人骨形态发生蛋白—2真核表达载体的构建

目的 构建人骨形态发生蛋白－2（hBMP-2）真核表达载体,并观察其在真核细胞内表达的可能性。方法 Sal Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切含有hBMP－2全长cDNA的pUC19,回收1.24kb片段,将其连入真核表达载体pcDNA3,构建重组子pcDNA3-hBMP-2。将重组子转化细菌,扩增后提取质粒,分别用Ecor Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切和Xho Ⅰ单酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定。将重组子转染成纤维细胞,G418筛选形成阳性克隆后继续培养4周行细胞原位杂交和免疫组织化学染色。结果 琼脂糖电泳显示：用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后可形成两条带,大小分别为1.3kb和5.38kb,而Xbo Ⅰ酶切位点消失,符合物理图谱,表明载体构建成功,转染后G418筛选所获阳性克隆,继续培养4周,的位杂交和免疫组织化学染色,结果表明hBMP-1基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。结论 成功构建hBMP-2真核表达载体,该载体可在真核细胞内表达,为将来骨损伤的基因治疗奠定了一定的实验基础。     

pcDNA3-hBMP2基因转染成纤维细胞及其稳定表达

目的 探讨外源性hBMP2基因在成纤维细胞获得稳定表达的可行性。方法 将hBMP2的cDNA连入真核表达载体pcDNA3,形成重组真核表达载体pcDNA3-hBMP2,在脂质体介导下,将其导入小鼠成纤维细胞株（NIH3T3）。通过G418筛选获得阳性克隆,并继续培养4周,然后用原位杂交和免疫组织化学方法检测BMP2基因在成纤维细胞NIH3T3内的稳定表达情况。结果 经原位杂交和免疫组织化学证实,转染 pcDNA3-hBMP2后的成纤维细胞NIH3T3内有大量hBMP2 mRNA的转录和蛋白的表达。结论 在脂质体介导下,hBMP2基因能够导入成纤维细胞内并在其内获得稳定表达。     

pcDNA3-hBMP2转染对成纤维细胞 生物学性状的影响

目的 探讨人BMP2基因转染对成纤维细胞NIH3T3生物学性状的影响。方法 构建重组真核表达载体pcDNA3-hBMP2,并在脂质体介导下,将其导入NIH3T3成纤维细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,用细胞原位杂交和免疫组织化学方法检测hBMP2基因在NIH3T3成纤维细胞内的表达情况;MTT法和FCM检测pcDNA3-hBMP2转染pcDNA3-hBMP2后成纤维细胞超微结构的改变,碱性磷酸酶的检测观察转染pcDNA3-hBMP2后成纤维细胞向成骨细胞分化情况。结果 转染pcvDNA3-hBMP2后的NIH3T3细胞内有大量hBMP2mRNA的转录及其蛋白的表达;转染pcDNA3-hBMP2对成纤维细胞增殖和细胞周期无影响;转染pcDNA3-hBMP2后的成纤维细胞超微结构可见粗面内质网丰富,囊腔扩张明显其内充满中等电子密度的蛋白分泌物;碱性磷酸酶活性显著上升。结论 pcDNA3-hBMP2转染对成纤维细胞NIH3T3增殖和细胞周期无影响。转染后的成纤维细胞不仅可形成BMP2,而且具有向成骨细胞系分化的特性。     

稳定表达人骨形成蛋白-2基因的成纤维细胞体内诱导成骨作用

目的 探讨稳定表达人骨形成蛋白—2(hBMP—2)基因的成纤维细胞是否具有体内诱导成骨能力。方法 构建置组真核表达载体pcDNA3—hBMP—2，在脂质体介导下，将其导入NIH3T3细胞，通过G418馈选获得阳性克随，并继续培养4周，用细胞原位杂交和免疫组织化学方法观察hBMP—2基因在NIH3T3细胞内的稳定表达，并观察了稳定表达hBMP—2的成纤维细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的变化，将稳定表达hBMP—2的成纤维细胞植入裸鼠肌袋内观察其体内诱导成骨作用。结果 成功构建重组真核表达载体pcDNA3—hBMP—2，经细胞原位杂交和免疫组织化学证实，转染pcDNA3—hBMP—2后的NIH3T3细胞内有大量hBMP—2mRNA的转录及其蛋白的稳定表达，稳定表达hBMP—2的成纤维细胞ALP活性显著上升，植入裸鼠肌袋内4周有大量软骨形成。结论 稳定表达hBMP—2的成纤维细胞具有体内诱导成骨能力。     

