腺病毒介导的NT—3基因在大鼠从骨神经的表达

目的观察腺病毒介导的神经营养素 - 3(neurotrophin- 3,NT- 3)基因在大鼠坐骨神 经雪旺细胞 ( Schwann cells,SCs) 的表达.方法 NT- 3重组腺病毒在 293细胞中培养繁殖并 测定滴度后,直接注入大鼠损伤修复的坐骨神经内,不同时间点取材,采用免疫组织化学染 色检测 NT- 3蛋白的表达,并用 LEICA M550型图像分析仪对坐骨神经切片 NT- 3免疫组化染色 强弱进行定量评价.结果坐骨神经损伤修复后直接注射 Ad- NT- 3,2 d后出现 NT- 3免疫组化 染色阳性产物,主要位于吻合口附近,阳性产物呈平行条纹状排列,7 d时显著增加 ( 与 2 d组相比,P< 0.01),14 d和 28 d时有所下降 ( 与 7 d组相比,P< 0.01),两者差异无显著 性意义 ( P >0.05),但与 2 d组相比,仍维持在较高的水平 ( P< 0.01).而正常坐骨神经、 损伤修复后注射 Ad- LacZ或生理盐水的坐骨神经 NT- 3免疫组化染色结果为阴性.结论 NT- 3基因能通过腺病毒介导转入损伤修复后周围神经的 SCs并表达 NT- 3蛋白,为腺病毒介导神经 营养因子基因治疗促进周围神经损伤再生提供了初步的理论和实验依据.     

腺病毒介导的 NT- 3基因在大鼠坐骨神经的表达

目的观察腺病毒介导的神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)基因在大鼠坐骨神经雪旺细胞(Schwanncells,SCs)的表达。方法NT-3重组腺病毒在293细胞中培养繁殖并测定滴度后,直接注入大鼠损伤修复的坐骨神经内,不同时间点取材,采用免疫组织化学染色检测NT-3蛋白的表达,并用LEICAM550型图像分析仪对坐骨神经切片NT-3免疫组化染色强弱进行定量评价。结果坐骨神经损伤修复后直接注射Ad-NT-3,2d后出现NT-3免疫组化染色阳性产物,主要位于吻合口附近,阳性产物呈平行条纹状排列,7d时显著增加(与2d组相比,P<0.01),14d和28d时有所下降(与7d组相比,P<0.01),两者差异无显著性意义(P>0.05),但与2d组相比,仍维持在较高的水平(P<0.01)。而正常坐骨神经、损伤修复后注射Ad-LacZ或生理盐水的坐骨神经NT-3免疫组化染色结果为阴性。结论NT-3基因能通过腺病毒介导转入损伤修复后周围神经的SCs并表达NT-3蛋白,为腺病毒介导神经营养因子基因治疗促进周围神经损伤再生提供了初步的理论和实验依据。     

大鼠外周神经损伤后许旺细胞表型改变的初步探讨

目的 探讨用免疫标记方法观察外周神经修复过程中许旺细胞表型改变的意义.方法 用SD雄性大鼠18只,制作右侧坐骨神经损伤模型,模拟临床常见的神经外膜相对扭转的缝合方法,分别于术后1、2、3周取缝合点远近各2 mm长坐骨神经标本,采用GFAP、Sox2、Krox20抗体标记许旺细胞. 结果 术后各观察点许旺细胞的GFAP表达均高于正常,且1周时表达最为明显;未见Sox2表达;术后1周Krox20几乎不表达,2、3周时Krox20的表达均高于正常,且Krox20阳性的许旺细胞明显增殖. 结论 通过免疫标记方法可以反映修复不同阶段许旺细胞的分化状态;对此现象的观察有利于判断神经再生状态并寻找影响神经再生的因素.     

