快速而敏感检测无菌性脑膜炎患者标本中的肠道病毒

作者比较了一种PCR测定法与细胞培养法检测疑似无菌性脑膜炎患者脑脊液(CSF)标本中肠道病毒的效果。 标本来自38例患有脑膜炎综合征的儿童,腰穿见脑脊液淋巴细胞增多(≥6个细胞/mm~3)和革兰氏染色阴性,CSF培养细菌和真菌阴性,被认为患有无菌性脑膜炎,将CSF先后作病毒培养和PCR测定。     

无菌性脑膜炎主要病原Echovirus 30快速检测系统的建立

目的:建立一套造成无菌性脑膜炎的主要病原Echovirus 30的快速检测系统,增加临床病例的快速筛查和检测。方法:通过对Echovirus 30病毒基因组的核酸序列比对,设计出针对Echovirus 30的特异性检测引物,并对2011年5月-8月间在中国南方地区的一次无菌性脑膜炎爆发流行进行报道和病原检测。结果:在188例无菌性脑膜炎临床病例中,98.9%为15岁的儿童。所有标本使用肠道病毒通用引物检测阳性的为109例,其中使用E30特异性VP1段引物检测阳性的79例,对79株E30的VP1段测序分型显示,引起本次爆发流行的E30由Ⅶ型造成,而与Ⅰ-Ⅵ型的同源性为69.8%-87%。结论:本研究成功建立了一套快速、简便、特异的Echovirus 30检测系统,并依据该系统第一次报道了在中国南方地区引起无菌性脑膜炎爆发的肠道病毒病原。     

福州地区2004年儿童无菌性脑膜炎病原初步研究

无菌性脑膜炎(aseptic meningitis,AM)亦称病毒性脑膜炎[1],系指软脑膜(软膜和蛛网膜)的弥漫性炎症,是中枢神经系统感染性疾病中常见的一种临床综合征。一般急性起病,以发热、头痛、脑膜刺激症状和脑脊液的变化为主要临床表现。脑脊液中白细胞增多(多数以淋巴细胞增多为主),蛋白含量增多,糖含量正常,涂片及培养证实无细菌、霉菌者,习惯上称AM。在所有无菌性脑膜炎病例中,大多数为肠道病毒感染,包括脊髓灰质炎病毒(1~3型)、柯萨奇病毒(A组23个型,B组6个型)、埃可病毒(31个型)和未分类肠道病毒(5个型)。2004年5~8月在福州地区发生无菌性脑…     

脑膜炎奈瑟菌检测及基因分群

目的建立多重聚合酶链反应(PCR)技术对脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis, Nm)的快速诊断及分群方法。方法应用多重PCR技术对本实验室保存的70株已鉴定Nm进行核酸鉴定及基因分群, 同时检测23例流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)疑似病例脑脊液标本中脑膜炎奈瑟菌特异性DNA片段。用传统的细菌培养法和血清凝集法作对照, 比较其特异性。结果68株Nm的多重PCR检测结果与血清分群结果一致, 2株血清未能分群的Nm经多重PCR检测为C群;23例流脑疑似病例脑脊液标本经多重PCR检测有5例为C群, 1例为A群,1例为B群,阳性检出率为30.43%。传统的病原分离培养、生化鉴定和血清学鉴定出4例为C群, 阳性检出率为17.39%。结论多重PCR技术对脑膜炎奈瑟菌检测的特异性优于传统的细菌培养法以及血清凝集法。     

