高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞中NO的变化及其对细胞外基质的影响

目的 探讨高糖培养的肾小球系膜细胞中一氧化氮（NO）合成的变化,以及上述变化对细胞外基质的影响.方法 体外培养大鼠肾小球系膜细胞,按干预方法分为正常组（NG组,5.56 mmol·L-1 DMEM）,高糖组（HG组,25 mmol·L-1 DMEM）、一氧化氮供体组（SNP组,5.56 mmol·L-1 DMEM＋100 μmol·L-1 SNP）、NO清除剂组（C-PTIO 组,25 mmol·L-1 DMEM＋200 μmol·L-1 C-PTIO）,以Griess比色法测定培养上清中NO水平;用ELISA法测定培养上清中Ⅳ型胶原、层黏蛋白含量.结果 高糖培养条件下上清中NO增多（P〈0.05）,Ⅳ型胶原、层黏蛋白含量增加（P〈0.01）,应用C-PTIO可显著降低上清中NO的含量,Ⅳ型胶原、层黏蛋白的含量也降低.结论 高糖可诱导大鼠肾小球系膜细胞产生NO,异常增多的NO又可导致系膜细胞中Ⅳ型胶原、层黏蛋白的积聚.     

雷帕霉素对高糖诱导的肾系膜细胞自噬抑制、氧化损伤和衰老的影响

摘要：目的探讨雷帕霉素及3-甲基腺嘌呤（3-MA）对高糖诱导的原代大鼠系膜细胞自噬、氧化损伤及衰老的影响。方法从大
鼠肾分离培养原代肾小球系膜细胞（GMCs）,分为正常对照组、高糖组、高糖+雷帕霉素（自噬增强剂）及高糖+3-甲基腺嘌呤（自
噬抑制剂）干预组。在细胞培养24 h、72 h及10 d时,Western blotting观测自噬标志物-自噬相关基因LC3及泛素结合蛋白p62/
SQSTMI的表达变化;硫代巴比妥酸法检测细胞脂质损伤产物-丙二醛（MDA）水平,2,4-二硝基苯肼（DNPH）比色法测定细胞蛋
白质损伤产物-羰基含量,通过进行衰老相关β-半乳糖苷酶活性（SA-β-gal）染色及衰老相关异染色质斑块（SAHF）分析检测细胞
的衰老程度。结果与对照组相比,细胞经高糖处理72 h和10 d后,自噬标志物LC3表达降低,p62/SQSTMI升高,MDA及羰基
含量上升（均P<0.05）;处理72 h细胞SA-β-gal染色阳性率增加（P<0.05）,细胞核异染色质斑块形成增加。高糖培养的细胞用雷
帕霉素干预72 h 和10 d 后,LC3 表达升高,p62/SQSTMI表达下降,MDA及蛋白质羰基含量均下降（均P<0.05）,72 h 后细胞
SA-β-gal染色阳性率下降（P<0.05）,细胞核异染色质斑块形成减少;高糖培养的细胞用3-MA干预72 h和10 d后,LC3表达下
降,p62/SQSTMI表达升高,MDA及蛋白质羰基含量升高（均P<0.05）,72 h细胞SA-β-gal染色阳性率上升（P<0.05）,细胞核斑块
形成增多。结论高糖可抑制系膜细胞自噬功能,促进系膜细胞氧化损伤,加速细胞衰老;雷帕霉素干预可减轻高糖对系膜细胞
自噬功能抑制,减少氧化损伤,延缓衰老;3-MA加重高糖对系膜细胞自噬功能的抑制,进一步加重细胞氧化损伤,加速衰老。
     

