呼吸道病毒基因反义技术的研究进展

反义寡核苷酸是一段与mRNA特异性结合并阻断其基因表达的人工合成的DNA分子.本文通过对呼吸道病毒特异性反义寡核苷酸的作用位点、序列设计、生物利用度(化学修饰、载体运用等)的讨论为抗呼吸道病毒新型药物的研究提供一条新途径.     

反义寡核苷酸研究进展

反义寡核苷酸可以通过与mRNA相互作用调节的基因表达,但是其作用的强弱受多种因素的影响。反义RNA和反义DNA在调节基因表达方面各有优缺点;采取适当的方法增强反义寡核苷酸的摄取及促进其释放可以大大提高它们的作用效率;反义寡核苷酸在活体内主要经肾脏和肝脏代谢,有一定特异性和非特异性副作用。根据不同的目的,选择适当的反义寡核苷酸用于研究或疾病的治疗与预防,具有很重要的理论意义和现实意义。     

反义寡核苷酸对流感甲型病毒致细胞病变的抑制作用

目前对流感的治疗尚无良药,已有报导用反义寡核苷酸可抑制流感病毒复制,人工合成一小段寡核苷酸特异性地互补到靶基因序列上以关闭基因功能。本文根据流感甲型病毒RNA(vRNA)基因组8个片段的保守区3′-端同源部分,合成了12个碱基的反义寡核苷酸(ASON-12),以病毒(京防A1/E12/86)为靶,观察其抗病毒致细胞病变效应。为了提高宿主细胞对寡核苷酸的捕获率,其末端将预先合成的十四碳烷氧基-β-氰乙基亚磷酸脂连接到寡核苷酸的5′-末端,用次黄苷(I-nosine)取代5′端第四位碱基。 鸡胚细胞接种流感病毒3天后,细胞发生病变,细胞病变程度与病毒接种量成正相关。细胞感染病毒同     

反义寡核苷酸技术及其在NMDA受体亚单位研究中的应用

反义寡核苷酸技术是利用碱基互补配对的原则 ,设计一段寡脱氧核苷酸 ,与靶序列特异结合 ,从而抑制基因表达 ,降低mRNA和 /或蛋白质水平 ,影响动物的后续生物效应。反义寡核苷酸技术作为一种快速、特异性阻断基因表达的方法 ,近二十年来取得迅速发展 ,其潜在应用价值巨大。特别是近年来在对NM DA受体领域的反义研究 ,越来越得到人们的重视。本文就反义寡核苷酸技术及当前反义寡核苷酸技术在NMDA受体亚单位研究中的应用进行阐述。     

硫代bFGF寡核苷酸抑制HepG2和Hep2细胞的增殖

目的探讨硫代修饰对bFGF寡核苷酸抑制HepG2和Hep2细胞增殖的影响。方法设计、合成bFGF寡核苷酸,聚乙烯亚胺(jetPEI)介导其转染入HepG2和Hep2细胞,荧光显微镜观察其在细胞中的定位,流式细胞仪分析转染效率,MTT法检测细胞增殖。结果bFGF反/正义硫代寡核苷酸被jetPEI介导高效转染入细胞内,主要位于细胞核。反/正义硫代寡核苷酸均呈剂量时间依赖地抑制细胞增殖,相同剂量时正硫代寡核苷酸的抑制效率高于反义硫代寡核苷酸。相应非修饰反义寡核苷酸较其互补正义链能更有效抑制两种细胞增殖。核苷酸突变明显降低反义硫代寡核苷酸对细胞抑制,并不影响正义硫代寡核苷酸的细胞抑制率。反义硫代寡核苷酸明显降低细胞中bFGF表达。结论硫代修饰bFGF反义寡核苷酸在细胞内特异性结合核酸以反义机制抑制肿瘤细胞增殖,正义寡核苷酸则因硫代修饰于细胞内以非核酸特异性机制抑制肿瘤细胞增殖。     