乙型肝炎病毒体外感染HepG2细胞的初步研究

目的建立HBV阳性血清体外感染HepG2细胞的实验模式。方法在六孔板上培养HepG2细胞,用HBV阳性血清体外感染HepG2细胞,设立感染组和对照组。用HBV阳性血清和感染组细胞共孵育24 h,0.01 mol/L PBS清洗细胞后,每孔板中加入4 ml DMEM细胞培养液,每隔12 h收集细胞上清液至PBS洗后84 h。收集完最后一次细胞上清液,收集细胞培养板中的细胞。ELSIA检测细胞培养上清中HBsAg;PCR方法检测细胞培养上清和细胞中HBV DNA;免疫荧光定量PCR检测细胞培养上清中HBV DNA的含量。结果HBV感染组细胞培养上清,在PBS洗后第12 h,ELISA即可检测到HBsAg并持续到84 h,PCR检测感染组细胞培养上清和感染组细胞的HBV DNA均阳性。荧光定量PCR检测感染组细胞培养上清中HBV DNA的结果:感染组PBS洗后(0 h)的HBV定量为阴性,而在PBS洗后36 h8、4 h细胞培养上清中HBV的量达到5×105,3×106copies/ml)。结论用HBV阳性血清体外感染HepG2细胞的实验是可行的。     

T-SPOT.TB试验在结核性脑膜炎诊断中的价值

目的探讨T-SPOT.TB(结核感染T细胞斑点实验)试验在结核性脑膜炎诊断中的价值。方法对我院26例临床和影像学可疑结核性脑膜炎的患者的脑脊液实施结核感染T细胞斑点实验,对照组为23例无结核原发病灶的脑膜炎患者的脑脊液实施结核感染T细胞斑点实验。结果 26例临床和影像学可疑结核性脑膜炎患者中,23例结核感染T细胞斑点实验阳性(占88.5%),对照组24例中结核感染T细胞斑点实验阳性有4人(占16.7%)。利用结核感染T细胞斑点实验检测以此诊断结核性脑膜炎的敏感度为88.5%(95%可信区间CI 49.9~91.3)特异度为83.3%(95%可信区间CI 69.3~97.8),阳性预测值为82.5%(95%可信区间CI72.6~97.9),阴性预测值为91.7%(95%可信区间CI 48.3~97.1)。结论结核感染T细胞斑点实验是一种具有较高敏感性和特异性的检测结核感染的技术,这对快速而准确地诊断结核性脑膜炎是有用的。     

非脊髓灰质炎肠道病毒与无菌性脑膜炎研究进展

非脊髓灰质炎肠道病毒(non—poho enteroviruses，NPEV)是除脊髓灰质炎病毒(pohovirus，PV)外所有肠道病毒的总称。NPEV感染多数情况下不引起明显的临床症状，但有时也会引起比较严重的疾病，如无菌性脑膜炎和脑炎。无菌性脑膜炎的病原多种多样，疱疹病毒、巨细胞病毒等都能使感染者发生无菌性脑膜炎。但研究表明，NPEV是目前引起无菌性脑膜炎爆发流行的主要病原。为此，本文拟就NPEV所致无菌性脑膜炎病原分型、鉴定诊断及流行概况作一综述，并提出相应的预防对策，以进一步加深对该疾病的认识。     

胸腹水脑脊液中结核杆菌的检测

目的 为临床结核性胸膜炎、腹膜炎、脑膜炎结核杆菌的检测寻找一个敏感、快速、可靠的实验检测方法。方法 采用直接涂片、血清抗体检测和荧光定量-聚合酶链反应(FQ-PCR)方法，对85份结核患者和131份非结核患者脑脊液和胸腹水标本中结核杆菌和抗结合抗体进行分析，其中胸水67份，腹水21份，脑脊液128份。结果 临床治疗性确诊的85例结核性胸膜炎、腹膜炎、脑膜炎患者的胸腹水脑脊液标本，FQ-PCR检测出53例结核杆菌检出阳性(FQ-PCR)，阳性率为62．4％，131例非结核患者均为阴性；85例结核患者胸腹水直接涂片抗酸染色镜检11例阳性，阳性率仅为13．0％，131例非结核性标本中，结核抗体检出36例阳性，假阳性率达27．4％。结论 荧光定量-聚合酶链反应(FQ-PCR)快速诊断结核性胸膜炎、腹膜炎、脑膜炎与其他传统方法相比较，具有快速、灵敏、高特异性等优点，并能克服一般聚合酶链反应假阳性多的缺点。     

