绿色荧光蛋白腺病毒表达载体在大鼠肌源性干细胞标记中的应用

目的:对大鼠肌源性干细胞转染携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒表达载体,为进一步行标记细胞移植治疗实验奠定基础。方法:复苏并培养人胚胎肾293细胞,进行包装重组及大规模扩增腺病毒;原代培养大鼠肌源性干细胞并进行GFP基因转染,荧光显微镜观察转染情况并计算转染率。结果:人胚胎肾293细胞在普通培养条件下生长良好,加入Ad-GFP病毒液后48h荧光显微镜观察绝大多数细胞呈悬浮状态,带有较强的绿色荧光;转染肌源性干细胞后呈Desmin免疫组织化学显色阳性;48h荧光转染率为83.14%,4d为78.35%,8d为75.12%。结论:采用携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒表达载体标记肌源性干细胞的方法安全可靠、简便有效,且能保持肌源性干细胞原有生物学特性。     

miRNA慢病毒表达载体的构建及其在原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞中的稳定表达

目的:构建miRNA的慢病毒表达载体,使其在原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞中稳定表达。方法:将该干扰片段构建入慢病毒载体(pL KD-Ubc-eG FP-U6-shRNA)的U6启动子下游,该载体可以实现在干扰小片段RNA的同时表达绿色荧光蛋白EGFP基因,便于观察载体工作状态。通过脂质体转染法转染原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞,观察转染的原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞的形态及表达情况。结果:针对筛选的miRNA构建的慢病毒载体,经过DNA测序结果和琼脂糖凝胶电泳鉴定成功构建了筛选的miRNA的慢病毒表达载体,重组质粒转染原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞,经24 h后在荧光倒置显微镜下可以观察到部分细胞带有绿色荧光,筛选的miRNA构建的慢病毒载体在原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞中稳定表达。结论:筛选的miRNA的慢病毒表达载体构建成功,并稳定的转染到原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞中,为miRNA对神经细胞存活功能的研究提供了平台。     

携带CXCR4基因慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的体外实验

背景:间充质干细胞在体内归巢主要调控因子是CXCR4,如何提高干细胞自身CXCR4的表达量是调节干细胞体内靶器官归巢能力的关键。目的:构建CXCR4或GFP基因慢病毒表达载体,并观察其对骨髓间充质干细胞自身生长特性及分泌功能的影响。方法:骨髓间充质干细胞应用慢病毒载体转染系统转染CXCR4基因达到过表达,同时单独转GFP基因作为对照。通过荧光显微镜、RT-PCR、免疫蛋白印迹方法验证病毒转染效率;流式细胞技术测定骨髓间充质干细胞的增殖、凋亡情况;Western Blot法测定间充质干细胞培养基上清中分泌蛋白及细胞因子变化。结果与结论:慢病毒转染系统可以安全、有效地转染CXCR4基因或GFP基因到骨髓间充质干细胞。流式细胞仪检测显示过表达CXCR4的骨髓间充质干细胞增殖能力、生存能力加强,凋亡细胞减少(P0.05);细胞上清蛋白分析提示过表达CXCR4后,骨髓间充质干细胞培养上清内出现很多的蛋白因子升高(P0.05),其中大多数对细胞自身复制及免疫调节有益。结果表明慢病毒转染是一种安全高效的基因修饰手段,可以通过CXCR4基因修饰的方法提高骨髓间充质干细胞的生存能力、降低凋亡率,调节细胞保护性因子及免疫调节因子的分泌功能。     

重组rAAV2/eGFP、rAAV2/NGF病毒转染神经干细胞的研究

目的　观察重组rAAV2 /eGFP(含报告基因 )和rAAV2 /NGF(含目的基因 )病毒转染神经干细胞的转染效率 ;探讨神经干细胞治疗神经系统疾病的新途径。方法　分离、培养和鉴定神经干细胞后 ,用重组rAAV2 /eGFP和rAAV2 /NGF病毒转染神经干细胞 ,用荧光显微镜和免疫细胞化学检测GFP和NGF在体外的表达。结果　GFP和NGF于 2 4h后在体外开始表达 ;5d后表达效率高达 89% ,并可持续稳定表达 35d以上 ;MOI(v g/cell)不同 ,表达效率不同。 结论　重组rAAV2 /eGFP和rAAV2 /NGF病毒可转染神经干细胞 ,神经干细胞可稳定表达GFP和NGF ,可用于基因治疗神经系统疾病。     

绿色荧光蛋白、菲立磁体外双标记神经干细胞及其活性的研究

目的探索用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)重组逆转录病毒和菲立磁(超顺磁性氧化铁,,Superparamagnetic Iron Oxide,SPIO)体外双标记神经干细胞的可行性及其对细胞活力的影响。方法用病毒介导的GFP基因转导大鼠胚胎神经干细胞。用SPIO和Lipofectamine体外磁化标记经GFP标记的胚胎神经干细胞。用荧光显微镜观察双标记神经干细胞,并行普鲁士蓝染色,了解转染成功率。MTT(四甲基偶氮唑蓝)法检测标记神经干细胞的细胞增殖活力。结果双标记神经干细胞分化的细胞荧光显微镜下观察见发出绿色荧光,普鲁士蓝染色呈阳性。而未标记神经干细胞荧光显微镜下观察未见发出绿色荧光,普鲁士蓝染色呈阴性。MTT法检测发现GFP和SPIO双标记神经干细胞的增殖活力与未标记神经干细胞相比无改变。结论绿色荧光蛋白重组逆转录病毒和菲立磁可以有效地标记体外分离培养的大鼠胚胎神经干细胞。双标记神经干细胞的增殖、分化活力与未标记神经干细胞相比无改变。     

