淋病奈瑟菌孔蛋白PIA真核表达系统的构建及序列分析

目的:构建淋病奈瑟菌孔蛋白PIA(Porin IA)基因的真核表达系统,为淋病DNA疫苗的研究提供材料。方法:PCR技术扩增淋病奈瑟菌捷克标准株的PIA基因片段,将其定向插入真核表达载体pC I-neo多克隆位点中,构建重组表达载体。并用酶切分析、PCR扩增及序列测定方法,对重组载体进行鉴定。结果:淋病奈瑟菌PIA基因被正确克隆到真核表达载体pC I-neo中,测序结果与Genebank中AF090819等菌株序列有99.99%同源性。结论:真核表达系统(pC I-PIA)构建成功。     

幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定

目的 构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据.方法 提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒;采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定.结果 扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp;pcDNA3.0-GroEL重组质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中.结论 成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL.     

白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶真核表达质粒pcDNA3．1／SAP2的构建

目的构建白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶真核表达质粒pcDNA3．1／SAP2．为以其作为基因疫苗进行免疫动物实验奠定物质基础。方法从白假丝酵母菌中提取基因组DNA，以其为模板采用聚合酶链反应（PCR）法获取SAP2基因，将真核表达质粒pcDNA3．1（＋）myc-HisC和SAP2基因行EcoRI和XhoI双酶切，琼脂糖凝胶纯化，连接酶切产物，转化TOP10感受态细菌，筛选菌落和测序鉴定。结果经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计相同，并定向插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）myc-HisC，电泳获得预期的SAP2条带,测序证实为正确的SAP2序列。结论利用真核表达质粒pcDNA3．1（＋）myc-HisC可以方便而高效地构建pcDNA3．1／SAP2重组质粒，该质粒能直接激活抗原提呈细胞，可以使重组质粒具有较强的免疫原性和免疫反应性。     

日本血吸虫pcDNA3．1．（＋）-SjPGK重组质粒的构建及鉴定

目的 构建日本血吸虫中国大陆株磷酸甘油酸激酶基因片段(SiPGK)的真核表达重组质粒，寻找新的预防日本血吸虫病的候选疫苗分子。方法 采用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)技术，从日本血吸虫总RNA中体外扩增SPGK基因片段；克隆人pMD18-T载体中，然后挑取阳性克隆经双酶切分析、PCR鉴定；亚克隆人真核表达载体pcDNA3．1( )中，阳性克隆经鉴定后进行脱氧核糖核酸序列测定；运用Blast程序，将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。结果 RT-PCR特异性扩增出一条长约830bp大小的条带；重组质粒pMD18-T-SPGK和pcDNA3．1( )-SPGK经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增，均可获得一条与RT-PCR产物一致的DNA片段；脱氧核糖核酸序列测定和分析结果表明：SjPGK基因片段长为830bp，与SmPGK的核苷酸同源性为85％，分值为672；氨基酸同源性为94％，分值为473。结论 成功地构建pcDNA3．1( )-SiPGK重组质粒，为构建其核酸癌苗提供了条件。     

Dectin-1融合蛋白真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠Dectin-1融合蛋白真核表达质粒并进行真核表达初步研究.方法 运用RT-PCR技术扩增小鼠腹腔巨噬细胞Dectin-1基因的细胞外碳水化合物识别域(CRD),与真核表达载体pSecTag2C进行双酶切之后进行连接反应,构建重组融合表达载体,转染入293细胞中,目的 蛋白在细胞培养基中分泌表达,表达产物经蛋白浓缩、纯化后经SDS-PAGE、Western印迹鉴定.结果 获得重组真核表达载体pSecTag2C-Dectin-1,测序结果 证明质粒DNA序列完全正确,并在转染入293细胞后检测到目的 蛋白的表达.结论 成功构建重组真核表达载体pSecTag2C-Dectin-1,为进一步纯化蛋白研究真菌检测方法 及Dectin-1与真菌相互作用机制、功能等奠定了基础.     