反义寡核苷酸抑制猪内皮细胞生成内皮素的研究

目的：研究内皮素反义寡核苷酸能否抑制猪肺动脉内皮细胞生成内皮素。方法：设计并合成三段针对内皮素－１前体基因的反义寡核苷酸片段，检测其对培养的内皮细胞生成内皮素的影响。结果：两个反义寡核酸片段能明显抑制体外内皮细胞生成内皮素，而相应正义和非特异硫代寡核苷酸则无此抑制作用，说明其作用具特异性。结论：内皮素－１反义寡核苷酸有可能用于内皮素相关的疾病的治疗。     

乳糖化多聚赖氨酸导向反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒的作用

目的 研究乳糖化多聚赖氨酸（Gal-PLL）导向反义寡核苷酸对乙型肝炎病毒（HBV）基因表达的特异性抑制作用。方法 根据聚合酶链反应（PCR）产物直接测序结果,在HBV U5样序列区合成了一段16聚硫代磷酸的反义寡核苷酸,并将其与肝靶向配体GaL-PLL连接,在2.2.15细胞比较,观察了它们对HBV基因表达的影响,结果 通过测序确定了2.2.15细胞中的HBV DNA属于HBV表面抗原ayw1亚型,并将此用于反义寡核苷酸的序列设计;经荧光组化分析表明,Gal-PLL对大鼠肝组织有选择性亲和力;Gal-PLL与DNA形成复合物的最佳摩尔比为2：1,在相同实验条件下,硫代磷酸反义寡核苷酸对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为70％和58％,而Gal-PLL硫代磷酸反义寡核苷酸对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为96％和82％,同时培养上清液和细胞中HBV DNA的含量明显下降,无关序列寡核酸无明显效果,寡核苷酸对细胞未产生毒性,结论 肝靶向配体和反义寡核酸的复合物可以通过无唾液酸糖蛋白受体靶入2.2.15细胞内,并对HBV基因表达和复制产生特异性抑制作用。     

抑制氯通道CLCN2基因表达对顺铂诱导胶质瘤U251细胞损伤的影响

目的： 探讨使用特异性CLCN2反义寡核苷酸抑制CLCN2基因表达对顺铂诱导的神经胶质瘤U251细胞损伤的影响。方法：U251细胞按处理方法不同分4组,对照组（转染无义寡核苷酸）、转染CLCN2反义寡核苷酸组、顺铂组（无义寡核苷酸与顺铂联用）、CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组。应用MTT法检测U251细胞生存率;RT-PCR检测CLCN2、cyclinD1 mRNA表达;TUNEL法检测细胞凋亡率。结果：与对照组相比,转染CLCN2反义寡核苷酸组、顺铂组和CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组U251细胞生存率、CLCN2 mRNA表达降低,凋亡细胞数增加;与顺铂组相比,CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组细胞生存率（P＜0.05）、CLCN2、cyclinD1 mRNA表达降低,凋亡细胞数增加（P＜0.01）;与CLCN2反义寡核苷酸组相比,CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组CLCN2 mRNA表达明显降低（P＜0.01）。结论：①转染CLCN2反义寡核苷酸能有效抑制CLCN2 mRNA表达;②抑制CLCN2 mRNA表达能促进顺铂对U251细胞的损伤作用;③CLCN2基因表达降低参与顺铂对U251细胞损伤作用。     

MIF反义寡核苷酸对巨噬细胞表达MIF的影响

目的：研究巨噬细胞移动抑制因子（MIF）反义寡核苷酸对体外巨噬细胞表达MIF的影响。 方法： 设计特异性MIF寡核苷酸，其序列为:反义: 5’-TACGGATACAAGTAGCAC-3’; 正义: 5’－ATGCCTATGTTCATCGTG-3’;错义: 5’－CTCTCAGACTCGATCTGT-3’。通过脂质体包裹后将其分别转染至小鼠巨噬细胞，观察MIF反义寡核苷酸对脂多糖（LPS）刺激巨噬细胞表达MIF的影响。 结果： LPS刺激后6 h，巨噬细胞表达MIF mRNA和合成分泌的MIF量增加，9-12 h达高峰。MIF反义寡核苷酸转染巨噬细胞后，可见LPS刺激的MIF mRNA和MIF的表达均明显少于LPS刺激组、LPS刺激＋转染正义寡核苷酸组和 LPS刺激＋转染错义寡核苷酸组（P<0.05），与非LPS刺激组无显著差异。 结论： LPS可刺激小鼠巨噬细胞合成和表达MIF。MIF反义寡核苷酸可显著抑制巨噬细胞MIF的过度表达。     