大鼠坐骨神经损伤后许旺细胞源神经营养因子表达的实验研究

目的 观察坐骨神经在正常和损伤后许旺细胞源神经营养因子的表达。方法 将75只SD大鼠坐骨神经地夹伤、切断、切断加缝合等,术后第5、7、14、30、60d取材,做常规免疫组织化学研究。结果 （1）正常坐骨神经和脊髓中许细胞源神经营养因子有较弱表达;（2）切断组坐骨神经近段术后第14d许旺细胞源神经营养因子表达最高,远段第7d最高,脊髓术后第5d最高;切断缝合组和夹伤组神经和脊髓部以术后第60d最高;（3）损伤侧灰质后角表达强于对照侧。结论 (1)许旺细胞源神经营养因子在正常神经和脊髓中有较弱表达;(2) 旺细胞源神经营养因子在坐骨神经不同损伤情况下表达不同,但都高于正常组;（3）许旺细胞对神经损伤后修复作用可能通过许旺细胞源神经营养因子实现。     

脊髓内注射NT3重组腺病毒对前角神经元的保护作用

目的 观察脊髓内注射神经营养素3（Neurotrophin-3，NT3）重组腺病毒对坐骨神经损伤后脊髓前角运动神经元的保护作用。方法 制作大鼠坐骨神经夹伤模型，12只大鼠随机分为治疗组与对照组，治疗组大鼠在立体定位仪上于脊髓腹角给予神经营养素3重组腺病毒（Adeno-NT3），对照组给予生理盐水。术后不同时间通过CTB逆标观察脊髓相应节段运动神经元再生的数目；通过尼氏染色计数并计算运动神经元的存活百分率。结果 给予Adeno—NT3组与对照组相比，相应节段运动神经元再生数目和存活百分率明显增加，而且再生神经元增加的比例高于存活神经元。结论 Adeno-NT3对坐骨神经损伤后的脊髓前角运动神经元具有保护作用。     

AxCA-脑源性神经营养因子转染大鼠损伤坐骨神经后基因表达的检测

目的观察携带小鼠脑源性神经营养因子（BDNF）cDNA表达片段的非依赖辅助复制缺陷型重组腺病毒载体（AxCA）-BDNF转染大鼠坐骨神经后基因表达情况。方法成年大鼠随机分成A组（坐骨神经缺损＋硅胶管＋AxCA-BDNF原液8μl）；B组（坐骨神经缺损＋硅胶管＋BDNF溶液8μl）；C组（坐骨神经缺损＋硅胶管＋空白病毒稀释液8μl）三组。应用原位杂交和免疫组织化学检测方法，从BDNF mRNA和蛋白水平，进行坐骨神经损伤后BDNF基因表达的定性和半定量分析测定。结果伤后腺病毒介导的BDNF基因转移组，在3、7、14d、1个月，4个时相点，近、远端神经干和脊髓（L3-6）中BDNF mRNA水平均远远高于其他两组，BDNF的水平也远远高于作为对照的单纯硅胶管套接组。结论通过腺病毒介导转染的BDNF基因在大鼠坐骨神经SCs内得到了有效表达，并通过轴突逆行转运到了相应的脊髓神经元。     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的雪旺细胞对大鼠坐骨神经缺损的修复作用

目的　研究胶质细胞源性神经营养因子 (glialcellline derivesneurotrophicfactor ,GDNF)基因对周围神经断伤后促进轴突再生及神经元的保护作用。方法　应用体外获取的GDNF修饰的雪旺细胞结合细胞外基质凝胶及生物可降解聚乳酸 聚羟基乙酸共聚物管 (polyCDL lactide co glycolide ,PLGA)构建的神经移植复合体 ,修复大鼠坐骨神经的缺损。 2 0只成年Wistar大鼠按桥接物的不同随机分为 4组 ,每组 5只。A组 :细胞外基质凝胶 PLGA管桥接组 ;B组 :雪旺细胞 细胞外基质凝胶 PLGA管桥接组 ;C组 :GDNF基因修饰的雪旺细胞 细胞外基质凝胶 PLGA管桥接组 ;D组 :自体神经桥接组。术后 12周检测运动神经传导速度 ,并进行再生神经的组织形态学观察以及计量学分析。结果　术后 12周 ,坐骨神经的运动神经传导速度 ,轴突数、髓鞘的厚度、神经纤维的直径、神经组织面积的百分比和脊髓前角运动神经元存活率等 ,C组均优于A、B组 (P <0 .0 1) ,而与D组相比无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论　雪旺细胞的转基因处理可能弥补单纯细胞移植神经营养因子含量的不足 ,而达到与自体神经移植相似的效果。     

