玻璃化技术冻存胚胎的基础与研究现状

在体外受精-胚胎移植(IVF-EF)治疗不孕症中,胚胎冻存技术使得剩余胚胎的保存成为可能,增加了治疗周期的胚胎移植次数和累积妊娠率。胚胎的冻存方法主要有4种:慢速冷却、慢速复温法;慢速冷却、快速复温法;超快速冻结法和玻璃化技术。目前临床多采用第2种方法,但是,玻璃化技术具有避免细胞外冰形成对胚胎的化学、物理损伤,操作简便,费时少,无需贵重的程序式降温仪等优点,而且一些动物实验表明,该方法较常规的慢速冷却、快速复温法获得更高的胚胎存活率。本文就玻璃化技术的方法设计、影响因素和研究现状进行综述。     

玻璃化冷冻卵母细胞及卵巢组织研究进展

玻璃化冷冻技术近年已广泛应用于生殖领域,尤其是在女性生育力的储备方面展示其特有的优势。目前胚胎玻璃化冷冻已较成熟,并应用于临床。首次卵母细胞玻璃化冷冻的成功以及实验动物卵巢组织成功移植并获得分娩给研究带来无限希望,但目前仍处于实验阶段,研究者企图从不同角度解决难题。卵母细胞冷冻后,细胞结构的易损伤性造成的低复苏率,以及对卵巢组织玻璃化冷冻的可行性探索,对生殖领域提出新挑战。由于卵巢组织冻存与卵母细胞的冻存有着密不可分的联系,就两者国内外新进展做综述。     

玻璃化冷冻卵母细胞及卵巢组织研究进展

玻璃化冷冻技术近年已广泛应用于生殖领域,尤其是在女性生育力的储备方面展示其特有的优势.目前胚胎玻璃化冷冻已较成熟,并应用于临床.首次卵母细胞玻璃化冷冻的成功以及实验动物卵巢组织成功移植并获得分娩给研究带来无限希望,但目前仍处于实验阶段,研究者企图从不同角度解决难题.卵母细胞冷冻后,细胞结构的易损伤性造成的低复苏率.以及对卵巢组织玻璃化冷冻的可行性探索,对生殖领域提出新挑战.由于卵巢组织冻存与卵母细胞的冻存有着密不可分的联系,就两者国内外新进展做综述.     

玻璃化技术冻存胚胎的基础与研究现状

在体外受精－胚胎移植（ＩＶＦ－ＥＦ）治疗不孕症中，胚胎冻存技术使得剩余胚胎的保存成为可能，增加了治疗周期的胚胎移植次数和累积妊娠率，胚胎的冻存方法主要有４种：慢速冷却，快速复温法，超快速冻地和玻璃化技术，目前临床多采用第２种方法，但是，玻璃化技术具有避免细胞外冰形成对胚胎的化学，物理损伤，操作简便，费时少，无需贵重的程序式降温仪等优点，而且一些动物实验表明，该方法较常规的慢速冷却，快速复温法获得更     

不同冷冻速率冻存C6/36细胞复苏效果比较

[目的]选择C6/36细胞最适宜冷冻速率。[方法]用4种冷冻速率冻存处于对数生长期的C6/36细胞,运用MTT法测定细胞活性,计算冷冻存活率,并同步观察复苏细胞形态。[结果]A法冷冻存活率(92.9%±1.5%)高于B法、C法和D法(71.6%±1.8%、69.9%±2.1%和35.2%±1.2%)。光镜观察,A法冻存后细胞,复苏即时镜下90%以上的细胞呈现透明,类圆形饱满良好的活细胞形态;而B法、C法和D法冻存的细胞都有不同程度的形态性破坏,可见细胞碎片。[结论]A法是C6/36细胞的最适宜冷冻速率,冷冻速率的改变对其冷冻存活率的影响很大(P<0.01)。     

不同冷冻方案对人早期胚胎发育潜能的影响

目的:比较开放式、封闭式玻璃化冷冻技术及程序化慢速冷冻法对辅助生殖技术人早期胚胎冷冻复苏的效果.方法:回顾性分析622例胚胎冷冻复苏资料,将体外受精-胚胎移植(ⅣF-ET)患者第3天需要冷冻的胚胎,分别采用开放式、封闭式麦管玻璃化法及程序化慢速冷冻法冷冻,比较3组胚胎复苏率、空泡出现率、胚胎完整率、植入率、临床妊娠率、周期取消率、胚胎丢失率及流产率.结果:开放式冻存组共复苏280个周期、627个胚胎,胚胎复苏率、胚胎完整率、植入率和临床妊娠率分别为97.13％、94.89％、28.90％、52.61％,与程序化冷冻组(复苏165个周期、477个胚胎)胚胎复苏率(73.79％)、胚胎完整率(70.02％)、植入率(16.75％)和临床妊娠率(35.44％)相比差异有统计学意义(P＜0.05),与封闭式冻存组(复苏177个周期、400个胚胎)相比差异均无统计学意义(P＞0.05),3种冷冻组空泡出现率、周期取消率、胚胎丢失率及流产率差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:两种玻璃化冷冻法能获得同样的冷冻效率,且均优于程序化冷冻法;封闭式麦管玻璃化法能更好地保存胚胎复苏后的发育潜能,是冻存人早期胚胎较为理想的方法.     

