巨型艾美耳球虫ADF基因的克隆及原核表达

目的克隆巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)的ADF基因,并进行原核表达。方法采用RT-PCR方法扩增ADF基因,并将其与原核表达载体pET-28a连接,构建原核表达载体pET-28a-ADF,转化入大肠埃希菌Rossata(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果重组原核表达质粒经双酶切及测序鉴定结果正确。表达分子质量单位为17ku的融合蛋白。Western blot检测融合蛋白能被抗E.maxima多克隆抗体识别。结论构建的原核表达载体pET-28a-ADF能表达具有反应原性的蛋白,为其免疫原性研究奠定了基础。     

旋毛虫Ts43基因的克隆与原核表达

目的构建旋毛虫Ts43基因原核表达载体，并且在大肠埃希菌中表达。方法将构建的pMD-Ts43克隆质粒酶切回收目的片段定向克隆到pET-28a（＋）载体上，构建原核表达载体pET-28a—Ts43，酶切鉴定正确后，导入菌株Rosetta中，用IPTG诱导表达，并经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果成功构建了含目的基因的原核表达质粒pET-28a—Ts43，IPTG诱导表达分子质量单位约为43ku的融合蛋白，与预测值相符。以0．9mmol／LIPTG诱导4．5h后表达量最高，薄层扫描表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20％。Western blot显示表达产物可被抗旋毛虫的多克隆血清识别。结论原核细胞融合表达旋毛虫Ts43基因获得成功，为旋毛虫重组苗的研究奠定了基础。     

柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP部分序列的克隆及原核表达

目的构建柔嫩艾美尔球虫病毒RNA依赖RNA聚合酶（RDRP）蛋白部分区段的原核表达重组质粒,并在大肠埃希菌中表达目的蛋白。方法根据柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP基因序列设计引物,以病毒基因组dsRNA为模板,RT-PCR扩增目的片段;扩增产物与pMD-18T克隆载体相连接,经测序鉴定序列正确后,将该质粒酶切,酶切目的片段与原核表达载体pET-28a连接构建原核表达质粒,转化入Transetta（DE3）中,经IPTG诱导表达重组蛋白,用SDSPAGE和Western blot分析目的蛋白表达。结果成功克隆柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP基因部分序列,其长度为1 330bp,DNA测序表明重组原核表达质粒构建成功,推导的编码氨基酸序列与GenBank中布氏艾美尔球虫病毒RDRP氨基酸序列同源区段同源性为36%。经SDS-PAGE和Western blot分析,柔嫩艾美尔球虫病毒部分RDRP蛋白得到表达,表达蛋白的分子质量单位为52ku,与理论值相符,且该重组蛋白可被His标签单克隆抗体识别。结论构建的重组原核表达载体pET-28a-RDRP在大肠埃希菌中高效表达柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP蛋白部分区段,为进一步研究该病毒奠定了基础。     

柔嫩艾美尔球虫EGF-like结构域基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达柔嫩艾美尔球虫（Eimeriatenella）微线蛋白4（EtMIc4）的EGF-like结构域。方法收集并纯化柔嫩艾美尔球虫子孢子,用Trizol法提取总RNA,并反转录成cDNA,利用RT-PCR技术扩增EtMIC4EGF-like基因;回收PCR产物,与pMDl8-T载体连接,构建重组克隆质粒pMDl8-T-EGF-like,然后亚克隆至原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30a-EGF-like并转化至Transetta感受态,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Westernblot分析。结果成功克隆了EtMIC4EGF-like（390bp）基因,双酶切鉴定重组表达质粒pET-30a-EGF-like构建正确。SDS-PAGE分析重组EGF-like蛋白的分子质量单位约为30ku,Westernblot显示该蛋白能被鸡抗柔嫩艾美尔球虫血清识别。结论成功构建了pET-30a-EGFlike原核表达质粒,并证明其原核表达产物EGF-like蛋白具有反应原性,为该蛋白的功能研究奠定了基础。     

