基因扩增法检测肺炎衣原体DNA的研究

采用聚合酶链式反应（PCR），建立检测肺炎衣原体DNA的实验诊断方法。结果显示：采用肺炎衣原体PstI编码区的两对特异性引物（HL－1-HR－1和HM－1-HR-1）进行扩增，两株肺炎在原体（TW－183和CM－1）均可见437bP和229bP的特异性扩增带，而沙眼衣裳原体和鹦鹉热在原体扩增结果为阴性。检测敏感性为100fg左右。该技术为肺炎衣原体的早期诊断和流行病学调查提供了一种快速、敏感、特异的新方法。     

儿童嗜肺军团菌肺炎30例临床分析

目的了解儿童嗜肺军团菌肺炎的临床特点、诊断及预后。方法回顾分析我院2010年1月至2011年12月经酶联免疫吸附法（ELISA）检测嗜肺军团菌血清抗体IgM诊断明确的30例儿童嗜肺军团菌肺炎的临床特点、实验室检查、影像学改变及预后。结果①临床特点：发热、干咳、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、肌肉酸痛。29例（96．7％）血C反应蛋白（CRP）〉8mg／L,9例（30．0％）血白细胞〉12×109／L。部分病例有低钠血症。心肌酶谱、肾功能等均正常。②30例无重症肺炎。③胸部影像学改变,大片高密度阴影或云雾状阴影;胸腔积液3例;病变以两肺下叶多见。④30例经阿奇霉素或红霉素治疗痊愈,咳嗽持续时间较长。结论儿童嗜肺军团菌肺炎无基础疾病,为普通型肺炎,临床症状轻,病死率低。儿童肺炎肺外表现明显时考虑嗜肺军团菌肺炎可能。儿童慢性咳嗽可能与嗜肺军团菌感染有关。     

小儿肺炎支原体、嗜肺军团菌并肝损伤15例分析

目的对肺炎支原体、嗜肺军团菌双重感染合并肝脏损伤的15例急性下呼吸道感染（AL-RI）患儿进行临床特点分析。方法对2004年1月至2008年3月15例临床诊断急性下呼吸道感染（ALRI）患儿,经实验室诊断确诊肺炎支原体、嗜肺军团菌双重感染合并肝损伤的15例儿童进行临床分析。结果 ALT均升高（〈100U/L11例,〉100U/L4例）;AST升高13例（〈100U/L9例,〉100U/L4例）;心肌酶谱及心电图检查无异常。B超提示肝脏增大8例,脾脏增大5例。结论儿童肺炎支原体、嗜肺军团菌混合感染应警惕肝损伤,肝功能检测对诊断有重要价值。     

中成药中沙门氏菌环介导等温扩增快速检测方法的建立及应用

目的 建立以invA特异性基因设计合成为引物的沙门氏菌环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法。方法 选择沙门氏菌的毒力因子invA基因作为检测模板，采用Primer Exploer V5软件设计3组LAMP引物[正向外引物（F3）、反向外引物（B3），正向内引物（FIP）、反向内引物（BIP），正向环引物（LF）、反向环引物（LB）]，以4种沙门氏菌（甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌）和3种非沙门氏菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产志贺氏毒素大肠埃希氏菌）的细菌DNA为模板，进行LAMP快速检测。结果 在反应温度为65℃、反应时间为60 min条件下，即可快速检测4个亚种沙门氏菌，其检测灵敏度可达10 cfu/mL，且试验结果易于观察，筛选的引物特异性良好。结论 所建立的方法灵敏度高、特异性好、检测快速，可应用于中成药中沙门氏菌的快速检测。     

LAMP技术检测社区获得性非典型肺炎中的嗜肺军团菌感染

目的探讨环介导恒温扩增技术检测社区获得性肺炎非典型病原体嗜肺军团菌感染的可行性。方法收集195例CAP患者急性期双份合格痰液标本,一份痰液标本用作嗜肺军团菌分离培养,一份痰液标本经处理后-80℃保存至DNA提取运用LAMP技术及荧光定量PCR检测,验证LAMP试验方法的敏感性、特异性及可行性。结果 195例痰培养嗜肺军团菌检出率1.54%(3/195),荧光定量PCR灵敏度达10~(-3)/mL,检出率8.72%(17/195);LAMP方法学灵敏度达10~(-7)/μL,检出率9.23%(18/195);两者阳性符合率94.44%(17/18),两者阴性符合率99.44%(177/178),两者总符合率99.49%(194/195)。结论采用LAMP技术检测临床痰液标本中的嗜肺军团菌具有高度的特异性和敏感性,实验时间约1.5h且操作简便,更合适基层医院开展。     

