛选出2株可特异性分泌抗rLZ-8单克隆抗体的杂交瘤细胞株.分别命名为clone13-2-3和clone11-4-4.其抗体亚型分别为IgG1亚型和IgG2a亚型.腹水抗体效价分别为1:12 000和1:7 500,细胞培养上清效价分别为1:3 000和1:2 800.Western blot检测证明这两株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体均具有良好的特异性.结论:成功制备出较高效价和较高特异性的鼠抗rLZ-8的单克隆抗体.     

抗解脲脲原体单克隆抗体的制备

作者用提纯的解脲脲原体抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞FO融合,获得3株稳定分泌抗解脲脲原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。制备了小鼠腹水抗体,并对杂交瘤细胞株进行了鉴定。用ELISA法测定该抗体腹水效价为1:64000～1:2048000,1F9、2B2抗体的Ig类型为IgG1,5H1为IgG2b。建立的3株能稳定分泌抗解脲脲原体的McAb杂交瘤细胞林,经液氮冻存后复苏,其分泌抗体能力不受影响。     

HCA518的蛋白表达、纯化和单克隆抗体的制备

目的:对HCA518蛋白进行表达和纯化,并制备HCA518蛋白的单克隆抗体。方法:采用基因重组技术在原核系统表达HCA518蛋白,金属镍螯合的Ni-NAT亲和层析柱进行蛋白纯化;杂交瘤技术建立分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株;ELISA方法进行单克隆抗体细胞株的筛选;Westem blot方法鉴定单克隆抗体的特异性;免疫荧光法对HCA518蛋白进行定位。结果:成功表达和纯化了HCA518重组蛋白,其纯度达98％。共筛选出2株分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水并纯化了HCA518的单克隆抗体,腹水中单克隆抗体的效价分别为1×10-4、5×10-4,属于IgG2b亚型和IgM,该抗体能与重组蛋白和肿瘤细胞核蛋白(P100)发生特异性反应,免疫荧光显示HCA518蛋白主要定位于细胞核中。结论:建立了稳定分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备的单克隆抗体特异性好,对进一步应用于检测肿瘤组织中HCA518蛋白和判断肿瘤细胞的恶性增生程度预测肿瘤预后具有重要的实用价值。     

抗人肝再生增强因子单克隆抗体的研制

目的　利用纯化的重组人肝再生增强因子(hALR)制备抗hALR的单克隆抗体,建立hALR的检测方法。方法 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,经ELISA和免疫印迹证明其特异性。结果获得了4株分泌抗hALR特异性抗体的杂交瘤 细胞系;无血清培养液效价为1×10-2,腹水效价为1×10-5;亚类鉴定表明2株单克隆抗体为IgGl,另2株为IgG2b;免疫印迹 显示抗体结合抗原的分子量与hALR相符,为特异性抗hALR抗体。结论通过杂交瘤技术,获得了抗hALR的单克隆抗体 为以后的工作奠定了基础。     

抗狂犬病病毒CVS-11株单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备抗狂犬病毒单克隆抗体,为建立快速准确的狂犬病毒抗原检测方法奠定基础.方法 将狂犬病病毒CVS-11株纯化浓缩后免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经细胞克隆和间接ELISA筛选,获得稳定分泌抗狂犬病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株.小鼠腹腔注射法制备大量单克隆抗体并测定腹水效价,用G蛋白亲和层析柱进行纯化,间接ELISA法和间接荧光法鉴定单克隆抗体的类型、特异性及敏感性.结果 细胞融合率达100%,经克隆筛选获4株稳定分泌抗狂犬病病毒抗体的杂交瘤细胞株,其腹水效价分别为1×104,1×105,1×104和1×105;4株单抗均为IgG类型且特异性好.结论 制备的单抗具有良好特异性和敏感性.     

亲和层析纯化重组人源性抗HBsAg Fab抗体

目的：纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAg Fab抗体，建立稳定、适于生产应用的纯化工艺。方法：以原核表达的重组人源性抗HBs scFv免疫BALB／c小鼠，经杂交瘤技术制备大量分泌mAb的杂交瘤细胞株14F7。将该细胞株注入小鼠腹腔制备mAb腹水，经辛酸沉淀纯化后，制备亲和层析柱。纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAg Fab抗体。结果：用抗scFv mAb亲和层析柱纯化的重组人源性抗HBsAg Fab的纯度可达95％以上，回收率可达70％～85％。结论：人源性抗HBs scFv制备mAb作为亲和层析的介质，可有效地从酵母发酵上清中纯化重组人源性抗HBsAg Fab，适用于大规模生产重组人源性抗HBsAg Fab。     