河南省非脊髓灰质炎肠道病毒感染的分型研究

肠道病毒(Enterovirus，EV)包括脊髓灰质炎(脊灰)病毒(PV)、柯萨奇病毒(Cox)、埃可病毒(ECHO)和新肠道病毒68～72型等共68个血清型。非脊髓灰质炎肠道病毒(NPEV)是无菌性脑炎、脑膜炎等的主要病因，同时有些型别也是造成儿童急性弛缓性麻痹(APP）的原因。为了解河南省急性弛缓性麻痹病例中的非脊髓灰质炎肠道病毒感染的型别和流行情况．探讨NPEV感染与其发病关系，对1997～2000年AFP病例分离到的129株NPEV进行血清分型研究。     

全血γ-干扰素释放试验对结核性脑膜炎的早期辅助诊断价值探讨

目的评价外周血结核分枝杆菌γ-干扰素体外释放试验(TB-IGRA)对结核性脑膜炎早期辅助诊断的价值。方法收集2015年1—12月四川大学华西医院住院治疗的56例结核性脑膜炎患者(实验组)及56例非结核性脑膜炎患者(对照组)的TB-IGRA、脑脊液结核分枝杆菌培养、脑脊液TB-DNA的检查结果,计算各诊断方法的灵敏度和特异度。结果 TB-IGRA、脑脊液培养、脑脊液TB-DNA诊断结核性脑膜炎的灵敏度分别为87.5%(49/56)、19.6%(11/56)、60.7%(34/56),特异度分别为89.3%(50/56)、100.0%(56/56)、76.8%(43/56)。TBIGRA诊断结核脑膜炎的灵敏度高于脑脊液TB-DNA检查和脑脊液结核分枝杆菌培养,且TB-IGRA特异度高于脑脊液TB-DNA(89.3%76.8%),三者两两相比,差异均具有统计学意义(均P0.01)。其中脑脊液培养确诊的11例病例中,有10例TB-IGRA阳性,阳性率为90.9%(10/11);45例临床诊断+抗结核治疗有效的病例中,TB-IGRA阳性39例,阳性率为86.7%(39/45)。结论 TB-IGRA协助结核性脑膜炎患者的早期诊断具有高灵敏度和特异度,其检查方便、快速、有效,值得临床推广。     

肠道病毒TaqMan荧光定量RT-PCR法快速检测

目的建立一种特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法检测肠道病毒核酸,应用于暴发疫情的实验室应急检测。方法根据GenBank登录的肠道病毒基因序列,应用生物学软件进行序列比对,在肠道病毒基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针;对荧光RT-PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性和灵敏度。同时对疑似肠道病毒感染者的临床样本进行检测。结果该方法对肠道病毒的检测有高度的特异性,可检出脊髓灰质炎、柯萨奇和埃可等肠道病毒,与腮腺炎、麻疹、风疹、乙型脑炎等病毒均无交叉反应。检测的灵敏度达0.1病毒效价滴定（TCID50）;可直接从疑似肠道病毒感染者的脑脊液、疱疹液和粪便等标本中检测肠道病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测肠道病毒特异、敏感的方法,适用于由肠道病毒感染引起的应急疫情的实验室早期诊断。     

实时荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用

目的通过对2010年4～8月北京市怀柔区手足口病病原学监测数据的分析,了解北京市怀柔区手足口病流行趋势,为该地区手足口病防治提供科学依据,同时探讨实时荧光RT-PCR在检测手足口病毒核酸中的应用价值。方法采集2010年4～8月怀柔区疑似肠道病毒感染者咽拭子和疱疹液标本,用实时荧光RT-PCR方法对人肠道病毒(包括EV71、CoXA16)进行核酸检测。结果 2010年4～8月共采集121例标本,检出肠道病毒EV71型87例,CoXA16型19例,肠道病毒通用型6例,阴性9例。结论 2010年4～8月怀柔区手足口病毒以肠道病毒EV71型为主。实时荧光RT-PCR技术具有特异性强、灵敏度高的特点,且能在采样后数小时内检测到病毒的RNA,从而达到快速诊断的目的,该方法对手足口病的治疗及疫情的有效控制提供有力的病原学支持。     