某部一起军团菌肺炎暴发的调查与处置

目的 对某部一起军团菌肺炎暴发情况进行调查.方法 采用现场流行病学调查、病例个案调查与实验室检测相结合的方法.血清标本采用嗜肺军团菌1-7 IgM抗体定量检测试剂盒,用美国产Stat Fax 2100酶标仪进行检测.洗澡水用活性炭酵母浸膏培养基进行军团菌培养.洗澡水及浴室地面污泥使用嗜肺军团菌核酸扩增检测试剂盒,用瑞士产罗氏2.0实时定量PCR仪进行检测.结果 该部队累计发病39例,罹患率为15.12%(39/258).经血清IgM抗体定量检测及细菌培养证实,本次疫情由I型军团菌所致.采用盐酸左氧氟沙星和阿奇霉素联合治疗后,均康复出院.结论 该部因太阳能淋浴系统孳生Ⅰ型军团菌导致军团菌肺炎暴发,因此,对淋浴系统进行定期消毒,并对消毒效果及相关病原体进行监测非常重要.     

军团菌病的流行特点和诊断研究

检测五所医院２６４例急性感染、类风湿关节炎病人和１０例对照病人血清军团菌ＩｇＭ抗体（ＥＬＩＳＡ），以心脏病术后感染和肿瘤并发感染的阳性率最高均为５０％；其次为肺部感染（３８．８９％）、肺炎（３３．３３％）和血液病、红斑狼疮（３３．３３％）；对照组均为阴性。以嗜肺军团菌１～６型感染多见，占５３．８５％，其次为米克达德军团菌（３２．３０％）、博杰曼军团菌（９．２３％）和高曼军团菌（４．６１％）感染。ＩｇＭ抗体阳性率无性别差异；６０岁以上（含６０岁）年龄组ＩｇＭ抗体阳性率高于６０岁以下年龄组。结果提示对急性感染病人特别是高危人群（高龄、肿瘤病人、免疫功能低病人、糖尿病）中的呼吸道感染病人常规检测军团菌ＩｇＭ抗体及时做出诊断。     

蕲蛇及其混淆品高特异性PCR鉴别

目的：建立一种准确、简便的蕲蛇药材DNA分子标记鉴别方法。方法：用Cytb通用引物对蕲蛇及7种常见混淆品PCR扩增后进行测序，依其序列间差异设计一对专用于中药材蕲蛇的鉴别引物HQSL-1和HQSH-1。用不同的复性温度PCR扩增，确立特异性反应条件。探讨适合中药材动物药的分子标记种类。结果：PCR扩增结果是在50℃复性温度下，正品蕲蛇均得到约220bp的扩增带，而混淆品在同样的条件下无扩增带。结论：所设计的鉴别引物对正品蕲蛇有高度的特异性。PCR方法重复性高，同种不同个体间的种内差异对鉴定结果不会有影响。本方法简单、准确、快速。     

真菌性角膜溃疡的PCR检测

目的：探讨临床拟诊为真菌性角膜溃疡PCR（polymerase chain reaction）快速检测的方法。方法：以源于医学条件致病性真菌18s rRNA基因保守区的一对寡核苷酸序列为通用引物,对临床拟诊为真菌性角膜溃疡的标本进行PCR检测．并与培养方法进行对比。结果：在400bp处出现DNA扩增带者为阳性。36份临床标本的真菌培养阳性率为58．33％。而经PCR扩增阳性率为86．11％。结论：真菌通用引物进行PCR反应检测真菌性角膜溃疡速度快、阳性率高,有助于真菌性角膜溃疡的快速诊断。     

酸处理时间对军团菌生长的影响

目的：探讨不同的酸处理时间对军团菌生长的影响。方法：在嗜肺军团菌细菌悬液中加入等量的酸处理液（pH2．2），分别放置不同的时间，然后接种GVPC平板，采用菌落计数比较不同的酸处理时间对军团菌生长的影响。同时比较不同的酸处理时间对嗜肺军团菌和铜绿假单胞菌混合液的作用，观察其对铜绿假单胞菌的抑制作用。结果：3～5min酸处理对嗜肺军团菌生长的影响较小。对于混合液，3～15min酸处理均可抑制杂菌的生长，但3～5min酸处理对军团菌生长的影响小。结论：适当的酸处理时间可抑制杂菌的生长，且对军团菌生长的影响小，可有效提高军团菌的检出率。     