雷帕霉素对高糖诱导的肾系膜细胞自噬抑制、氧化损伤和衰老的影响

目的探讨雷帕霉素及3-甲基腺嘌呤(3-MA)对高糖诱导的原代大鼠系膜细胞自噬、氧化损伤及衰老的影响。方法从大鼠肾分离培养原代肾小球系膜细胞(GMCs),分为正常对照组、高糖组、高糖+雷帕霉素(自噬增强剂)及高糖+3-甲基腺嘌呤(自噬抑制剂)干预组。在细胞培养24 h、72 h及10 d时,Western blotting观测自噬标志物-自噬相关基因LC3及泛素结合蛋白p62/SQSTMI的表达变化;硫代巴比妥酸法检测细胞脂质损伤产物-丙二醛(MDA)水平,2,4-二硝基苯肼(DNPH)比色法测定细胞蛋白质损伤产物-羰基含量,通过进行衰老相关β-半乳糖苷酶活性(SA-β-gal)染色及衰老相关异染色质斑块(SAHF)分析检测细胞的衰老程度。结果与对照组相比,细胞经高糖处理72 h和10 d后,自噬标志物LC3表达降低,p62/SQSTMI升高,MDA及羰基含量上升(均P<0.05);处理72 h细胞SA-β-gal染色阳性率增加(P<0.05),细胞核异染色质斑块形成增加。高糖培养的细胞用雷帕霉素干预72 h和10 d后,LC3表达升高,p62/SQSTMI表达下降,MDA及蛋白质羰基含量均下降(均P<0.05),72 h后细胞SA-β-gal染色阳性率下降(P<0.05),细胞核异染色质斑块形成减少;高糖培养的细胞用3-MA干预72 h和10 d后,LC3表达下降,p62/SQSTMI表达升高,MDA及蛋白质羰基含量升高(均P<0.05),72 h细胞SA-β-gal染色阳性率上升(P<0.05),细胞核斑块形成增多。结论高糖可抑制系膜细胞自噬功能,促进系膜细胞氧化损伤,加速细胞衰老;雷帕霉素干预可减轻高糖对系膜细胞自噬功能抑制,减少氧化损伤,延缓衰老;3-MA加重高糖对系膜细胞自噬功能的抑制,进一步加重细胞氧化损伤,加速衰老。     

缓激肽对高糖环境下肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质分泌的影响

目的观察缓激肽(BK)对高糖浓度下肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质分泌的影响。方法采用体外培养的大鼠肾小球系膜细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测系膜细胞增殖,酶联免疫(ELISA)法测细胞外基质分泌。结果高糖(30.0 mmol/L)环境可促进肾小球系膜细胞增殖和Ⅳ型胶原的分泌(P<0.05)。BK、ACEI(贝那普利)均抑制高糖环境下肾小球系膜细胞的增殖和Ⅳ型胶原的分泌(P<0.05)。结论高糖可促使肾小球系膜细胞增殖和Ⅳ型胶原的分泌。ACEI抑制肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质分泌的作用机制可能与减少BK的降解有关。     

葡萄籽提取物对高糖诱导系膜细胞肥大的抑制作用

目的 探讨葡萄籽提取物(grape seed extract,GSE)对高糖诱导系膜细胞肥大的抑制作用.方法 将常规培养的大鼠系膜细胞分为正常糖组、高糖组和高糖+GSE(1.0、5.0、10.0 μmol/L)组.检测各组细胞总蛋白/细胞数比值,MTT法检测各组细胞增殖情况,流式细胞仪检测各组细胞周期变化,Western blot法检测各组细胞P21、P27蛋白表达.结果 (1)经高糖(30 mmol/L D-葡萄糖)处理48 h后,系膜细胞出现明显的细胞肥大变化,细胞总蛋白/细胞数比值增大,细胞增殖能力下降,G0/G1期细胞百分比增多,P21、P27蛋白质表达上调;(2)经GSE干预后,与高糖组比较,系膜细胞的细胞总蛋白/细胞数比值降低,细胞增殖能力增大,G0/G1期细胞百分比减少,P21、P27蛋白质表达下调(P<0.05).结论 GSE能够通过抑制P21、P27的表达,抑制高糖诱导的系膜细胞肥大.     

牛磺酸对系膜细胞增生及细胞外基质分泌的影响

目的　观察牛磺酸对系膜细胞增生及细胞外基质分泌的影响 ,以探讨其作用的可能机制。方法　用MTT法检测系膜细胞增生 ,流式细胞仪检测细胞周期 ,ELISA检测细胞外基质Ⅳ型胶原的生成。结果　牛磺酸可剂量依赖性地抑制系膜细胞增生 ,并影响细胞周期 ,使G0 /G1期细胞增多 ,S期细胞减少 ,并可明显减少Ⅳ型胶原的分泌 (P <0 .0 1)。结论　牛磺酸可显著抑制系膜细胞增生 ,使细胞周期阻滞于G0 ～G1期 ,该作用可能与其抑制细胞外基质Ⅳ型胶原的分泌有关     