2010年广州地区儿童肠道病毒71型感染的分子流行病学研究

目的了解广州地区2010年肠道病毒(EV)71病毒流行状况。方法设计肠道病毒71型实时荧光RT-PCR引物和TaqMan探针,运用TaqMan实时荧光RT-PCR技术,对2010年全年来医院就诊的疑似手口足病患儿送检标本20150份,进行肠道病毒71型荧光RT-PCR检测,同时,设计了扩增EV71病毒全基因组的引物,随机选取了5株病毒进行全基因组进行测定。结果在20150份临床标本中,EV71病毒的阳性为4780份,全年总的检出率为23.72%,每个月均有阳性检出;其中,EV71病毒阳性率较高的为4～7月份,最高检出率为6月份,达32.19%,最低检出率为10月份,为7.91%;扩增了5株广州株EV71病毒全基因组全长序列,提交到GenBank上,将5株广州株EV71病毒与EV71的A、B3、B4、B5、C1、C2、C3、C4型及阜阳株全基因组核苷酸序列进行ClustalW比较,发现与C4a型阜阳株等同源性为98.00%～99.00%,与C4b同源性为91.00%～93.00%,与C1-C3同源性为82.00%～83.00%,与B3、B4、B5同源性为81.00%～83.00%,与A型同源性为80.00%。结论 2010年广州地区手足口病的主要病原是肠道病毒71型,EV71病毒在2010年全年还是较普遍流行,全基因组序列分析表明,2010年分离的5株广州株EV71病毒属于C4a型。     

肠道病毒VP1基因定型巢式RT-PCR反应体系建立及评价

目的建立一种快速、灵敏、特异的肠道病毒VP1基因分型巢式RT-PCR检测方法。方法根据Gen Bank发表的肠道病毒全基因组序列,收集国内外文献,将文献中用于测序分型的引物进行总结分析,在其VP1区设计并合成巢式RT-PCR引物,优化PCR反应条件,建立检测肠道病毒基因分型的巢式RT-PCR方法。将200株肠道病毒通用阳性,EV71、CA16阴性的临床标本及阴性对照、EB病毒、登革热病毒、流感病毒、腺病毒用该方法进行巢式RT-PCR扩增,随机选择30例PCR产物进行测序,明确本区肠道病毒流行基因型。结果 200份临床病例样本巢式RT-PCR扩增,124例有准确PCR扩增条带,阳性率为62%;阴性对照、EB病毒、登革热病毒、流感病毒、腺病毒均未扩增出条带;23例测序成功,7例比对失败,其中检出16份CA6阳性,阳性率为69.5%,6份CA12阳性,阳性率为26.1%,1份CA10阳性,阳性率为4.3%。结论肠道病毒VP1基因分型巢式RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异度;本院就诊患儿肠道病毒基因型主要以CA6和CA12型为主。     

2011年厦门市某医院十例无菌性脑炎暴发病例病原学分析

目的 对2011年5月11-17日厦门某医院收治的10例无菌性脑炎患者进行病原学鉴定.方法 采集10例患者的咽拭子、肛拭子及部分患者的脑脊液,进行总肠道病毒核酸检测.总肠道病毒核酸阳性的样本,分别用肠道病毒A、B、C基因型各自的VP1通用引物扩增,VP1区扩增阳性的标本测序后进行序列分析.同时,用Vero细胞进行病毒分离培养,对培养成功的病毒与原始临床标本进行VP1序列同源性分析,从而对引发本次脑炎的病原进行鉴定.结果 10例脑炎患者中,有7例患者的临床标本总肠道病毒核酸检测阳性.这7例患者的咽拭子和(或)肛拭子标本肠道病毒B基因型VP1通用引物扩增阳性,测序后分析表明均为肠道病毒B基因型埃可病毒30(Echo 30),且与浙江2004年流行毒株的同源性达95.3%～97.1%.其中编号为XM2、XM3、XM4、XM8的咽拭子和XM3、XM6的肛拭子相互间序列同源性为99.4%～100.0%,但与XM1的咽拭子序列存在差异,同源性为92.8%～93.4%.此外,XM1、XM2、XM3、XM4、XM8咽拭子标本Vero细胞分离培养病毒成功,其VP1区部分序列与相应的原始标本同源性大于99.9%.结论 导致这次无菌性脑炎的病原体为肠道病毒B基因型Echo 30,并提示可能存在多种不同遗传背景的Echo 30在流行.