鸡柔嫩艾美耳球虫疫苗候选基因在大肠杆菌中的表达

目的　构建柔嫩艾美耳球虫子孢子表面抗原原核表达载体 ,并且在大肠杆菌中表达。　方法　将本室构建的pMD Mz5 7克隆质粒酶切回收目的片段定向亚克隆到pET 2 8b( )载体上 ,构建成原核表达载体pET 2 8b Mz5 7,酶切鉴定正确后 ,在EscherichiacoliBL2 1(DE3 )中用IPTG诱导表达 ,并经SDS PAGE及Westernblotting鉴定。　结果　成功构建了目的抗原基因的原核重组表达质粒pET 2 8b Mz5 7,IPTG诱导表达该融合蛋白 ,SDS PAGE电泳表明 ,其能表达一分子质量约为 3 7ku的融合蛋白 ,与预测分子质量相符 ,最佳反应条件为 1mol LIPTG诱导 4h后表达量最高。薄层扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的 18% ,Westernblotting结果显示 ,表达产物可被抗柔嫩艾美尔球虫的多克隆抗体识别 ,说明该融合蛋白具有很好的反应原性。　结论　在原核细胞融合表达Mz5 7成功 ,为鸡球虫病重组苗的研究奠定了基础。     

微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

目的对微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白S-dsRNA基因进行克隆、表达和反应原性分析。方法以微小隐孢子虫总RNA逆转录的cDNA为模板,克隆S-dsRNA基因,并转化至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达载体pET-28a(+)-S,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察重组蛋白的表达情况,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白与鼠抗微小隐孢子虫阳性血清的反应原性。结果 PCR和双酶切鉴定表明,重组质粒pET-28a(+)-S构建成功。SDS-PAGE结果显示,37℃下经1mmol/L IPTG诱导4h,重组蛋白表达量最大。重组蛋白主要以包涵体形式表达,相对分子质量(Mr)约为37000,与预期大小一致,重组蛋白约占蛋白总量的72.6%。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能识别抗微小隐孢子虫阳性鼠血清。结论微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白S-dsRNA基因表达成功,重组蛋白具有反应原性。     

幽门螺杆菌GGT基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的: 克隆幽门螺杆菌( H pylori)γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT)基因,实现GGT基因在大肠杆菌中的表达.方法: 从胃癌患者胃黏膜组织中分离培养获得H pylori,提取其基因组DNA,对GGT基因进行PCR扩增,克隆进pMD18-T载体,酶切和测序验证,构建原核表达载体pET-28a(+)-GGT,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析检测表达产物.结果: 成功克隆了GGT基因,经酶切和测序验证正确,成功构建了pET-28a(+)-GGT质粒,高效表达出了68 kDa的融合蛋白.结论: 在大肠杆菌中成功表达了GGT重组融合蛋白,为进一步研究GGT与线粒体介导的细胞凋亡之间的关系奠定了基础.     

蓝氏贾第鞭毛虫α-4贾第素的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化蓝氏贾第鞭毛虫的α-4贾第素蛋白。方法经RT—PCR获得a-4贾第素基因片段,经双酶切连入原核表达载体pET-28a（＋）,构建成为重组表达载体pET-28a（＋）-α-4,并转化大肠杆菌Rosetta（DE3）。IPTG诱导后,收集菌体,裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测,并用Ni—NTA亲和层析柱纯化融合蛋白。结果成功构建了原核表达载体pET-28a（＋）-α-4,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白以包涵体形式存在;SDS-PAGE及Western blot分析显示,在相对分子量约34kD的位置出现目的蛋白条带,与理论值相符;经Ni—NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的重组的α-4贾第素融合蛋白。结论成功克隆、表达并纯化了α-4贾第素蛋白,为α-4贾第素的细胞定位及功能研究提供了必要条件。     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A的克隆与原核表达