硫代反义寡核苷酸在鸭体内外对鸭乙型肝炎病毒DNA复制的影响

目的：研究在转录起始区域设计硫代反义寡核苷酸抑制鸭乙型肝炎病毒DNA（DHBV DNA）复制的可行性。方法：设计合成分别基于DHBV PreS1、PreS2、S抗原启动基因的硫代反义寡核苷酸，应用Southern blot实验和cpm计数测定其对原代鸭肝细胞中及雏鸭中感染DHBV的DHBV DNA的作用。结果：在1.5μmol/L浓度下，体外抑制率分别是61．5％，69．3％和62．4％。选取PreS1抗原基因起始区段的硫代反义寡核苷酸进行整体动物实验。每只动物每天按10μg/g体重静脉注射一次，共给药6d。对动物肝脏进行取样分析表明，在此剂量下，对DHBV DNA的抑制率可达87.9%。结论：本实验所设计的针对转录起始区的硫代反义寡核苷酸在体内外对DHBV DNA复制均有明显抑制作用，说明了在这一区域设计硫代反义寡核苷酸的可行性。     

Survivin反义核酸对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的一个成员，具有强大的抗细胞凋亡功能，在几乎所有肿瘤组织中特异性表达，而在正常成年终末分化组织中低表达甚至不表达。本研究针对Survivin mRNA序列设计了反义寡核甘酸，RT—PCR检测表明，该序列反义寡核苷酸可明显降低细胞中survivin基因的mRNA含量；Western印迹显示Survivin蛋白水平也被降低。MTT比色实验法检测结果说明人Survivin反义寡核苷酸抑制SMMC-7721细胞增殖，抑制率为43％，远高于无义寡核苷酸组和空白对照组。反义寡核苷酸还显著增强SMMC-7721细胞对于抗肿瘤药高三尖杉酯碱的敏感性，TUNEL法检测结果显示，在较低高三尖杉酯碱浓度下，反义寡核苷酸转染细胞的凋亡率明显高于其它对照组。本研究结果提示，survivin表达的靶向抑制有望应用于肿瘤的辅助治疗之中。     

IL-1R相关激酶-1和磷脂酰肌醇3-激酶协同调控IL-1诱导的NF-κB活化

为研究IL 1R相关激酶 1(IRAK 1)和磷脂酰肌醇 3 激酶 (PI 3 激酶 )在IL 1诱导NF κB活化中的作用 ,本文采用Lipo fectin介导反义IRAK 1寡核苷酸或反义PI 3 激酶寡核苷酸转染HEpG2细胞后 ,用Western杂交检测IRAK 1和PI 3 激酶表达水平 ,以SandwichELISA法检测NF κB的活化。结果表明 ,①反义IRAK 1寡核苷酸和反义PI3 激酶寡核苷酸分别抑制IRAK 1和PI3 激酶表达 ;②反义IRAK 1寡核苷酸或反义PI 3 激酶寡核苷酸部分抑制NF κB活化 ;③与反义IRAK 1寡核苷酸或反义PI 3 激酶寡核苷酸单独转染HEpG2细胞相比 ,反义IRAK 1寡核苷酸和反义PI 3 激酶寡核苷酸共转染HEpG2细胞对NF κB的抑制作用明显增强。表明IRAK 1或PI3 激酶调控NF κB活化但不能完全激活NF κB ,IRAK 1和PI3 激酶在调控NF κB活化时协同作用。     