Abstract：

Objective To identify the etiology of an aseptic encephalitis outbreak (ten cases) in a hospital of Xiamen city from 11 to 17 May, 2011.Methods A total of ten patients′ throat swabs, anal swabs and cerebrospinal fluid were collected and detected by RT-PCR for pan-enterovirus. The samples containing detectable pan-enterovirus were tested by PCR with genotype-specific general primers located in VP1 region of enterovirus genotype A, B and C (HEV-A, B and C). The PCR products of VP1 segment were purified and sequenced, and phylogenetic analysis was performed. Meanwhile, the pathogens in those samples were isolated in Vero cell culture. Homologous analysis of VP1 sequences were carried out for the cultured virus samples and the original clinical samples to identify the outbreak etiology.Results Among the ten cases, seven cases were positive for pan-enterovirus nucleic acid. When tested by genotype-specific PCR, the throat and anal swab samples from those 7 patients were positive with HEV-B VP1 primers. Meanwhile, the HEV-B VP1 segments were sequenced and phylogenetic analyzed, which indicated the seven cases were all infected by enterovirus Echo 30. The sequences from those samples had homology of 95.3%-97.1% with the epidemic strains in Zhejiang, 2004. Out of the seven cases, the sequences of XM2,XM3,XM4,XM8 throat swab samples and XM3,XM6 throat samples showed 99.4%-100.0% homology which were different from the sequence of XM1, and the homology was 92.8%-93.4%. Furthermore, the viruses were isolated using Vero cells from XM1,XM2,XM3,XM4 and XM8 throat swab samples,and the VP1 sequence showed more than 99.9% homology with the original specimens.Conclusion The local outbreak of aseptic encephalitis was caused by Echo 30 of enterovirus genotype B, and the epidemic strains may have different genetic background.     

Myocarditis: an expected health hazard associated with water resources contaminated with Coxsackie viruses type B

Enteroviruses, especially Coxsackie B viruses (CBVs), are responsible for approximately 50% of cases of viral myocarditis. In the present study, serum samples (160) were collected from acute myocarditis patients at different age groups and 104 samples of the same age groups as a control. Cholesterol, LDH, CPK, and GOT were measured for all serum samples (264). Also, to study the source of virus transmission, 72 water and 72 wastewater samples were collected from water and wastewater treatment plants at intakes and outlets. Water and wastewater samples were concentrated by filtration through Zeta-plus filter cartridges and reconcentrated by the PEG-6000 precipitation method. Serum, water, and wastewater samples were inoculated in BGM cells for three successive passages. RT-PCR with enterovirus primers was carried out directly for serum samples and for 1st and 3rd cell culture passages. The positive samples were used for neutralization assay using anti-CBV sera pool to determine the CBV followed by neutralization with separate antisera. The results showed that 50 (31.25%) serum samples from acute myocarditis patients and two (1.4%) samples from the controls were positive for enterovirus RT-PCR. For water and wastewater samples enteroviruses were present in 63.8% and 8.3% for intake and outlet of water treatment plants and, 66.6% and 47.2% for intake and outlet of wastewater treatment plants, respectively. The level of CBV serotypes was varied where CBV3 was dominant for all age groups of myocarditis patients and CBV2 and CBV5 were also detected while CBV2 was the main CBV in water samples and CBV2, 3 and 5 were detected in wastewater samples. The integration of cell culture-PCR reduces the time required for virus detection and enhances the sensitivity of the test.     