骨形成蛋白-2基因在人骨髓基质细胞中的表达及对其成骨分化的作用

目的利用构建的人骨形成蛋白-2(BMP2)真核表达载体pcDNA3／BMP2，检测其转染人骨髓基质细胞后的表达及对其成骨分化的影响。方法酶切鉴定构建的真核表达载体pcDNA3／BMP2，利用脂质体介导的转染技术，将所构建的载体导入骨髓基质细胞中，体外单层培养。分别于转染后48h和4周采用原位杂交、免疫组化和碱性磷酸酶、钙化学染色方法检测BMP2的基因蛋白表达以及对骨髓基质细胞成骨分化的影响。结果pcDNA3／BMP2酶切片段的大小与理论相符。转染后细胞能检测到BMP2基因和BMP2蛋白表达，并促进成骨转化。结论pcDNA3／BMP2转染骨髓基质干细胞中可获得短暂和长期表达，并加强骨髓基质细胞的成骨分化能力。     

人血管生成素1真核表达载体的构建及在兔骨髓间充质干细胞的表达

目的 探索构建人血管生成素1(human angiopoietin 1，hAng-1)真核表达载体，转染体外培养兔骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stemcells，MSCs)修复骨缺损的可能性。方法 基因重组和限制性内切酶酶切构建真核表达载体pcDNA3-hAng 1，经脂质体DOTAP介导质粒转染兔MSCs，G418筛选阳性克隆，RTPCR及免疫印迹杂交检测hAng-1 mRNA及蛋白表达。结果 重组真核表达载体pcDNA3-hAng-1经限制性内切酶Xho-I和BamH-I酶切后，电泳显示1．4kb hAng-1目的片段和5．4kb pcDNA3载体片段，转染兔MSCs后，RT-PCR检测出目的基因mRNA，免疫印迹杂交检出hAng-1的蛋白表达。结论 构建的真核表达载体pcDNA3-hAng-1能在转染的兔MSCs中表达，可以为组织工程骨修复奠定基础。     

人胎儿表皮干细胞的体外分离培养及基因转染

目的：探讨人胎儿表皮干细胞体外分离培养的方法以及作为体外基因转染靶细胞的可行性。方法：利用Ⅳ型胶原快速贴附法分离人胎儿表皮干细胞，以人胎儿成纤维细胞条件培养液配制表皮干细胞培养基，通过角蛋白19（K19）和整合素β1免疫组化染色、细胞周期分析及克隆形成率测定，对培养细胞进行鉴定。采用脂质体介导法，以含血管内皮细胞生长因子165（VEFG165）基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(pcDNA3.1/VEGF165)转染培养细胞；采用病毒载体介导法，以含报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的重组腺相关病毒载体（raav/GFP)转染培养细胞。应用免疫组化染色及荧光显微镜观察检测转染效果。结果：人胎儿表皮干细胞呈明显克隆性生长、克隆形成率高，G1期细胞比例明显高于普通基底层角质细胞，K19和整合素β1免疫组化染色呈强阳性。pcDNA3.1/VEGF165转染的表皮干细胞VEGF165免疫组化染色阳性，raav/GFP转染的表皮干细胞呈现强荧光。结论：利用Ⅳ型胶原快速贴附法及人胎儿成纤维细胞条件培养基，可初步实现人胎儿表皮干细胞的分离培养。以质体为介导或以腺相关病毒为载体进行人胎儿表皮干细胞的体外基因转染是可行的。     