Documentation of Legionella pneumophila and Mycobacterium tuberculosis co-existence in a patient with acute respiratory distress syndrome

BACKGROUND: Bacterial lung infections are common causes of ARDS and, despite intensive research for decades, the mortality rate remains very high. Only two reports suggest the co-existence of Legionnaires' disease and pulmonary tuberculosis based mainly on clinical presentation and serologic results for Legionella and positive cultures for Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). MATERIALS AND METHODS: A variety of specimens from a 61-year-old man was used for detection of Legionella pneumophila (L. pneumophila) and M. tuberculosis by PCR. Further identification of the pathogens was carried out by sequence analysis. RESULTS: L. pneumophila region mip was detected in bronchial washings, bronchoalveolar lavage and urine specimens of the patient. M. tuberculosis regions IS6110 and mtp40 were detected in endo-bronchial secretions and bronchoalveolar lavage. CONCLUSION: By using polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing we documented L. pneumophila and M. tuberculosis co-existence, in multiple specimens of a patient presenting with acute respiratory distress syndrome (ARDS). Furthermore, the efficacy of the specific antibiotic treatment, based on the PCR results, suggest the co-existence of these two pathogens.     

猪基源的肝素粗品及混淆品的AS-PCR及ARMS分子检测

本文建立了一种简便、准确的鉴别猪基源的肝素粗品及其混淆品的DNA分子鉴定方法。在对家猪、野猪及其他7种动物(均用于加工猪肝素粗品的混淆品)的mtDNA D-loop区进行序列分析的基础上，设计了专门用于鉴别猪基源肝素钠的AS-PCR(allele-specific PCR)引物及ARMS(amplification refractory mutation system)引物，对家猪、野猪及其他7种动物来源的肝素、肌肉或血液共49个样品的基源进行了分子检测。结果表明：AS-PCR及ARMS方法均可用于猪基源肝素粗品的快速鉴别。AS-PCR鉴别时的复性温度为54～56 ℃，ARMS引物鉴别时的复性温度更宽，为52～58 ℃。在用两种引物对肝素样品进行鉴别时，仅猪来源的肝素DNA模板能扩增得到约170 bp的扩增条带，而其他动物来源的肝素DNA模板在同样条件下无扩增产物。     

地鼠多瘤病毒PCR检测方法的建立

目的  建立地鼠多瘤病毒（hamster polyomavirus, HaPyV）PCR检测方法,并应用于乙型脑炎减毒活疫苗生产过程中地鼠肾细胞的感染检测。方法  设计针对HaPyV衣壳蛋白VP1基因片段的特异引物,以含HaPyV VP1片段的质粒PMD19T-HaPyV688为模板进行PCR扩增并测序确认扩增产物。以多种病毒DNA为模板进行PCR扩增并对扩增产物进行斑点杂交鉴定以验证PCR方法的特异性。将定量的质粒PMD19T-HaPyV688 10倍系列稀释后进行PCR敏感性检测。以小鼠多瘤病毒(murine polyomavirus, MuPyV)检验PCR法对质粒DNA和病毒DNA检测的一致性。应用建立的方法对生产用地鼠肾细胞悬液进行HaPyV DNA检测。结果  仅含有质粒PMD19T-HaPyV688和MuPyV DNA的样品能够扩增出600 bp的片段,经斑点杂交及测序证明其分别为HaPyV和MuPyV的VP1特异基因片段。PCR所能检出的PMD19T-HaPyV688和MuPyV 的最少DNA拷贝数分别为5300和590。7个亚批生产用地鼠肾细胞悬液的HaPyV检测结果均为阴性。结论  建立的PCR方法具有较高的敏感性和特异性,可用于生产用地鼠肾细胞HaPyV感染的检测。     