-70℃超低温冻存细胞的实验研究

[目的]探索-70℃超低温条件冻存细胞的可行方法。[方法]用-70℃超低温冰箱冻存对数生长期的C6／36、BHK-21、Vero和MDCK细胞，冻存30、60和90d后，37℃水浴复苏，用MTT法测定细胞活性，计算冷冻存活率；同时观察复苏细胞形态，并与液氮冻存方法同步比较。[结果]-70℃冻存后复苏细胞均可获得90％以上的存活率，与液氮冻存细胞的复苏效果类似。光镜下显示，冻存细胞均可在拟定的冻存期内成功复苏。复苏即时镜下90％以上的细胞呈现良好的活细胞形态悬浮在培养基中。[结论]-70℃超低温冰箱冻存细胞的方法可行，尤其适用于基层或液氮来源困难地区开展细胞培养研究。     

卵巢皮质玻璃化冷冻保存及移植的损伤因素

卵巢组织冻存和移植在技术上可行,有效性也随着技术发展而提高,可用于女性生育力保存,尤其是青春期前放化疗的患癌女性的生育能力保存。玻璃化冷冻被认为是目前最有潜力的卵巢组织冻存方法之一,但其安全性和有效性尚需进一步验证。冷冻损伤及移植缺血再灌注损伤是卵巢冻存和移植中需要克服的难题,如何尽可能有效地保存卵泡是难点及重点。从冷冻保护剂、卵巢组织大小、冷冻载体、抗氧化剂、促进新血管形成和激素6个方面对目前已有的玻璃化冷冻及移植条件、效果等进行了阐述,有益于女性生育力保存的项目推进。     

影响冻融胚胎存活的相关因素分析

目的:探讨年龄、受精方式、胚胎冷冻方法及胚胎冻存时间对冻融胚胎存活的影响.方法:回顾分析冻融胚胎移植(FET) 1255个周期,根据年龄、受精方式、胚胎冷冻方法及胚胎冻存时间进行分组,比较各组的冻融胚胎存活率、完全存活率及临床妊娠率.结果:玻璃化冷冻组冻融胚胎存活率、完全胚胎存活率及临床妊娠率分别为93.4％、95.9％、48.8％,程序化冷冻组冻融胚胎存活率、完全胚胎存活率及临床妊娠率分别为81.2％、54.9％、30.1％,两组差异有统计学意义(P＜0.05);年龄、受精方式、胚胎冻存时间对冻融胚胎存活率及完全胚胎存活率无明显影响(P＞0.05).结论:玻璃化冷冻胚胎技术比程序化冷冻胚胎技术能获得更高的冻融胚胎存活率、完全胚胎存活率及临床妊娠率,3年内的冻融胚胎可不考虑冻存时间对胚胎存活的影响.     

OPS法玻璃化冷冻未成熟卵母细胞的效果观察

目的:探讨OPS(open pu lled straw,开放式拉细麦管)法玻璃化冷冻技术冻存未成熟卵母细胞的效果。方法:小鼠GV期卵母细胞用OPS法玻璃化冷冻复苏后行体外成熟培养(in-vitro m aturation,IVM)或直接行IVM,所获成熟卵行体外受精(IVF)和胚胎的体外培养(IVC)。以体内成熟卵行IVF/IVC作为in-vivo对照组。结果:GV期卵冻融后65.11%存活,IVM后成熟率为52.86%,其成熟率显著低于IVM对照组。冻融卵成熟后受精、卵裂率(33.78%、76.00%)低于IVM对照组和in-vivo对照组,培养后未见囊胚形成。结论:OPS法玻璃化冷冻技术可有效冻存GV期卵母细胞,复苏后可发育成熟,但卵的受精和继续发育能力欠佳。     