目的:克隆乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白未知功能新基因HBeBP4的剪切体基因HBeBP4A,构建其原核表达载体,诱导在大肠埃希菌中表达。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术及生物信息学(bioinformat-ics)技术从HepG2细胞提取的cDNA模板中扩增获得HBeBP4基因的剪切体基因HBeBP4A,选用pGEM-T-easy载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a( )中,转化进BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导HBeBP4A融合蛋白的表达,表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,考马斯亮蓝染色,以抗-His的单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹分析鉴定证实表达蛋白的特异性。结果:成功扩增出HBeBP4剪切体基因HBeBP4A,并将其插入pET-32a( )原核表达载体,经BL21(DE3)受体菌转化、IPTG诱导、SDS-PAGE分析获得了HBeBP4A重组蛋白的表达,Western blotting证实了重组蛋白表达的特异性。结论:发现了乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4(HBeBP4)基因的剪切体HBeBP4A,构建了pET-32a( )-HBeBP4A原核表达载体,并利用大肠埃希菌原核表达系统成功获得了pET-32a( )-HBeBP4A重组蛋白的表达。     

肠道病毒71型VP1包涵体蛋白的复性与纯化

目的 利用原核表达系统,经优化诱导条件及变、复性将包涵体形式肠道病毒71型结构蛋白VP1进行纯化。方法 通过RT-PCR扩增VP1基因,并应用基因克隆技术将VP1基因与pET-28a原核表达载体连接,之后将重组载体转化至大肠埃希菌Rosseta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后对包涵体进行变、复性,采用His镍柱亲和层析对VP1蛋白进行纯化,利用SDS-PAGE和Western blot对VP1蛋白进行分析鉴定。结果 PCR扩增出891 bp的EV71-VP1基因,双酶切鉴定原核重组质粒pET-28a-EV71-VP1构建正确。重组载体转化DE3后经IPTG诱导表达VP1蛋白,且以包涵体形式存在。将包涵体变、复性,经SDS-PAGE分离后进行镍柱纯化,得到较纯的目的蛋白,Western blot分析该蛋白能被相应抗体识别。结论 构建的原核重组质粒pET-28a-EV71-VP1转化DE3后经IPTG诱导表达以包涵体形式存在的VP1蛋白,复性后纯化的VP1蛋白具有免疫原性,为EV71 VP1蛋白的研究与开发奠定了基础。     

SARS冠状病毒S1蛋白的原核表达与鉴定

目的 克隆SARS冠状病毒(SARs-CoV)S1基因片段，构建原核表达载体，并在宿主菌中诱导表达带组氨酸标记的融合蛋白。方法人工合成SARS-CoV Sl基因片段，克隆至pUCm-T载体，经DNA序列分析和酶切后，将酶切片段亚克隆至原核表达载体pET-28b( )，重组子pET-28b／SARS-S1转化大肠杆菌ril，IPTG诱导表达，Western blot鉴定表达产物；纯化表达产物并用ELISA检测其抗原特异性。结果 获得了主要以包涵体形式存在的32kD的目的蛋白，Western blot鉴定其为带组氨酸标记的融合蛋白，ELISA证明其能与合成肽的抗体及病人血清中的SARS-CoV的抗体特异结合。结论 成功构建了SARS-CoV S1基因的组氨酸标记表达载体pET-28b／SARS-S1，并在ril中得到了高效表达；表达的s1蛋白具有较好的抗原特异性，便于免疫动物以获得特异抗体，为SARS-CoV的实验室快速诊断打下了基础。     

副结核分枝杆菌SOD基因在大肠杆菌中的表达

目的构建副结核分枝杆菌SOD基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达。方法以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM-T-SOD和pET-28a(+),并将纯化的SOD基因亚克隆至pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET-28a-SOD,并将其转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western bloting分析。结果成功地构建出原核表达质粒pET-28a-SOD,并表达了约26.5kDa融合外源蛋白带,且具有牛副结核分枝杆菌抗原反应性。结论副结核分枝杆菌SOD基因在大肠杆菌中获得了表达,并具有抗原反应性,为进一步研究SOD作为诊断试剂或亚单位疫苗奠定了基础。     