中药材龟甲及原动物的高特异性PCR鉴定研究

目的:建立一种简便、实用的龟甲药材DNA 分子鉴定方法。方法:根据22 种亚洲产龟类的线粒体12SrRNA 基因片段序列,设计一对专用于鉴定中药材龟甲原动物乌龟的鉴别引物,用该对引物扩增从乌龟和其他18 种龟共48 个样品的DNA 模板。结果:在72℃的复性温度下进行PCR,4 个乌龟的模板DNA 均得到约180 bp 的阳性扩增带,而其他各龟的模板DNA,在同样条件下无扩增产物,用这对鉴别引物经一次PCR 反应便可准确地鉴定受试原动物是否为乌龟。同法对江苏省药品检验所提供的17 块样品龟甲进行了鉴定,结果表明只有4 块样品为正品,其余皆为伪品,与性状鉴定和DNA序列分析鉴定结果完全一致。结论:所设计的鉴别引物对乌龟有高度特异性,所配制的龟甲药材鉴定试剂盒可在龟甲药材鉴定中使用。     

测序技术在缺失型脊髓性肌萎缩症基因诊断中的应用

【摘要】目的 探索将测序技术应用于缺失型脊髓性肌萎缩症（SMA）基因诊断的可行性。方法设计2对引物,PCR扩增SMA致病基因运动神经元生存基因（SMN1）与其同源基因SMN2之间5个不同碱基所在区域,第1对引物正向扩增SMN1内含子6至7间长度为501bp片段,包含4个不同碱基位点g.31957、32006、32154及32269;第2对引物反向扩增SMN1外显子8区域,长度为189bp,包含1个不同碱基位点g.32734。根据测序图谱区分SMA患者与携带者和（或）正常人。将此方法应用于7个临床疑似SMA家系的诊断,并与聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）法进行比较。结果6例测序图谱显示SMN内含子6至外显子8之间5个SMN1和SMN2差异位点 g.31957、32006、32154、32269及32734均只有SMN2特有碱基a、T、g、g和A,患儿父母（携带者）相同位点显示为a/g、 T/C、g/a、g/a和A/G。说明患者缺失SMN1基因,缺失范围包括内含子6至外显子8;携带者则既有SMN1基因,又有 SMN2基因,与患者能区分开。1例检测结果为a、T、g、g和A/G,说明其缺失范围不含外显子8。测序法与PCR-RFLP 方法结果一致。结论测序技术在缺失型SMA患者的基因诊断上优于经典PCR-RFLP法,更方便快捷,结果更明确,建议替代常用的PCR-RFLP法。     

大环内酯类和氟喹诺酮类药物对细胞内嗜肺军团菌的效果分析

目的分析了大环内酯类和氟喹诺酮类药物在抑制巨噬细胞内嗜肺军团菌的疗效。方法选取10株不同嗜肺军团菌血清1型,利用琼脂稀释法对不同嗜肺军团菌血清1型针对大环内酯类和氟喹诺酮类药物的半致死浓度进行分析。THP-1人单核细胞在佛波酯诱导下形成巨噬细胞,然后将不同嗜肺军团菌血清1型与巨噬细胞共同培养,待细胞将巨噬细胞吞噬后,采用半致死浓度不同倍数(1倍、4倍,8倍)的红霉素、阿奇霉素、左氧氟沙星及莫西沙星等药物对胞内的细菌进行抑制,共同培养24 h后,采用平板计数法对军团数量进行计算,用细菌抑制率进行表示。结果红霉素、阿奇霉素、左氧氟沙星及莫西沙星在半致死剂量、4倍半致死剂量、8倍半致死剂量下对细菌的抑制情况如下:红霉素:(51.42±23.19)%、(75.28±19.08)%及(90.52±9.87)%;阿奇霉素:(60.57±23.14)%,(90.25±9.68)%及(98.58±3.89)%;左氧氟沙星:(99.24±0.13)%、(99.56±0.58)%及(99.99±0.01)%;莫西沙星:(99.14±0.25)%、(99.36±0.35)%及(99.89±0.11)%。在不同半致死剂量下氟喹诺酮类药物对巨噬细胞胞内细菌的抑制率明显高于大环内酯类药物,具有统计学意义(P<0.05)。左氧氟沙星和莫西沙星在不同倍数的半致死剂量下对细菌的抑制率没有显著性差异P>0.05),阿奇霉素对巨噬细胞内细菌的抑制率显著性高于于红霉素,具有显著统计学意义(P<0.05)。结论氟唾诺酮类药物抑制胞内抗军团菌效果好于大环内酯类药物,左氧氟沙星和莫西沙星抑制效果相当,阿奇霉素抑制效果明显优于红霉素。     