大鼠葡萄糖转运体3真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建大鼠葡萄糖转运体3（GLUT3）的真核表达载体，为进一步研究葡萄糖转运体3对缺血缺氧脑细胞的保护作用奠定基础。方法以逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）的方法从大鼠脑组织中获取GLUT3全长cDNA片段，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-Glut3，随后用Lipofectamine^TM2000介导转染HEK293细胞，以RT-PCR的方法检测重组质粒在mRNA水平的表达，以免疫组织化学的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达。结果克隆的大鼠GLUT3全长cDNA大小约1．5kb且无碱基突变，以构建的重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-Glut3转染293细胞后，在基因及蛋白表达水平均检测到了葡萄糖转运体3的表达。结论成功构建了携带大鼠葡萄糖转运体3的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-Glut3，且证实其可在293细胞中成功表达目的基因。     

Mda-7/IL-24基因转染对肝癌细胞凋亡影响的研究

目的 为了研究Mda-7／IL-24基因对肝癌细胞系Hep3B凋亡的影响。方法 构建了Mda-7／IL-24基因的真核表达载体pcDNA3．1／Mda-7／IL-24，用脂质体介导的基因转染法分别将真核重组体pcDNA3．1／Mda-7／IL-24和pcDNA3．1空载体质粒导人人肝癌细胞系Hep3B细胞中，经G418筛选获得细胞克隆。通过聚合酶链式反应（PCR）、免疫组织化学等方法检测基因和蛋白的表达，同时检测了细胞的生长和凋亡情况。结果 pcDNA3．1／Mda-7／IL-24转染的Hep3B细胞能够检测到Mda-7／IL-24的表达，可以抑制细胞生长，DNA琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞特有的“梯状”条带，转染空载体和未转染的Hep3B细胞未见凋亡表现。结论 将外源性Mda-7／IL-24基因导人Hep3B细胞后，可以促进凋亡，Mda-7／IL-24作为一种肝癌的治疗基因，具有广泛的应用前景。     

重组人BMP-7真核表达质粒的构建及转染软骨细胞后的表达

[目的]构建重组人骨形成蛋白-7（rhBMP-7）基因真核表达质粒，转染兔关节软骨细胞，探讨外源性人rhBMP-7基因在转染软骨细胞中的表达情况及对细胞生物学性状的影响。[方法]采用PCR技术扩增rhBMP-7基因，将其插入真核表达载体pcDNA3．1中，体外分离培养兔关节软骨细胞，然后用构建的rhBMP-7质粒转染软骨细胞，经G418筛选、免疫组化染色和逆转录PCR检测其表达，同时检测表达产物对维持软骨细胞表型的作用。[结果]经过PCR及酶切鉴定证实获得了BMP-7真核表达质粒pcDNA3．1-rhBMP-7，通过免疫组化染色和逆转录PCR鉴定证实rhBMP-7在转染后的软骨细胞中得到了表达，其表达产物促进软骨细胞表型的维持。[结论]外源性rhBMP-7基因转染软骨细胞可以获得高效表达，并具有一定的维持软骨细胞表型的作用，为软骨组织工程的研究提供了改良的种子细胞。     

人血管内皮生长因子基因转染原代成人皮肤成纤维细胞研究

目的　将人血管内皮生长因子 (hVEGF)基因导入原代离体成人皮肤成纤维细胞 ,验证转基因细胞分泌hVEGF情况 ,探讨成人自体细胞基因修饰后移植的可行性。方法　采用酶消化法获取成纤维细胞 ,以杜氏改良培养基 (DMEM )传代培养。以脂质体转染法将pcDNA3 .1( ) /hVEGF12 1导入成纤维细胞 ,培养 48h后取细胞作逆转录 多聚酶链式反应 (RT PCR) ,上清行酶联免疫吸附反应 (ELISA)检测、MTT测定和Mile’s实验。结果　转基因细胞经RT PCR扩增出一条约 44 4bp条带 ,ELISA显示转基因细胞培养上清VEGF浓度约 (12 .3 2± 0 .3 9) μg/L ,MTT显示上清明显促内皮细胞增殖 ,Mile’s实验显示上清明显增加毛细血管通透性。结论　质粒 pcDNA3 .1( ) /hVEGF12 1成功转染成人皮肤成纤维细胞 ,转基因细胞能表达分泌有生物活性的VEGF12 1蛋白。     