从人源全合成抗体库中筛选到抗人干扰素α1b单链抗体

目的研究开发人源抗huIFN—α的基因工程抗体,为系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）的治疗提供有效的抗体药物。方法本研究利用噬菌体表面展示技术,以纯化的人干扰素α1b（huIFN-α1b）和人干扰素α2b（huIFN—α2b）蛋白为抗原从人源全合成抗体库中筛选抗huIFN-α的基因工程单链（single chain variable fragment,scFv）抗体,通过phage—ELISA对噬菌体单链抗体的结合特异性和稳定性进行验证。将单链抗体基因克隆到原核分泌表达载体pET22b上在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,通过Western blot检测单链抗体的分泌表达,并通过ELISA对单链抗体的结合特异性进行验证。通过金属螯合亲和层析纯化单链抗体,并用Western Blot对单链抗体的结合特异性进行鉴定。结果经过3轮富集筛选,获得100株对huIFN—α1b有特异性结合的噬菌体单链抗体。对得到的86株克隆的测序分析表明,共有9株带有不同的抗体轻重链可变区序列及其组合的抗体,有7株抗体轻重链可变区序列分类在VH3和VL3家族,有2株抗体轻重链可变区序列分类在VH3和VL1家族。获得了5株稳定且特异针对huIFN—α1b而与huIFN-α2b和huIFN-γ无交叉反应的人源单抗。这5株抗体在BL21（DE3）中分泌表达,有3株单链抗体能特异性结合huIFN-α1b而与无关抗原无交叉反应。结论通过噬菌体表面展示技术,从人源全合成抗体库中筛选得到3株稳定且特异结合huIFN—α1b的人源治疗用基因工程单克隆抗体。     

抗重组志贺毒素ⅡB亚基单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

目的 制备出高效价的抗重组志贺毒素ⅡB亚基(rStx2B)单克隆抗体.方法 以融合蛋白EspA-Stx2B作为抗原,免疫Balb/c小鼠,以未免疫的Balb/c小鼠脾细胞为饲养细胞;运用细胞杂交瘤技术制备,运用间接ELISA法筛选产生针对rStx2B的单克隆抗体细胞株;体内诱生法产生腹水,饱和硫酸铵沉淀法初步纯化,再采用HiTrap rProtein A柱进一步纯化,快速定性试纸鉴定McAb的Ig亚型,采用间接ELISA法相加实验鉴定抗原识别表位.结果 获得3株产生针对rStx2B的单克隆抗体细胞株Stx2B-1H9、Stx2B-1H10、Stx2B-3E5,Ig亚型分别为IgG1κ型,IgG2aκ型,IgG2bκ型,亲和力常数分别为7.36×108、6.94×108、5.85×108.结论 成功制备3株稳定分泌抗rStx2B的杂交瘤细胞株,产生的McAb特异性好,亲和力高,为应用这些单克隆抗体建立免疫亲和层析法纯化天然志贺毒素Ⅱ,鉴定Stx2B的表位,研究针对EHEC O157:H7感染的治疗性抗体奠定了基础.     

抗重组人表皮生长因子单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

目的　制备出高效价的抗重组人表皮生长因子 (EGF)单克隆抗体。方法　以重组人表皮生长因子作为抗原 ,免疫Balb/c小鼠 ,以未免疫的Balb/c小鼠脾细胞为饲养细胞 ,运用细胞杂交瘤技术制备 ,间接ELISA法筛选产生针对人表皮生长因子的单克隆抗体细胞株 ;以体内诱生法产生腹水 ,并采用ProteinA Sepharose柱对其纯化 ,快速定性试纸鉴定McAb的Ig亚类 ,采用间接ELISA法相加实验鉴定抗原识别表位。结果　获得 3株产生针对人表皮生长因子的单克隆抗体细胞株EGF B2 、EGF C7、EGF A8,Ig亚分别为IgG1κ型 ,IgG1λ型 ,IgG3 κ型 ,亲和力常数分别为 2 .76× 10 10 、3.2× 10 9、1.4 5× 10 9。结论　成功制备 3株稳定分泌抗rhEGF的杂交瘤细胞株 ,产生的McAb特异性好 ,亲和力高 ,为探讨EGF的作用机制及临床应用奠定了基础 ,为肿瘤的诊断与治疗提供具有实用价值的研究工具 ,此外 ,为EGF的纯化提供实验材料     

免疫亲和层析法纯化重组人促红细胞生成素的实验研究

目的 以免疫亲和层析方法纯化重组人促红细胞生成素（rhEPO)。方法 以rhEPO作为抗原，免疫Balb/C小鼠，制备抗rhEPO单克隆抗体（mAb)。以纯化的抗rhEPOmAb2F12与预活化的Sepharose4B偶联，制成抗体亲和层析柱，纯化rhEPO。结果 经筛选共获得4株可分泌抗rhEPOmAb的杂交瘤细胞株，分别为：1A8、2F12、3D4和3F10。亲和层析纯化的rhEPO经SDS-PAGE显示单一条带，2g凝胶制备的层析柱一次层析可获得1.5mg 高纯度的rhEPO。利用纯化的mAb建立的ELISA法，用于检测rhEPO的蛋白含量可达ng水平。结论 免疫亲和层析法纯化rhEPO的效率高，纯度好，用纯化的mAb建立的ELISA法具有灵敏度高，重复性和稳定性好等优点。