Colonization of Legionella species in hotel water systems in Turkey

BACKGROUND: The goal of this study was to evaluate the prevalence of Legionella species in hotel water distribution systems in Alanya, Turkey, which is an important tourism center. METHODS: Water and swab samples were obtained from 52 Turkish hotels from August 2003 to September 2005. Water samples were collected in 100 mL sterile containers and were concentrated by membrane filters with a pore size of 0.45 microm. Heat treatment was used to eliminate other microorganisms from the samples, which were then spread on buffered charcoal yeast extract alpha agar plates and glycine, vancomycin, polymyxin, cycloheximide agar plates. Cysteine-dependent colonies were identified by latex agglutination. RESULTS: In all, 491 water and swab samples were analyzed. The results of all samples were negative for Legionella in 16 (30.8%) hotels. Legionella species (92.5% of which were Legionella pneumophila) were detected in 93 (18.9%) of the samples. The most frequently isolated species were L pneumophila serogroups 6 (63.5%) and 1 (21.5%). CONCLUSIONS: Legionella pneumophila serogroup 6 was the most common isolate detected in Turkish hotel water systems in our study. The result of Legionella urinary antigen tests, which are the diagnostic tests most often used to identify legionnaires' disease, may be negative in people infected with L pneumophila serogroup 6. We suggest that clinicians should apply the whole spectrum of laboratory methods for the detection of legionnaires' disease in patients with pneumonia of unknown origin and history of travel to Alanya, Turkey.     

紫苏属药用植物的rDNA ITS区SNP分子标记与位点特异性PCR鉴别

目的分析单种属——紫苏属各变种间rDNA ITS区的序列以及存在的单核苷酸多态性(SNP)现象，设计出位点特异性PCR引物，用于紫苏属各变种间的分子标记鉴别。方法对紫苏属各变种多个体的rDNA ITS区全序列进行了准确测定，运用Clustral X 1.8，MEGA 3.0进行排序并进行SNP分析，从而设计出鉴别各变种的等位基因位点特异性PCR鉴别引物。结果紫苏属各变种(紫苏、白苏、鸡冠苏和耳齿紫苏等)的rDNA ITS区全序列共有615～618 bp的长度，ITS1为233～235 bp，5.8S为179 bp，ITS2为203～204 bp，GC含量为61.5%～61.9%。从rDNA ITS区碱基变异的整体情况来看，紫苏属各变种间不仅在非编码的转录间隔区ITS1和ITS2内存在非编码区单核苷酸多态性(ncSNP)，而且在保守的5.8S编码区内也存在3个位点的单核苷酸多态性，即编码区SNP(cSNP)，所有的SNP均只具2等位多态性。5.8S区cSNP的出现与产生该变异的变种出现的显著形态差异关联。本文还利用这些SNP位点设计出了鉴别紫苏属各变种的位点特异性PCR引物，无需测序即可对紫苏属的原植物及“苏子”、“苏叶”等药材进行有效准确的分子鉴别。结论紫苏属药用植物rDNA ITS区存在的SNP可用作紫苏属各变种鉴别的分子标记。     

Simple and rapid identification of low level hepatitis B virus DNA by the nested polymerase chain reaction

A rapid and sensitive method has been developed to detect hepatitis B virus DNA (HBV) by nested polymerase chain reaction (PCR) technique with primers specific for the surface and core regions in capillary thermal cycler within 80 min. The lower limit for detection by present PCR method is 10⁻⁵ pg of recombinant HBV DNA which is equivalent to that determined by one round of PCR amplification and Southern blot hybridization analysis. When boiled HBV positive serum was serially diluted 10-fold, HBV DNA was successfully determined in 1 μl≈10⁻³ μl of serum. HBV DNA was detected by present method in 69 clinical samples including HBsAg positives and negatives by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). When serum samples were amplified by nested PCR using surface and core region primers, HBV DNAs were detected in 37 of 69 samples (53.6%) and 18 of 69 samples (26.1%), respectively. These results can inform the infectious state of HBsAg positive pateints. A simple and rapid nested PCR protocol by using boiled serum as DNA template has been described for the clinical utility to determine HBV DNA in human serum.