紫草素对人胎肾小球系膜细胞增殖、凋亡及细胞外基质的影响

目的：研究紫草素对人胎肾小球系膜细胞(MC)增殖、凋亡及细胞外基质的影响。方法：采用人胎肾细胞培养法、MTT法、流式细胞仪及免疫组化的方法。结果：紫草素0．05、0．10、0．50及1，00mmol／L浓度对培养24、48、72h人MC有明显抑制作用；紫草素明显抑制高糖诱发的人MC细胞凋亡；紫草素0．05、0．10、0．50μg/ml显著抑制系膜基质层粘连蛋白(LN)、纤维连接蛋白(FN)及胶原Ⅳ(CoⅣ)的生成。结论：紫草素具抑制人MC增殖、细胞外基质生成及细胞凋亡作用。     

高糖环境及雷帕霉素干预对肾小球足细胞Ⅳ型胶原和MMP-9表达的影响

目的探讨高糖培养环境及雷帕霉素干预对肾小球足细胞Ⅳ型胶原和基质金属蛋白酶9（MMP-9）表达的影响。方法体外培养的小鼠肾小球足细胞分为空白对照组、高渗对照组、高糖组和高糖＋雷帕霉素干预组。Real-time PCR和Western blotting检测各组肾小球足细胞Ⅳ型胶原α3链（COL4A3）、α5链（COL4A5）mRNA及MMP-9mRNA和蛋白的表达;ELISA法检测细胞培养上清液中Ⅳ型胶原的含量。结果与对照组比较,高糖组足细胞COL4A3、COL4A5mRNA表达及培养上清液中Ⅳ型胶原含量均升高（P〈0.05）,而足细胞MMP-9mRNA和蛋白表达均降低（P〈0.05）。与高糖组比较,雷帕霉素干预组足细胞COL4A3、COL4A5mRNA表达及培养上清液中Ⅳ型胶原含量均降低（P〈0.05）,足细胞MMP-9mRNA和蛋白表达均升高（P〈0.05）。结论雷帕霉素对高糖环境中足细胞Ⅳ型胶原和MMP-9表达异常具有逆转作用。     

高糖环境及雷帕霉素干预对肾小球足细胞Ⅳ型胶原和MMP-9表达的影响

目的 探讨高糖培养环境及雷帕霉素干预对肾小球足细胞Ⅳ型胶原和基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达的影响.方法 体外培养的小鼠肾小球足细胞分为空白对照组、高渗对照组、高糖组和高糖+雷帕霉素干预组.Real-time PCR和Western blotting检测各组肾小球足细胞Ⅳ型胶原α3链(COL4A3)、α5链(COL4A5)mRNA及MMP-9 mRNA和蛋白的表达;ELISA法检测细胞培养上清液中Ⅳ型胶原的含量.结果 与对照组比较,高糖组足细胞COL4A3、COL4A5 mRNA表达及培养上清液中Ⅳ型胶原含量均升高(P<0.05),而足细胞MMP-9 mRNA和蛋白表达均降低(P<0.05).与高糖组比较,雷帕霉素干预组足细胞COL4A3、COL4A5 mRNA表达及培养上清液中Ⅳ型胶原含量均降低(P<0.05),足细胞MMP-9 mRNA和蛋白表达均升高(P<0.05).结论 雷帕霉素对高糖环境中足细胞Ⅳ型胶原和MMP-9表达异常具有逆转作用.     

LEF 对肾小球系膜细胞增殖及分泌细胞外基质的影响

目的: 探讨来氟米特对转化生长因子－β1刺激的大鼠肾小球系膜细胞( GMCs) 增殖及细胞外基质
( ECM) 分泌的影响。方法: 体外培养大鼠肾小球系膜细胞,分正常对照组,TGF－β1( 5 ng /mL) 刺激组,TGF－β1 +
LEF( LEF 浓度分别为5μmol /L、25μmol /L、50μmol /L、100μmol /L) 组,培养24h、48h 和72h 后,MTT 法观察各组
肾小球系膜细胞在不同时间点的增殖情况; ELISA 法测定各组培养细胞上清液中纤连蛋白的含量。结果: ( 1) 与
对照组相比,TGF－β1可刺激系膜细胞增殖,不同浓度的LEF 均可以抑制TGF－β1刺激的系膜细胞增殖( P＜0．05) ,48h 后抑制作
用稳定。( 2) TGF－β1刺激组细胞上清液中纤连蛋白含量明显高于对照组( P＜0．05) ,不同浓度的LEF 组纤连蛋白含量明显低于TGF－β1
组( P＜0．05) 。结论: 来氟米特可以抑制TGF－β1刺激的肾小球系膜细胞的增殖,减少细胞外基质的分泌,为其治疗慢性肾脏病提供理论依据。     