人载脂蛋白C Ⅱ原核表达载体构建及蛋白表达方法

目的 构建人载脂蛋白CⅡ（ApoCⅡ）的原核表达载体,表达融合蛋白GST-hApoCⅡ.方法 采用限制性内切酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切pUC18/hApoCⅡ获得ApoCⅡ成熟肽基因片段,并与相同酶切处理的表达载体pGEX-3X连接构建重组质粒.重组质粒经酶切鉴定、测序验证后转化感受态E.coli DH5α,IPTG诱导表达,优化表达条件,表达产物经SDS-PAGE电泳分析鉴定.选取最佳条件诱导表达,亲和层系法纯化融合蛋白,采用Western blot鉴定.结果 重组质粒经酶切和测序后证实目的基因已连接入表达载体,SDS-PAGE检测到35 kD的目的蛋白条带,优化和纯化后经Western blot证实蛋白质产物为融合蛋白GST-hApoCⅡ.结论 本方法成功表达融合蛋白GST-hApoCⅡ,此为ApoCⅡ结构及其作用机理研究及制备ApoCⅡ抗体等提供了便利条件.     

用含霍乱毒素A2/B的载体在大肠杆菌中表达弓形虫主要表面抗原P30

目的：克隆并表达含有弓形虫P30抗原及霍乱毒素A2／B亚基基因的原核表达载体，为弓形虫疫苗的研究奠定基础。方法：应用PCR方法扩增出P30基因片段后，克隆入含有霍乱毒素A2／B亚基基因的表达质粒pUAB024，在大肠杆菌JM109(DE3)中表达融合蛋白。通过SDS-PAGE电泳及Western blotting进行检测鉴定。结果：电泳证明质粒构建正确，SDS-PAGE显示经IPTG诱导可以产生特异性条带，Western blotting进一步证实该条带为P30-CTA2／B融合蛋白。结论：表达载体pUAB024-P30可有效表达特异性的融合弓形虫抗原蛋白P30-CTA2B。     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活基因5的筛选克隆与重组蛋白诱导表达

目的 克隆人类乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(pre-S1)反式激活新型靶基因PS1TP5.构建其原核表达载体,并诱导其在大肠埃希菌中表达.方法 以HBV前-S1表达质粒pcDNA3.1(-)-preS1转染HepG2细胞,空载体pcDNA3.1(-)作为平行对照,提取mRNA进行抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术分析,结合生物信息学(bioinformatics)技术筛选得到人类新基因PS1TP5.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以提取的HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得PS1TP5基因片段,选用pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a( )中,转化进BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导获得了PS1TP5重组蛋白的表达,表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分析,考马斯亮蓝染色,以抗-His的单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹分析证实表达蛋白的特异性.结果 成功扩增出PS1TP5基因.并将其插入pET-32a( )原核表达载体,经BL21(DE3)受体菌转化、IPTG诱导、SDS-PAGE分析获得了PS1TP5重组蛋白的表达,Western blotting证实了重组蛋白表达的特异性.结论 应用SSH、RT-PCR与生物信息学技术筛选克隆出PS1TP5基因,构建了pET-32a( )-PS1TP5原核表达载体,并利用大肠埃希菌原核表达系统成功获得了pET-32a( )-PS1TP5重组蛋白的表达.为进一步研究PS1TP5免疫原性及慢性乙型肝炎发病机制创造了条件.     

CTP-Ub-HBcAg原核表达载体的构建及其表达

目的构建CTP-Ub-HBcAg原核表达载体并诱导和鉴定其融合蛋白的表达。方法以质粒pcDNA3.1(-)-Ub-HBcAg中的Ub-HBcAg融合基因为模板设计引物,上游引物带有CTP基因序列,进行PCR扩增,PCR产物克隆到原核表达质粒pMAL-c2x中,菌落PCR阳性克隆测序鉴定,鉴定正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,并进一步通过直链淀粉树脂亲和层析法纯化融合蛋白,Western blotting鉴定。结果 PCR扩增得到820 bp大小的条带,为CTP-Ub-HBcAg融合序列。该序列被克隆至表达质粒pMAL-c2x中,阳性克隆菌落测序正确,并在DE3中获得诱导表达。Western blotting鉴定为70 KD的CTP-Ub-HBcA融合蛋白。结论构建CTP-Ub-HBcAg原核表达载体并成功表达,为进一步研究该融合蛋白的功能提供了实验基础。     