反义c-myc寡核苷酸抑制大鼠胸腺淋巴细胞增殖

目的:观察反义c-myc寡核苷酸对大鼠胸腺淋巴细胞增殖的抑制作用。方法:Ficoll密度梯度离心法分离大鼠胸腺淋巴细胞。利用Iipofectin将正义、反义及错配c-myc寡核苷酸导入大鼠胸腺淋巴细胞,-TdR掺入法及MTS法检测淋巴细胞增殖,RT-PCR检测c-mycmRNA的表达。结果:反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠胸腺淋巴细胞的增殖,但此抑制作用无浓度依赖性,反义c-myc寡核苷酸可降低胸腺淋巴细胞c-mycmRNA的表达。结论:反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠胸腺淋巴细胞的增殖。     

非病毒载体的研究现状

非病毒载体在基因表达质粒、反义寡核苷酸或反义表达质粒真核细胞的靶向转移中 ,有着病毒载体不可替代的作用 ,对这方面的研究人们投入了很大的精力 ,以期在基因治疗方面有所突破。本文综述了近年来非病毒载体的研究现状 ,分别阐明了质粒 DNA肌肉注射、脂质体载体、多聚阳离子载体、多肽导向载体以及嵌合载体 ,指出了非病毒载体亟需发展之处以及病毒载体与非病毒载体联合发展的必要性     

WT1反义寡核苷酸对卵巢癌细胞的抑制作用

目的观察WT1反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞株SKOV3的抑制作用。方法以人卵巢癌细胞株SKOV3为研究对象,应用ASODN技术,将WT1-ASODN转染到SKOV3细胞中,利用MTT法检测WT1寡核苷酸的最适作用浓度和作用时间及WT1反义寡核苷酸对SKOV3细胞的杀伤活性,流式细胞仪检测分析WT1反义寡核苷酸对SKOV3细胞周期和细胞凋亡的影响。结果脂质体介导的WT1反义寡核苷酸在体外能够明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,诱导细胞凋亡。结论 WT1反义寡核苷酸能诱导卵巢癌细胞凋亡,从而抑制卵巢癌细胞的增殖,可望成为一种卵巢癌临床有效的治疗方法。     

RNA-21为靶标的反义寡核苷酸对人白血病K562细胞的抑制作用

目的： 探讨以microRNA-21为靶标的反义寡核苷酸对白血病K562细胞的生长抑制效应及可能的作用机制。方法：依据与microRNA-21序列互补的原理,设计反义寡核苷酸,人工合成并全硫代修饰,在LipofectamineTM 2000介导下,转染K562细胞。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法筛选最佳作用浓度,台盼蓝拒染法检测其对细胞生长抑制的作用,姬姆萨染色观察细胞的形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期的变化。利用荧光定量PCR技术检测反义寡核苷酸作用后细胞内microRNA-21表达水平的改变。结果：MTT结果显示反义寡核苷酸有效抑制细胞生长,分别与随机组、空白对照组进行比较有显著差异（P<0.05）,反义寡核苷酸作用的最佳浓度是0.6 μmol/L。台盼蓝拒染法结果显示从转染K562细胞24 h开始,反义寡核苷酸组细胞生长明显受到抑制,抑制效应持续到72 h。姬姆萨染色显示反义寡核苷酸作用K562细胞24 h后,可在细胞中见凋亡小体。流式细胞仪检测结果显示反义寡核苷酸组出现明显的亚二倍体峰,细胞周期无发生明显变化。荧光定量PCR结果显示,反义寡核苷酸可有效抑制细胞内microRNA-21的表达水平。结论：以microRNA-21为靶标的反义寡核苷酸可有效抑制人白血病K562细胞的生长,并显著促进细胞凋亡。     

Survivin反义寡核苷酸联合化疗药物诱导儿童急性白血病细胞凋亡的实验研究

目的研究Survivin基因在儿童急性白血病细胞中的表达,Survivin反义寡核苷酸对儿童急性白血病细胞凋亡的影响,并探讨反义寡核苷酸与传统化疗药物对白血病的协同治疗作用。方法用PCR的方法检查儿童白血病细胞Sur-vivin表达,将Survivin基因反义寡核苷酸转染入白血病细胞,用TUNEL及流式细胞仪检查各组细胞的凋亡率。结果Sur-vivin基因在儿童急性白血病细胞中高表达,Survivin反义寡核苷酸及足叶乙甙均能够单独诱导白血病细胞凋亡,两者合用时细胞凋亡率更高。结论Survivin在儿童急性白血病细胞中高表达;Survivin反义寡核苷酸可诱导白血病细胞凋亡;Sur-vivin反义寡核苷酸可促进足叶乙甙诱导的儿童急性白血病细胞凋亡。     