pcDNA 3.1/RPs15载体构建及对皮肤成纤维细胞作用的实验研究

目的 构建核糖体蛋白s15(RPs15)基因真核表达载体，研究其对小鼠皮肤成纤维细胞的体外作用。方法 将RT-PCR法获得的鼠胚皮肤RPs15cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3．1(-)，在FuGENE6介导下转染体外培养的小鼠皮肤成纤维细胞，观察RPs15基因的表达情况及其对成纤维细胞生物学特性的影响。结果 构建的重组表达载体pcDNA3．1／RPs15经DNA测序证实序列正确。RT-PCR法检测RPs15基因在转染的成纤维细胞中获得表达，细胞生长密度下降，形态发生变化。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／RPs15，并可在体外培养的小鼠皮肤成纤维细胞中表达，为深入研究RPs15基因对皮肤成纤维细胞的作用奠定了基础。     

BMP-2基因转染对人成纤维细胞生长和增殖的影响

目的：研究人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因转染对人成纤维细胞株KMB-17生长及增殖的影响。方法：将hBMP-2基因导入KMB-17细胞，检测其表达情况及对KMB-17细胞生长和增殖的影响。结果：KMB-17细胞至少可以表达BMP-2基因3周左右；并且增殖指数上升，细胞增殖加剧。结论：人成纤维细胞株KMB-17可以作为靶细胞用于BMP-2基因疗法研究。     

人骨形成蛋白7基因重组2型腺相关病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建人骨形成蛋白7基因（hBMP7）重组腺相关病毒载体,并观察其在兔骨髓间充质干细胞中的表达。方法将骨形成蛋白7基因片段克隆入穿梭质粒pUC18获得重组质粒pUC18-hBMP7。KpnⅠ和鼠Ⅱ双酶切质粒pUC18-hBMP7／与pSNAV,用T4DNA连接酶连接分别回收的两片段后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV—hBMP7／,转染BHK-21细胞,筛选培养,用能表达Rap和Cap的重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSVl-rc／△UL2感染此细胞,裂解细胞收获病毒液。采用氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提法分离浓缩、纯化与测定病毒滴度。用rAAV2-hBMP7／和rAAV2-EGFP在体外分别转染兔骨髓间充质干细胞。流式细胞仪、RT-PCR和Western—blot方法检测兔骨髓间充质干细胞中hBMP-7基因的转录和表达。结果成功构建具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7／,病毒载体对兔骨髓间充质干细胞早期转染效率可达99．8％,hBMP7／在兔骨髓间充质干细胞中可得到转录和表达。结论成功构建了人骨形成蛋白7基因重组腺相关病毒载体,rAAV2-hBMP7／载体在体外可转染兔骨髓间充质干细胞,并获得较高的转染效率。     

Temporal and spatial expression profiles of BMP receptors and noggin during BMP-2-induced ectopic bone formation.