帕金森病PINK1蛋白真核表达载体pcDNA3．1-myc／PINK1的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建帕金森病PINK1基因真核表达载体pcDNA3．1-mye／PINK1,检测其转染COS-7细胞后的表达。方法用PCR方法从人cDNA文库DNA中扩增PINK1全长cDNA,该基因片段两端设计了EcoR I和BamH I限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将PINK1的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3．1-myc—his（-）B上,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术将所构建的载体导入COS-7细胞中,体外培养,于转染48h后利用RT—PCR和Western Blotting方法检测目的基因的表达情况。主要观察指标：（1）PINK1基因cDNA扩增产物检测。（2）pcDNA3．1-myc／PINK1重组体酶切鉴定。（3）Western—blotting。结果经琼脂糖凝胶电泳及测序证实,PCR获得的片段与GenBank中登记的PINK1序列完全相同;pcDNA3．1-myc／CHIP酶切片段的长度与理论大小相符;转染48h后的COS-7细胞可检测到PINK1蛋白的表达。结论PINK1蛋白真核表达载体构建成功,在COS-7细胞中可获得表达。     

HO-1不同活性真核表达载体的构建及鉴定

目的构建含有HO-1基因的重组载体并将其稳定转染到肝癌细胞系HepG2中。方法采用PCR技术扩增wtHO-1/mHO-1G143H基因片断,EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后连接pcDNA3.1（＋）载体与目的片段,转化DH5a菌株感受细胞,获得阳性重组质粒。采用脂质体法转染HepG2细胞系,G418筛选抗性克隆,利用半定量RT-PCR、Western blot检测转染细胞系中HO-1基因的表达。结果成功制作了HO-1活性增高和降低的细胞模型。结论 HO-1不同活性真核表达载体的成功构建,为进一步研究HO-1的功能奠定了基础。     

Smad3-siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的构建Smad3特异的RNA干扰质粒载体,为探讨抑制Smad3表达在肝纤维化治疗中的意义奠定基础。方法根据GenBank数据库提供的Smad3基因核苷酸序列,选择设计能转录小发夹结构RNA(small hairpinRNAs,shRNA)的DNA序列,并与pSilencer3.1-H1-hygro质粒载体连接,构建真核表达载体,使用限制性内切酶鉴定及测序鉴定是否为阳性克隆。结果成功构建pSilencer3.1-Smad3载体,拟进一步采用RNAi技术观察其对Smad3基因表达的抑制情况,从而研究其在肝纤维化治疗中的作用。结论 Smad3-siRNA真核表达载体被成功构建。     

淋病奈瑟菌外膜蛋白PIA基因原核表达系统的构建及序列分析

目的：分析比较5株临床分离的淋病奈瑟菌外膜蛋白PIA基因核苷酸及氨基酸序列，构建PIA基因的原核表达系统。方法：采用高保真PCR扩增5株淋病奈瑟菌全长PIA基因序列，T—A克隆后测序并与已发表的序列进行比较，用Wonderful分子生物学软件分析基因和蛋白质序列的相似性。再构建PIA原核表达系统，不同浓度IPTG诱导后，10％SDS—PAGE检测蛋白表达情况。结果：5株PIA淋病奈瑟菌均为IA6血清型。与报道的PIA基因序列（No：L19962）比较，核苷酸和氨基酸序列相似性均分别高达99．47％-100％和99．04％-100％。构建的原核表达系统pET42-PIA—Ecoli BL21DE3表达的重组蛋白PIA量占细菌总蛋白量的49．6％。结论：IA6为PIA菌株优势血清型，核苷酸和氨基酸序列相似性高，已成功构建淋病奈瑟菌PIA基因高效原核表达系统，为淋病奈瑟菌基因疫苗和临床检测试剂盒的研制打下基础。     

巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）融合EGFP真核表达载体的构建及表达

目的 构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，并鉴定其在小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞能否正确表达。方法 PCR扩增M-CSF基因，定向克隆入带有EGFP报告基因的真核表达载体，构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，脂质体介导将pEGFP-CSF转染人NH3T3细胞，以一步法RT-PCR检测其在NIH3T3细胞中的表达情况。结果 双酶切及测序鉴定证明成功构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，并在NIH3T3细胞中成功地表达了融合荧光蛋白，RT-PCR检测结果显示RT～PCR扩增产物与M～CSF目的基因片段大小相符，确实源于重组质粒转录后的。nRNA。结论 真核表达重组体pEGFP-M-CSF的成功构建及在体外真核细胞中有效表达，为进一步研究M-CSF在真核细胞中的信号调控奠定了一定的实验基础。     

结核杆菌含信号肽的Mtb8．4真核表达质粒的构建及鉴定

目的 对结核杆菌新抗原一带信号肽的Mtb8．4(MS)进行基因克隆，构建其真核表达质粒并加以鉴定。方法 采用聚合酶链反应(PCR)从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增出带信号肽的Mtb8．4(MS)目的基因，经HindⅢ和EeoR Ⅰ消化后，与pcDNA3.1( )载体进行连接重组。结果 pcDNA3．1( )-MS真核表达质粒构建完成后，用限制性内切酶消化、PCR及DNA测序等多种方法进行鉴定，证实其构建成功。结论pcDNA3．1( )-MS真核表达质粒的成功构建，为进一步研究该质粒的免疫保护效果，了解信号肽序列在MS蛋白表达和分泌过程中所起的作用及制备相应的结核病DNA疫苗奠定了基础。     

pcDNA3.1(+)TPA构建及其在人脐静脉内皮细胞的表达活性研究

目的建立TPA基因在人脐静脉内皮细胞外源性表达的方法，为缺血性心脏疾病的基因治疗及防止血管再狭窄提供理论依据和新方法。方法构建真核表达载体pcDNA3．1( )TPA，并采用脂质体法将其转入体外培养的人脐静脉内皮细胞，并现察外源性TPA表达情况。结果真核表达载体pcDNA3．1( )TPA在人脐静脉内皮细胞中获有效表达，酶联免疫吸附法TPA蛋白表达定量检测结果为568．6ng／10^6细胞／24h，未转pcDNA3．1( )TPA的人脐静脉内皮细胞测得为17．8ng/10^6细胞／24h；发色底物法测得外源性TPA活性为108．8IU／10^6细胞／24h，未转pcDNA3．1( )TPA的人脐静脉内皮细胞测得为5．6IU／10^6细胞／24h。结论pcD．NA3．1( )TPA转入人脐静脉内皮细胞后，外源性TPA基因荻有效表达，为缺血性心脏病的TPA基因治疗提供了理论依据和新方法。     

淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因的克隆及序列分析

目的 获取淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因(porB)并构建其重组表达质粒。方法 根据porB已知序列，设计合成一对引物，用PCR方法从淋病奈瑟菌基因组DNA中扩增出porB基因片段，克隆到原核表达质粒pQE30中，转化大肠埃希菌M15感受态细胞，经酶切和PCR鉴定，然后进行测序。结果 porB基因体外扩增产物大小约为911bp。重组质粒经双酶切和PCR鉴定表明为正确重组子，测序结果与已知序列基本吻合。结论 成功克隆了淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因，为下一步PorB蛋白的功能研究和淋病奈瑟菌蛋白质疫苗的研制提供了基本的物质基础：     