卵丘细胞在未成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存中的作用

卵母细胞冷冻技术是生殖医学的一大热点,未成熟卵母细胞冻存是保存女性生育力的重要方法,具有广阔的临床应用前景。卵丘细胞与卵母细胞共处同一微环境,二者通过缝隙连接进行复杂的双相调控和物质交换,目前已知卵丘细胞在人类未成熟卵母细胞体外成熟过程中具有重要作用,但在冷冻过程中的作用尚无定论。随着玻璃化冷冻技术的发展,卵丘细胞对未成熟卵母细胞冷冻的影响有了较多的研究,卵丘细胞可减缓冷冻剂渗透速率,从而避免细胞渗透压的突变对未成熟卵母细胞的损伤,提高细胞冻融后存活率和受精率并支持未成熟卵母细胞的体外成熟。就卵丘细胞在人类未成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存中的作用进行综述,为癌症化疗、延迟生育年龄等需进行的未成熟卵母细胞冷冻提供重要的理论基础及可靠的实验依据。     

家兔卵巢组织异体皮下移植的形态与功能研究

目的:研究家兔卵巢组织玻璃化冷冻、异体皮下移植后激素水平和卵泡的生长发育情况。方法:将36只裸鼠随机分为4组,分别为正常对照组、新鲜移植组、冻存移植组、去势组。将新鲜和冻融卵巢组织分别异体异位移植到裸鼠颈部皮下,于移植术后第5天开始观察裸鼠的动情周期,术后35天左右动情期测鼠血清雌激素水平,并对各组子宫进行湿重及组织形态学观察比较。结果:新鲜及冻存卵巢组织移植后均可观察到存活组织块,移植卵巢内可见不同阶段的发育卵泡,并可见间质腺和黄体。两种移植组于动情期雌激素水平与正常对照组差异无统计学意义(P0.05),均明显高于去势组。结论:玻璃化法冷冻可以有效保存卵巢组织的结构和功能。冻存复苏后与新鲜卵巢皮质组织具有相同的生理活性。冻存卵巢皮质异体异位无血管皮下移植后能够存活、生长发育,并维持生殖内分泌功能。     

不同冷冻速率在Vero细胞冻存复苏中的应用效果分析

目的：为了选择Veto细胞最佳的冷冻速率。方法：对Vero细胞应用不同的速率进行冻存，观察复苏效果。结果：采用一步直接法可获得90％以上的复活率。结论：不同的细胞具有不同的特性，其在冷冻过程中的生理变化及对保护剂的要求也不同，并具有不同的最适冷冻速率。     

卵巢组织冻存方案的优化研究进展

随着肿瘤治疗技术的提高,保护女性生育力逐渐引起了人们的关注。胚胎冷冻技术在各大生殖中心的运用使女性患者一定程度获益,但胚胎冷冻应用的局限性使卵巢组织冷冻成为研究的热点,而冷冻方法的研究成为第一难题。目前针对卵巢组织块的冷冻方法主要包括慢速程序化冷冻和玻璃化冷冻。相比卵巢组织块的冷冻方法,定向冷冻的应用在整个卵巢冷冻中更有优势。定向冷冻能使整个卵巢的冷却速度保持一致,从而降低整个卵巢在冷冻过程中的损伤。不同的冷冻方法对卵巢组织冷冻和(或)解冻移植后功能恢复的影响程度不同,因此寻找合适的冷冻方法对保证最佳冻存效率有着重要的意义。综述近期优化的卵巢组织冻存方案,为临床应用提供参考。     

卵子玻璃化冷冻在体外受精胚胎移植周期中的临床应用

目的:探讨卵子玻璃化冷冻保存的可行性,更好提高卵子复苏率、受精率,提高卵子冻存患者的妊娠率。方法:在河北医科大学第二医院生殖医学门诊行体外受精胚胎移植(IVF-ET)患者中,由于取卵日男方取精失败行卵子冻存。于2011年2月～2012年8月共行5例患者卵子冻存并复苏。结果:冷冻MII卵子55枚,复苏率94.5%(52/55),受精率92.3%(48/52),卵裂率95.8%(46/48),移植胚胎11枚,临床妊娠3例,冷冻保存胚胎22枚。结论:卵子玻璃化冷冻是可行的,可应用于取卵日取精困难的患者。     

Cryoloop和CPS超速玻璃化冷冻人三原核胚胎效果比较

目的:比较冷冻环(Cryoloop)和闭合型拉细麦管(CPS)超速玻璃化冷冻方法冻存人早期卵裂期胚胎的效果差异,以期建立1种有效的超速玻璃化冷冻方法。方法:将人三原核孕卵发育形成的126个6-10细胞胚胎随机分为3组:对照组30个、Cryoloop组36个和CPS组60个。通过形态学观察,比较胚胎复苏后存活率;经罗丹明123染色,激光扫描共聚焦显微镜摄片分析,测定复苏后存活胚胎线粒体跨膜电位(△Ψm)。结果:Cryoloop组复苏后胚胎存活率达100%,显著高于CPS组(P<0.05);Cryoloop组△Ψm显著高于CPS组(P<0.05),而与未冷冻对照组相比,无明显差异(P>0.05)。结论:Cryoloop超速玻璃化冷冻法获得了更高的胚胎存活率和胚胎活力,该方法更适于冷冻人早期卵裂期胚胎。     