The mechanism of ectopic bone formation has not been clear. After BMP-2 implantation into the back muscles of 198 mice, expression of BMPR-1A, -2, and Noggin was increased during the early phase of the reaction. The results suggest that positive and negative feedback mechanisms modulate ectopic osteogenesis induced by this growth factor. INTRODUCTION: The expression of bone morphogenetic protein receptors (BMPRs) and Noggin during ectopic bone formation after implantation of BMP-2 into the back muscles of adult mice was investigated in this study. METHODS: One hundred ninety-eight male ddy mice were divided into groups and received either collagen disks containing BMP-2, collagen disks alone, or sham surgery with no disk implantation. Changes in the temporal and spatial expression profiles of BMPRs and Noggin were examined by Northern blotting, in situ hybridization, Western blotting, and immunohistochemistry. RESULTS AND CONCLUSIONS: In the BMP group, expression of BMPR-1A, -2, and Noggin mRNA and protein was enhanced 2-4 days after implantation in undifferentiated mesenchymal cells and regenerating muscle fibers located close to the BMP-retaining implants. On day 7, the expression was also observed in cartilage cells, and after day 14, in the osteoblastic cells around bone tissue. The level of expression peaked at day 4 after implantation and persisted at a much lower level during the bone forming process. No significant expression of BMPR-1B was detected at the mRNA and protein levels during the bone-forming reaction. In the BMP free control groups, a mild enhancement of BMPR-2 expression was also noted around the implant, but this was not observed for BMPR-1A, -1B, or Noggin. Upregulated expression of BMPR-1A, -2, and Noggin in undifferentiated mesenchymal cells and regenerating muscle fibers occurs during the early phase of BMP-2-induced bone formation. The coordinate expression of these positive and negative regulators of BMP signaling points to a potential regulatory mechanism for bone induction.     

新型人骨形成蛋白2逆转录病毒载体的构建及活性检测

目的 构建表达重组人骨形成蛋白2(BMP2)基因的重组逆转录病毒,对其在成骨细胞中的生物学作用进行探讨.方法 克隆BMP2基因,与pDNR-CMV连接构成pDNR-CMV-BMP2,然后将重组质粒pDNR-CMV-BMP2和逆转录病毒质粒pLP-LNCX以loxP位点进行同源重组,构成逆转录病毒载体pLP-LNCX-BMP2,转染包装细胞PT67进行病毒包装,NIH3T3细胞测定病毒滴度;将逆转录病毒感染人成骨细胞,噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长变化,Western blot检测BMP2蛋白表达.结果 重组逆转录病毒载体pLP-LNCX-BMP2经鉴定连接正确;病毒载体pLP-LNCX-BMP2转染PT67后,上清液中病毒滴度可达到5×108pfu;MTT检测见逆转录病毒组与对照组比,48和72h细胞抑制率(5.1%比5.3%,8.5%比8.3%)差异无统计学意义(P>0.05),转染48 h后Westernblot可见BMP2蛋白高表达.结论 成功构建了BMP2逆转录病毒,为BMP2基因治疗及其功能研究提供了有效的手段.     

pcDNA3.1(-)-hTGFβ3成纤维细胞稳定表达系统的构建与生长增殖活性研究

目的构建人转化生长因子β3的真核表达载体pcDNA3.1(-)TGFβ3转染NIH3T3成纤维细胞的稳定表达系统,研究转基因TGFβ3对成纤维细胞生长增殖活性的影响。方法通过脂质体介导的转染技术和G418细胞筛选法,将真核表达载体pcDNA3.1(-)TGFβ3质粒导入NIH3T3成纤维细胞,应用RTPCR与Westernblot检测hTGFβ3在真核细胞中的表达。经相差显微镜形态观察及四唑蓝比色实验法(MTT)检测细胞增殖活性。结果在10株转染和经G418反复筛选的NIH3T3成纤维细胞系中,有7株hTGFβ3mRNA及其蛋白的表达明显增强,其余3株细胞相对较弱或者没有表达。TGFβ3转基因稳定表达的NIH3T3成纤维细胞系的生长增殖明显减缓(P<0.05)。结论pcDNA3.1(-)TGFβ3真核表达载体转染NIH3T3成纤维细胞的稳定表达系统构建成功,转基因hTGFβ3在体外培养条件下可抑制成纤维细胞的增殖。     