慢病毒重组同源盒基因HOXA4表达载体的构建及其感染人脐带间充质干细胞的实验性研究

目的 构建携带同源基因HOXA4的慢病毒表达载体,并测定其对人脐带间充质干细胞的感染效率.方法 使用酶切及PCR技术从含有HOXA4基因的质粒克隆模版HOXA4-MSCV逆转录载体中获取目的 基因HOXA4,并将HOXA4基因重组到慢病毒载体表达质粒上Lenti-GFP-CTB,通过酶切、测序验证HOXA4基因后,将Lenti-GFP-HOXA4质粒、和辅助包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE、PMD2G共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带HOXA4基因的重组慢病毒Lentiviral-HOXA4;然后感染人脐带间充质干细胞,通过荧光显微镜及流式细胞术检测其感染效率.结果 成功构建携带HOXA4基因的慢病毒表达载体Lentiviral-HOXA4,并获得高纯度的慢病毒浓缩液.经检测病毒滴度达2.11×108 TU/ml.成功转染HOXA4基因的脐带间充质干细胞表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数(MOI)值为60时转染效率最高,达(95.4±4.3)%.结论 成功构建携带人HOXA4基因的慢病毒,并可以在体外有效转染人脐带间充质干细胞.     

利用Tet-On系统构建稳定表达Pdx1的小鼠ESC细胞株

目的:利用Tet-On系统构建稳定表达胰十二指肠同源异形框1(Pdx1)的小鼠胚胎干细胞(ESC)株,为进一步研究Pdx1+定型内胚层细胞向胰腺细胞分化奠定了基础.方法:采用Tet-On系统构建具有绿色荧光蛋白标记及嘌呤霉素抗性的Pdx1过表达慢病毒载体并感染胚胎干细胞.实验分为空白对照组(ESC组)、空载慢病毒对照组...     

骨形态发生蛋白7转染骨髓间充质干细胞再生骨组织

背景：骨形态发生蛋白7具有促进骨髓间充质干细胞分裂增殖的作用,在诱导新骨形成方面有重要的研究意义。 目的：观察携带人骨形态发生蛋白7慢病毒载体转染后骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白7蛋白及mRNA的表达。 方法：提取并培养大鼠骨髓间充质干细胞,通过形态学和细胞表面标记进行鉴定;构建携带人骨形态发生蛋白7的慢病毒载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞,提取RNA后采用RT-PCR的方法检测骨形态发生蛋白7 mRNA水平相对表达量的变化,Western blotting检测骨形态发生蛋白7蛋白水平相对表达量的变化。 结果与结论：成功构建了携带骨形态发生蛋白7基因的慢病毒载体PLV-sfGFP(2A)-BMP7,重组载体质粒成功转染至大鼠骨髓间充质干细胞中,转染组的骨形态发生蛋白7 mRNA和蛋白表达高于空载体组和空白组,差异有显著性意义(P < 0.05),说明外源性骨形态发生蛋白7基因被有效整合到骨髓间充质干细胞并进行表达。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

环氧化酶2基因沉默不影响人骨髓间充质干细胞定向分化的能力

背景：目前环氧化酶2基因沉默在干细胞中的研究还处在初级阶段。 目的：构建携带环氧化酶2基因沉默的慢病毒载体,观察其在人骨髓间充质干细胞中的表达,以及其定向分化潜能变化情况。 方法：应用重组慢病毒技术构建携带沉默环氧化酶2基因和绿色荧光蛋白的慢病毒载体,并用其转染体外培养第3代的人骨髓间充质干细胞,以无目的基因的慢病毒转染人骨髓间充质干细胞的实验组和未做处理的人骨髓间充质干细胞分别作为阴性对照组和空白组进行对比。转染后7 d分别提取各组细胞的总RNA和蛋白检测环氧化酶2表达量。对环氧化酶2基因沉默的人骨髓间充质干细胞和正常人骨髓间充质干细胞定向诱导,观察环氧化酶2基因沉默对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力的影响。 结果与结论：慢病毒转染3 d后,荧光显微镜下可见人骨髓间充质干细胞发出绿色荧光,阴性对照组转染效率可达90%以上,实验组转染效率达85%以上。RT-PCR和Western blot检测结果显示, 环氧化酶2基因在人骨髓间充质干细胞中的基因水平和蛋白水平均得到了明显抑制。环氧化酶2基因转染对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力无明显影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

人胚胎干细胞体外培养、传代及冻存、复苏研究

目的建立人胚胎干细胞体外培养模式，并对其进行冻存及复苏。方法将人胚胎干细胞置于小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养，细胞接近融合状态时进行传代，程序降温法冻存，速溶方法复苏，确定解冻后细胞复苏率、克隆生长与分化情况，并对其生物学特性进行鉴定。结果人胚胎干细胞稳定增殖了5个月，传至20代；细胞在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上呈集落生长，核大，核仁明显。程序降温法冻存后复苏，细胞复苏率达到78．3％；解冻后第12代细胞仍具有稳定的46，XX核型；TRA-1—81阳性，表达Nanog基因，流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为89．38％。结论成功建立了人胚胎干细胞体外培养模式，为研究人胚胎干细胞及相关疾病的防治提供细胞模型和细胞来源。