玻璃化冷冻保存人类早期胚胎的临床初步应用

目的：探讨玻璃化冷冻保存人类早期胚胎的临床应用效果。方法：对22例患者应用玻璃化冷冻保存技术冻存的82枚4～16细胞期的早期胚胎进行了解冻和移植。结果：82枚冷冻胚胎经解冻,存活65枚,存活胚胎均予移植,种植10枚,种植率为15.38%（10/65）,共进行了25个冷冻胚胎移植周期,获得8例妊娠,妊娠率32%（8/25）。结论：玻璃化冷冻保存技术是一种冷冻保存人类早期胚胎的有效方法,临床应用效果良好。     

不同载体和冷冻保护剂用于人胚胎玻璃化冷冻的初步研究

目的：比较分析冷冻环、自制叶片、冰珠3种载体,以及5．5mol／LEG、15％PROH＋15％EG2种冷冻保护剂用于人胚胎玻璃化冷冻的效果。方法：①选择131个6-10细胞,Ⅰ-Ⅱ级胚胎,按载体不同随机分为3组,将胚胎解冻后用于移植,比较3组的复苏率、植入率、临床妊娠率;②部分患者成功妊娠分娩后,自愿放弃剩余冻存胚胎,选择6-10细胞,Ⅰ-Ⅱ级,以叶片为载体冷冻的胚胎52个,按照冷冻溶液的不同分为2组,解冻后将胚胎继续培养3天,比较2组的复苏率和囊胚形成率。结果：①冰珠组的复苏率显著低于冷冻环和自制叶片组,3个组的植入率、临床妊娠率无明显差异;②15％PROH＋15％EG冻存的胚胎解冻后复苏率和囊胚形成率显著高于5．5mol/L EG。结论：冷冻环和自制叶片是较为理想的冷冻载体,二者用于玻璃化冷冻效果相近,自制叶片具有成本低的优点;联用15％PROH＋15％EG能降低冷冻保护剂对胚胎的毒性,玻璃化冷冻效果好于5．5mol／LEG。     

以支持细胞为饲养层培养冻存后大鼠精原干细胞研究

目的：研究冻存的精原干细胞体外分离培养的生物学特性,为今后冻存精原干细胞的批量培养和长期利用提供依据。方法：取7～8d的sD雄性大鼠,分离睾丸组织,用两步酶消化法和差速时间贴壁法,分离精原干细胞和支持细胞。以二甲基亚砜（DMSO）作冷冻保护液,将分离到的精原干细胞放置于液氮中冻存;利用体外培养体系,进行支持细胞的培养和饲养层的制备;然后将复苏的精原干细胞接种到支持细胞饲养层上培养,并利用碱性磷酸酶鉴定精原干细胞。结果：用两步酶消化法和差速贴壁法能分离到纯度较高的精原干细胞和支持细胞,冻存的SSCs解冻后能在支持细胞饲养层上贴壁、生长、增殖,碱性磷酸酶活性鉴定呈阳性。结论：冻存后精原干细胞在体外支持细胞饲养层上呈集落样生长,并能长时间维持细胞集落形态及数目,可为体外研究药物或毒物干扰精原干细胞提供细胞模型。     

体外人原代肝细胞分离与培养及冻存研究

目的通过对人原代肝细胞分离、培养、冻存,研究冻存前后肝细胞的形态功能,以期为生物人工肝、肝细胞移植的研究及应用提供细胞来源。方法采用多点穿刺两步灌流法分离原代肝细胞,体外预培养24 h,经程序降温盒冷冻法短期冻存。复苏后对细胞的活力、形态、微生物污染及相关功能基因表达进行测定。结果复苏后,肝细胞存活率达到(71.6±2.2)%,相较新鲜分离的肝细胞,存活率达到90%以上,体外培养时间长达12天,无微生物污染,复苏前后白蛋白(ALB)、谷氨酰胺合成酶(GS)、氨甲酰磷酸合酶1(CPS1)以及细胞色素酶P450 3A4(CYP3A4)功能基因表达无统计学差异(P>0.05)。结论初步建立了人原代肝细胞分离、培养、冻存方法,为生物人工肝及相关肝细胞治疗奠定了研究基础。