Acortatarin A inhibits high glucose-induced extracellular matrix production in mesangial cells

Background Diabetic nephropathy (DN) is the leading cause of end-stage renal disease.Various treatment regimens and combinations of therapies provide only partial renoprotection.Therefore new approache...     

肌肽对高糖环境下肾小球系膜细胞增殖的影响及机制

目的探讨肌肽(carnosine)对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞(rat mesangial cells,RMCs)增殖的影响及作用机制。方法以RMCs为研究对象,分别采用MTT法和BrdU-ELISA法观察肌肽对高糖诱导的RMCs增殖的影响;乳酸脱氢酶(LDH)法检测肌肽对细胞的毒性作用;酶生化法测定丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)含量及细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性等。结果肌肽可显著抑制高糖诱导的RMCs增殖,在5～30 mmol/L范围内呈一定的浓度依赖效应,且与其抗氧化作用密切相关。结论肌肽通过抗氧化作用抑制高糖诱导的RMCs增殖,且有浓度依赖趋势。     

氟伐他汀对肾小球系膜细胞产生细胞外基质的影响

[目的]观察不同葡萄糖浓度环境、氟伐他汀对人系膜细胞表达FN、IV型胶原作用。[方法]培养人肾小球系膜细胞,分为正常葡萄糖组、高葡萄糖组及加氟伐他汀组,培养244、8 h收集细胞上清液,用酶联免疫法检测FN、IV型胶原。[结果]在高糖组24、48 h FN分别是(1.552±0.546)和(2.547 0±0.968)ng/mL,明显高于正常糖组244、8 h,FN:(0.777±0.076)和(1.180±0.091)ng/mL(P<0.01);在高糖组244、8 h IV型胶原分别是(64.577±5.543)和(80.140±6.605)ng/mL,明显高于正常糖组24、48 h IV型胶原:(42.468±5.615)和(46.368±5.714)ng/mL(P<0.01)。氟伐他汀可减少高糖浓度下细胞上清液中FN、Ⅳ型胶原的表达水平。在高糖组与氟伐他汀(1μmol/L,10μmol/L)作用24、48 h FN和IV型胶原分别是(0.955±0.102)(、0.858±0.081)ng/mL,(0.652±0.078)(、0.822±0.257)ng/mL(P<0.01)、(34.908±4.283)、(32.163±2.220)、(28.260±4.287)(、23.233±7.284)ng/mL(P<0.01)。[结论]氟伐他汀可抑制高糖刺激的系膜细胞表达FN、Ⅳ型胶原。     

非诺贝特对高糖培养肾小球系膜细胞胞外基质产生及降解影响

目的：探讨非诺贝特对糖尿病肾病的保护机制。方法：大鼠肾小球系膜细胞分别培养在正常糖浓度（5.5 mmol.L-1,对照组）、高糖浓度（25 mmol.L-1,高糖组）及25 mmol.L-1葡萄糖＋非诺贝特100μmol.L-1（非诺贝特组）。CCK-8测定系膜细胞增殖;ELISA法检测培养上清液Ⅳ型胶原（Col-Ⅳ）、纤维连接蛋白（FN）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）;明胶酶谱法检测培养上清基质金属蛋白酶-2,9（MMP-2,9）的活性。结果：高糖组系膜细胞较对照组出现增殖增加,合成基质蛋白Col-Ⅳ,FN增多,MMP-2及MMP-9活性下降,TIMP-1含量增加,TGF-β1分泌增加。与高糖组比较非诺贝特干预后能完全或部分逆转上述变化。结论：非诺贝特能抑制高糖培养的系膜细胞增殖,减少胞外基质合成,增加胞外基质的降解。     