2008年湖州市肠道病毒71型和COXA16型的监测分析

目的:了解湖州市肠道病毒的感染情况,为制定预防和控制肠道病毒感染提供依据。方法:采用荧光定量RT-PCR和RT-PCR方法,对湖州市101例疑似肠道病毒感染者的疱疹液、咽拭子及粪便标本进行肠道病毒通用核酸、肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16的核酸检测。结果:肠道病毒通用核酸阳性87例,阳性率为86.14%(87/101)。其中EV71阳性20例,阳性率为19.80%(20/101);Cox A16阳性1例,阳性率为0.99%(1/101),二者均阴性14例。男女发病率分别为18.46%(12/65)和25.0%(9/36)。疱疹液中EV71检出率24.32%(9/37),Cox A l6检出率2.70%(1/37);咽拭子中EV71检出率18.96%(11/58),Cox A l6未检出;粪便标本中EV71和Cox A l6均未检出。结论:EV71是引起湖州市儿童手足口病的主要病原体,Ev71和Cox A16的发病率无性别差异,疱疹液、咽拭子标本中EV71及Cox A16的检出率明显高于粪便标本,要加强对Ev71和Cox A16的鉴别诊断,有利于提出更好的预防和控制措施。     

Aseptic meningitis outbreak associated with echovirus 9 among recreational vehicle campers--Connecticut, 2003

Aseptic meningitis is an inflammation of the tissues covering the brain and spinal cord and caused by a virus, most frequently an enterovirus. In August 2003, the Connecticut Department of Public Health (CDPH) received a report of three viral meningitis cases among recreational vehicle (RV) campers staying at a campground in northeastern Connecticut. CDPH, assisted by CDC, conducted an investigation, which 1) identified a total of 12 cases of aseptic meningitis and 24 cases of enterovirus-like illness among 201 campers interviewed, 2) demonstrated how transmission of enterovirus from persons with mild illness contributed to the aseptic meningitis outbreak, and 3) determined that crowded conditions inside RVs and in the campground swimming pool likely facilitated spread of enterovirus. Pool operators should check chlorine and pH levels frequently, particularly during peak pool occupancy; adults should take precautions against passing enterovirus to children, who are at greater risk for severe illness.     

青海高原地区脑炎脑膜炎症候群的病原学分析

摘要:目的　了解高原地区青海省脑炎脑膜炎症候群病例病原种类及其流行特征,探讨脑炎脑膜炎症候群的病原谱构成情况。方法　2009年9月-2011年12月,在青海省妇女儿童医院和青海红十字医院两家哨点医院采集脑炎/脑膜炎患者的脑脊液、全血、鼻/咽拭子、粪便等标本,用Real-time PCR方法对乙脑病毒、肠道病毒等4种病毒核酸检测和肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟球菌等8种细菌培养鉴定。结果　收集329例病例,295份脑脊液均做了细菌和病毒学检测,细菌检出22株阳性菌株,阳性率7.46%,分布在50～岁组和2～岁组;病毒检出阳性18份,阳性率6.10%,分布在5岁以下儿童。检出的细菌依次为金黄色葡萄球菌、结核杆菌、隐球菌和大肠杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌;病毒主要为肠道病毒,其次为腮腺炎病毒和单纯疱疹病毒。结论　提示青海地区脑炎/脑膜炎症候群病原谱以细菌为主,肠道病毒也不可忽视,5岁以下儿童及无疫苗预防的脑炎脑膜炎是防控的重点。。     

Aseptic meningitis epidemic during a West Nile virus avian epizootic

While enteroviruses have been the most commonly identified cause of aseptic meningitis in the United States, the role of the emerging, neurotropic West Nile virus (WNV) is not clear. In summer 2001, an aseptic meningitis epidemic occurring in an area of a WNV epizootic in Baltimore, Maryland, was investigated to determine the relative contributions of WNV and enteroviruses. A total of 113 aseptic meningitis cases with onsets from June 1 to September 30, 2001, were identified at six hospitals. WNV immunoglobulin M tests were negative for 69 patients with available specimens; however, 43 (61%) of 70 patients tested enterovirus-positive by viral culture or polymerase chain reaction. Most (76%) of the serotyped enteroviruses were echoviruses 13 and 18. Enteroviruses, including previously rarely detected echoviruses, likely caused most aseptic meningitis cases in this epidemic. No WNV meningitis cases were identified. Even in areas of WNV epizootics, enteroviruses continue to be important causative agents of aseptic meningitis.