bFGF mRNA、bFGF及FGFR1与神经胶质瘤细胞恶性行为的相关性

目的：研究碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、成纤维细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1）及bFGF mRNA三者与肿瘤细胞（神经胶质瘤细胞）恶性行为的相关性。方法：设计、合成bFGF反义寡核苷酸，转染SWO-38神经胶质瘤细胞，用原位杂交、免疫组化及图像分析、间接ELISA、细胞增殖MTT法、细胞集落形成等方法，分别检测转染前后bFGF、FGFR1、bFGF mRNA表达的改变，观察不同剂量bFGF反义寡核苷酸转染后细胞生长、集落形成的变化。结果：大部分细胞bFGF mRNA和细胞生长可被bFGF反义寡核苷酸抑制，细胞生长的抑制呈浓度依赖性，最高抑制率可达到48％，其抑制作用可被外源性bFGF完全逆转；反义寡核苷酸处理组大部分细胞表达的FGFR1减少、细胞分泌的bFGF明显减少，集落形成抑制率达35％．外源性bFGF的逆转作用为8％。正义组和阴性对照组均无以上的明显改变。结论：揭示了反义寡核苷酸可特异性抑制bFGF mRNA和肿瘤细胞的bFGF合成表达，但不能拮抗外源性bFGF结合bFGFR的生物学作用；FGFR1随肿瘤细胞SWO-38中bFGF表达水平的降低而下调。     

hTR反义寡核苷酸对不同鼻咽癌细胞生长分化的影响

目的 :研究端粒酶反义寡核苷酸对鼻咽癌细胞生长分化的影响。方法 :脂质体介导反义寡核苷酸转染鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞株 ,用细胞体外增殖实验、免疫组织化学S P法 ,观察细胞生长分化的变化情况。结果 :针对端粒酶RNA模板区的反义寡核苷酸可抑制CNE1和CNE2Z细胞的增殖并呈剂量和时间依赖性 ,反义寡核苷酸组细胞角蛋白表达高于其它处理组及空白对照组 (P <0 0 1) ,细胞形态趋向分化成熟。结论 :端粒酶反义寡核苷酸可抑制鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞的生长 ,并促进细胞分化。     

ICAM-1反义寡核苷酸对小鼠肾小管上皮细胞ICAM-1表达的影响

目的:探讨ICAM1反义寡核苷酸对小鼠肾小管上皮细胞表达ICAM1的影响,为利用ICAM1反义寡核苷酸类药物治疗肾小管间质病变奠定基础。方法:小鼠ICAM1反义寡核苷酸及其对照物参照文献合成并行全硫代磷酸化修饰。部分ICAM1反义寡核苷酸在其5′端作FITC荧光标记。将ICAM1反义寡核苷酸单独或脂质体转染试剂DOTAP混合后转染至培养的肾小管上皮细胞之中,转染成功后加入IL1β诱导细胞产生ICAM1。采用对照寡核苷酸及不含寡核苷酸的细胞转染液作为实验对照及空白对照。利用免疫组化染色的方法检测细胞ICAM1表达变化并提取细胞总RNA行逆转录PCR及Northern杂交观察ICAM1mRNA的表达的变化。结果:两个不同浓度的ICAM1反义寡核苷酸均可明显阻断IL1β诱导的肾小管上皮细胞ICAM1及ICAM1mRNA的表达;对照的寡核苷酸不能减少IL1β诱导的肾小管上皮细胞ICAM1及ICAM1mRNA的表达。结论:小鼠ICAM1反义寡核苷酸可明显抑制IL1β诱导的小鼠肾小管上皮细胞ICAM1及ICAM1mRNA的表达,提示ICAM1的反义寡核苷酸有可能应用于肾小管间质病变的实验治疗之中。