人胶质源性神经生长因子真核表达载体构建及在大鼠脊髓组织中的表达

目的探索人胶质源性神经生长因子（human glial derived neurotrophic factor,hGDNF）真核表达载体,体内直接转染SD大鼠脊髓组织治疗急性脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）的可能性。方法基因重组和限制性内切酶酶切构建真核表达载体pcDNA3-hGDNF,经脂质体DOTAP介导质粒转染SD大鼠脊髓组织,作为实验组;对照组大鼠直接注射空载体脂质体混合物。14d后取材,RT-PCR及Western blot检测hGDNF mRNA及蛋白表达。结果重组真核表达载体pcDNA3-hGDNF经限制性内切酶Hind III和Xba-酶切后,电泳显示400bp hGDNF目的片段和5400bp pcDNA3载体片段。转染大鼠脊髓组织后14d,RT-PCR检测出目的基因mRNA,Western blot检测出hGDNF的蛋白表达。结论构建的真核表达载体pcDNA3-hGDNF能在转染的大鼠脊髓组织中表达,可为基因治疗修复急性SCI奠定基础。 14 胚胎干细胞移植修复脊髓损伤的实验研究 目的观察胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES）诱导的神经前体细胞移植,对小鼠脊髓损伤神经功能恢复的影响。方法取由上海市发育生物学重点实验室提供的ES进行细胞培养和体外诱导,收集ES衍生细胞。并进行RT-PCR检测。将50只C57/BL6J小鼠制备为T9、10脊髓半横断模型,将存活的28只小鼠随机分为三组。假手术组（A组）：9只,未作任何处理;手术/细胞组（B组）：10只,于距损伤区域以远约1cm的椎管内注射2~3μl制备的ES衍生细胞,总细胞数为9×105个;手术/DMEM组（C组）：9只,按B组方法注射2~3μl DMEM。术后1、2、4、6和8周采用BBB后肢功能评分观察小鼠神经功能恢复情况,取损伤脊髓进行X-gal染色和免疫组织化学染色观察。结果ES经体外诱导培养,呈圆形或椭圆形小集落生长,有1个或多个核仁。RT-PCR检测,ES细胞诱导后表达巢蛋白及微管相关蛋白,但未表达胶质纤维酸性蛋白。小鼠实验,BBB后肢功能评分显示术后各时间点A组与B、C组比较,差异均有统计学意义（P〈0.01）。B组与C组比较,1、2和4周时,差异有统计学意义（P〈0.01）;6、8周时,组间差异无统计学意义（P〉0.05）。X-gal染色观察,B组呈阳性染色,A、C组均为阴性。免疫组织化学染色观察,B组在损伤脊髓部位,表达兔抗神经微丝蛋白,未表达胶质纤维酸性蛋白。结论将ES培养诱导分化为神经前体细胞移植后,能够存活、迁移,并分化为神经元,但未明显改善神经功能。     

pcDNA3.1-BMP-2真核表达载体构建及转染兔骨髓基质细胞的实验研究

目的 构建人骨形态发生蛋白2(BMP-2)真核表达载体，鉴定并转染兔骨髓基质细胞，为转基因治疗骨缺失疾病提供实验基础。方法 双酶切克隆载体将BMP-2目的基因与真核表达载体pcDNA3．1连接，免疫组化及Western blotting检测转染BMP-2基因骨髓基质细胞的表达效果。结果 成功构建BMP-2真核表达载体，转染骨髓基质细胞后，有BMP-2表达。结论 骨髓基质细胞经基因转染后可以表达BMP-2。为进一步实验研究提供基础。     

septin2基因短剪接本转表达产物对小鼠皮肤培养细胞作用的实验研究

目的构建septin2基因短剪接本的真核表达载体,探讨其在体外培养的小鼠皮肤培养细胞中的表达及对细胞的作用。方法特异引物PCR扩增鼠胚皮肤mRNA逆转录产物,获得septin2基因短剪接本septin2s。构建其真核表达载体pcDNA3.1(-)/septin2s,转染体外培养的小鼠表皮细胞及成纤维细胞。RT-PCR法检测septin2s的表达,并进行细胞形态及生长动力学分析。结果septin2s在转染的表皮细胞及成纤维细胞中均获得表达,表皮细胞增殖现象明显,而成纤维细胞无显著变化。结论通过构建真核表达载体pcDNA3.1/septin2s,并使其在体外培养的小鼠皮肤培养细胞中表达,为揭示其在鼠胚皮肤中的功能和作用奠定了基础。