嗜肺军团菌主要外膜蛋白与鞭毛亚单位蛋白双基因融合表达载体的构建及其诱导表达

目的构建嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因(mompS)与鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)的融合表达载体,并在原核系统表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和flaA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建mompS与flaA基因完全融合的重组质粒,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-MOMPS-FlaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了嗜肺军团菌904bp的mompS及1432bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-LpSF,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-LpSF在原核系统中得到了表达。结论成功构建了嗜肺军团菌mompS-flaA双基因的原核融合表达载体,并在大肠杆菌中得到了表达,为进一步研究嗜肺军团菌核酸双价疫苗提供研究基础。     

寨卡病毒E蛋白的原核表达及鉴定

目的应用原核表达载体pET-28a表达ZIKV主要结构蛋白E蛋白,并对反应条件进行优化,为ZIKV亚单位疫苗的研究奠定基础。方法从GenBank检索ZIKV基因组,合成E基因并进行密码子优化,以提高原核表达效率。设计引物,以合成的E基因为模板PCR扩增ZIKV E基因,用BamHI和HindIII进行双酶切后连接表达载体pET-28a,构建原核表达重组质粒pET28a-ZIKV E,转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行目的蛋白的表达,并对最适IPTG诱导浓度进行优化。结果 pET28a-ZIKV E经酶切及测序鉴定均构建正确。用重组质粒转化DE3,当加入IPTG终浓度为2mmol/L,成功表达出分子质量单位(Mr)为56×103重组ZIKV E蛋白,与理论分子质量相符合。Western blot检测重组蛋白可被His标签抗体识别。结论成功构建原核重组载体pET-28a-ZIKV E,表达的重组蛋白具有免疫反应性,为ZIKV亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

小鼠Lewis肺癌细胞与旋毛虫相关抗原基因sHSPs的原核表达及鉴定

目的对小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞与旋毛虫(Trichinella spiralis)相关抗原基因sHSPs进行原核表达,对表达产物进行抗原性鉴定。方法利用噬菌体文库展示技术筛选旋毛虫与LLC细胞相关抗原基因并分析,获得sHSPs(DQ 986457)基因。以旋毛虫cDNA为模板,PCR扩增sHSPs基因,连接至表达载体pET-32a(+)后转化入感受态BL21(DE3),以IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白的表达及其反应原性。结果重组表达质粒pET-32a(+)-sHSPs经双酶切及测序鉴定证明克隆载体构建正确,SDS-PAGE检测其表达重组蛋白相对分子质量约为36×10~3。Western blot检测重组蛋白可被抗LLC细胞多抗血清识别。结论成功构建了pET-32a(+)-sHSPs克隆载体,其表达的重组蛋白可与抗LLC细胞多抗血清反应即具有反应原性,为该蛋白的研究奠定了基础。     

小鼠Lewis肺癌细胞与旋毛虫相关抗原基因sHSPs的原核表达及鉴定北大核心CSCD

目的对小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞与旋毛虫(Trichinella spiralis)相关抗原基因sHSPs进行原核表达,对表达产物进行抗原性鉴定。方法利用噬菌体文库展示技术筛选旋毛虫与LLC细胞相关抗原基因并分析,获得sHSPs(DQ 986457)基因。以旋毛虫cDNA为模板,PCR扩增sHSPs基因,连接至表达载体pET-32a(+)后转化入感受态BL21(DE3),以IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白的表达及其反应原性。结果重组表达质粒pET-32a(+)-sHSPs经双酶切及测序鉴定证明克隆载体构建正确,SDS-PAGE检测其表达重组蛋白相对分子质量约为36×10~3。Western blot检测重组蛋白可被抗LLC细胞多抗血清识别。结论成功构建了pET-32a(+)-sHSPs克隆载体,其表达的重组蛋白可与抗LLC细胞多抗血清反应即具有反应原性,为该蛋白的研究奠定了基础。