低分子肝素对肾小球系膜细胞产生细胞外基质的影响

[目的]了解不同葡萄糖浓度环境下,低分子肝素对人系膜细胞表达纤维连接蛋白(FN)和IV型胶原作用。[方法]培养人肾小球系膜细胞,分为正常葡萄糖组、高葡萄糖组及加低分子肝素组,培养24、48 h收集细胞上清液,用酶联免疫法检测FN和IV型胶原。[结果]高糖组24和48 h FN分别为(1.552±0.546)ng/mL和(2.547±0.968)ng/mL明显高于正常糖组(0.777±0.076)ng/mL和(1.180±0.091)ng/mL(P<0.01);IV型胶原分别为(64.577±5.543)ng/mL和(80.140±6.605)ng/mL,明显高于正常糖组(42.468±5.615)ng/mL和(46.368±5.714)ng/mL(P<0.01)。在低分子肝素1 ng/mL的作用下,高糖组的FN24 h及FN48 h分别降低为(1.070±0.349)ng/mL及(1.918±0.074)ng/mL,IV型胶原24 h及IV型胶原48 h分别降低至(41.993±7.470)ng/mL及(40.490±4.377)ng/mL。低分子肝素提高至10 ng/mL时,高糖组的FN24 h及FN48 ...     

高糖对肾小球系膜细胞Smurf2表达的影响

目的观察不同浓度高糖刺激后大鼠肾小球系膜细胞胞内Smad泛素调节因子2(Smurf2)的表达,探讨泛素化降解在糖尿病肾病中的作用。方法将体外培养的大鼠肾系膜细胞分别设正常对照组(葡萄糖浓度5.6 mmol/L)、20 mmol/L高糖组、30 mmol/L高糖组、甘露醇组。分别用real ti me quantitative PCR法和细胞免疫荧光染色法及激光共聚焦显微镜检测各组细胞Smurf2的mRNA和蛋白的表达。结果(1)正常对照组系膜细胞Smurf2的mRNA和蛋白表达较弱。(2)高糖组Smurf2的mRNA和蛋白表达较正常对照组增强(P<0.05),呈浓度依赖性。结论高糖可诱导肾系膜细胞Smurf2表达增强。提示泛素-蛋白酶体途径可能参与了糖尿病肾病的病理进程。     

螺内酯对高糖诱导的肾小球系膜细胞氧化应激的影响

目的:观察螺内酯对高糖诱导的肾小球系膜细胞氧化应激的影响,并且探讨该作用是否与MAPKs家族信号通路相关?方法:采用高糖和(或)螺内酯处理人肾小球系膜细胞株(HMC)后,DHE荧光染色检测细胞内活性氧(ROS)水平,NBT试剂盒法检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性,Western blot法检测MAPKs家族ERK?JNK?p38MAPK的磷酸化及总蛋白水平?结果:DHE染色结果显示,高糖可明显增加HMC内ROS含量,而给予螺内酯干预处理后,细胞内ROS水平明显降低,与高糖刺激组相比,螺内酯干预组细胞内SOD活性明显增加(P < 0.05);Western blot结果表明,高糖可明显增加HMC细胞内ERK及p38MAPK的磷酸化水平,给予螺内酯处理后可逆转高糖的上述作用(P < 0.05),而各组之间磷酸化JNK及总ERK?p38MAPK?JNK蛋白水平无明显变化?结论:螺内酯可能通过下调MAPK家族信号蛋白的磷酸化水平,降低细胞内ROS含量,增加SOD活性,拮抗由高糖所引起的氧化应激,从而起到保护肾小球系膜细胞,延缓肾小球硬化的作用?     

Antisense Smad2 inhibits high glucose-stimulated production of extracellular matrix in cultured rat glomerular mesangial cells

Transforminggrowthfactor-β1(TGF-β1)is amultifunctionalpolypeptidethatregulatesanum-berofcellularprocesses,includingcellprolifera-tion,differentiation,apoptosis,migration,matrix synthesis,andtheimmuneresponse[1,2].Inchron-icrenaldiseases,TGF-β1isakeymediatorofex-tracellularmatrix(ECM)accumulation[3].Oneof thetargetrenalcellsforTGF-β1isglomerular mesangialcellsthatarecapableofproducingcom-ponentsofECM,suchascollagens,lamininand fibronectin[4,5].Recentstudiesindicatedthatinhi-bitionofT…