奈瑟氏淋球菌外膜蛋白PIA基因的克隆、真核表达与鉴定

目的克隆奈瑟氏淋球菌外膜蛋白PIA基因,构建稳定的真核重组表达载体,并在HELA细胞中表达。方法根据淋球菌PIA基因序列,利用Primer Premier5.0生物学软件设计一对特异性扩增引物,以淋球菌国际标准株基因组DNA为模板,PCR扩增除掉信号肽后PIA基因开放读码框（ORF）,将其插入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,构建含目的基因的pcDNA3.1（＋）/PIA重组质粒,PCR及酶切鉴定重组载体,脂质体转染HELA细胞,以间接免疫荧光法检测PIA基因在HELA细胞中的表达。结果成功构建了pcDNA3.1（＋）/PIA重组质粒;pcDNA3.1（＋）/PIA能在HELA细胞中高效表达PIA蛋白。结论重组质粒pcDNA3.1（＋）/PIA构建成功并在HELA细胞中高效表达了PIA蛋白,为该蛋白的抗原性及功能学研究奠定了基础。     

2007年-2010年淋球菌的检测及结果分析

目的:了解本地区淋病奈瑟菌(NG)感染情况,为及时采取预防、治疗和控制措施提供科学依据。方法:收集2007年-2010年来海宁市人民医院就诊患者中分离的NG,用TM平板36℃含5%～10%CO2恒温培养48 h;用头孢硝酚纸片检测产青霉素酶淋球菌(PPNG)。结果:3176例患者标本经分离、培养、鉴定的NG为302株,阳性率达9.51%,其中男性41人,女性261人,加权平均年龄33.2岁,以21岁～40岁人数最多。从302株NG中共检出224株PPNG占74.17%。成年组中年龄越轻疑似病例比例越高,年龄越大NG检出率越高。结论:淋球菌耐药状况严重,临床上要合理使用抗生素;对不同的年龄组要进行相关的卫生保健知识的教育。     

阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶(adenynate kimse,AK)基因真核表达载体并予以鉴定.方法 根据AK基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从阴道毛滴虫基因组DNA中扩增出AK基因,并将其克隆入pMD18-T Simple载体.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用BLAST软件辅助分析所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列的同源性.克隆载体PMD-18T-AK经限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切,得到含这2个酶切位点之AK DNA片段,T4连接酶连接到含有这2个酶切位点的真核表达载体pcDNA3.1( ),构建出重组真核表达载体pcDNA3.1( )-AK,经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实DNA片段大小的正确性.结果 经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实含大小正确的AK DNA片段.结论 成功地构建了基因真核表达载体.     

肿瘤转移抑制基因KiSS-1的克隆与真核表达载体的构建

目的克隆不含信号肽的人肿瘤转移抑制基因KiSS-1,构建KiSS-1基因的真核表达载体并鉴定。方法从正常人膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,将其克隆到真核表达栽体pcDNA3.1( ),构建真核表达质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1。结果经基因序列分析及PCR和酶切鉴定,证实目的基因片段已成功插入载体pcDNA3.1( )且序列正确。结论重组质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1构建成功,为下一步KiSS-1蛋白的表达和研究该蛋白的功能奠定了良好的基础。     

人谷胱甘肽硫转移酶M1真核表达系统序列分析

目的 对人谷胱甘肽硫转移酶M1真核表达系统的构建及序列分析。方法 采用RT-PCR方法将肺组织中提取总RNA扩增人谷胱甘肽硫转移酶M1基因的cDNA序列，将其插入到真核表达载体pcDNA3．1多克隆位点中，构建重组表达质粒，并用PCR扩增、酶切分析及序列测定等方法对重组质粒进行鉴定。结果 入谷胱甘肽硫转移酶M1克隆到真核表达质粒pcDNA3．1中，测序结果同Genbank GSTM1(GI：183668)cDNA序列相比较，在619位点C→A，氨基酸由Pro→Thr；在519位点C→G，编码的氨基酸仍为1ys；在528位点C→T，编码的氨基波仍为Asp。同源性为99％，基因登陆号为AY532926。结论 入谷胱甘肽硫转移酶M1真核表达系统的构建，为进一步进行真核细胞和动物的解毒机制研究，提供应用材料。