陈旧性神经损伤后雪旺细胞的变化实验研究

目的 观察大鼠坐骨神经损伤后雪旺细胞的变化。方法 切断成年SD大鼠右侧坐骨神经，形成10mm缺损。于术后1～12个月不同时间段取材。标本用p75受体（p75 neurotrophin receptor．p75NTR）、S-100免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察，另部分标本进行超微结构观察。结果 神经损伤后1个月，损伤远端神经中p75NTR和S-100的表达最多，在损伤后6个月时p75NTR降至正常水平，S-100则在损伤后9个月时消失。电镜下，雪旺细胞出现在神经内膜管内，神经内膜管下及内膜管周围有大量胶原原纤维增生。结论 大鼠坐骨神经损伤后，雪旺细胞中p75NTR的表达增加，但随损伤时间的延长呈进行性下降，伤后6个月时消失。     

Schwann cell apoptosis in Wallerian-degenerated sciatic nerve of the rat

Objective: To investigate systematically Schwann cell apoptosis in Wallerian-degenerated sciatic nerve of the rat, and evaluate its time-related feature. Methods: Ninety-five SD rats were divided randomly into one normal group (8 rats) and 11 experimental groups (66 rats, 6 in each). Both hind legs of each rat in experimental groups were randomly divided into test leg (sciatic nerve transected ) and control one (nerve uninjured). All test legs constituted a test group and all control legs constituted a control one. After operation, all rats were respectivdy sacrificed at 1 h, 6 h, 12 h, 24 h, 2 d, 3 d, 4 d, 8 d, 14 d, 21 d, and 30 d. We analyzed the specimens of mid-distal sciatic nerve, especially the morphological changes of the nerve, the different expression levels of S-100 protein and apoptosis-related proteins such as Bel-2, Bax, and Fas in Schwann cells. The TUNEL method was used to detect the apoptotic rate of Schwann cells. Results： (1) The test group showed Wallerian degeneration. The number of Schwann cells began to decrease at 24 h, obviously decreased on day 3 and 4, then began to increase from day 8 and formed Bungner belt after 14 days. (2) Schwann cells generally expressed S-100 at a low level in all groups. The control group was not significantly different from the normal group. The test group had statistical significance at 1 h and day 21. (3) As an inhibitory gene protein of Schwann cell apoptosis, Bcl-2 positive rates in the control and test groups apparently elevated and were statistically different from the normal group. (4) As a promotive gene protein of Schwann cell apoptosis, the control and test groups expressed Bax at a high level and were statistically different from the normal group. (5) As a promotive gene protein of Schwann cell apoptosis, Fas positive rate in control group was slightly elevated, but had no statistical significance compared with the normal group. Fas positive rate in test group continuously elevated in a fluctuant way, with highly statistical significance compared with the normal group. (6) TUNEL detection further proved that Schwann cell apoptosis rarely existed in the normal group, and the left sciatic nerve had no statistical significance compared with the right sciatic nerve. While the test group showed lots of apoptotic nuclei at 6 h, 2 d, 4 d, and 21 d. It had highly statistical significance compared with the normal group. Conclusions: Schwann cell apoptosis does exist in Wallerian-degenerated sciatic nerve of the rat after transection. Schwann cell apoptosis and its apoptotic genes expression have a time-related feature.     

坐骨神经切断后GDNF mRNA在两侧断端的表达变化

目的探讨大鼠坐骨神经切断后,GDNFmRNA在两侧断端的表达变化及其意义。方法切断SD大鼠左侧坐骨神经,在不同时间、应用半定量RT-PCR方法观察两侧断端GDNFmRNA的表达变化。结果坐骨神经切断前,GDNFmRNA在两侧坐骨神经微量表达,坐骨神经切断后远断端表达逐渐增加(1、7、14、28d分别增加20%、60%、85%、90%),近断端表达逐渐减少(1、7、14、28d分别减少10%、38%、45%、52%)。结论坐骨神经切断后断端GDNFmRNA表达变化是由于“胞体-轴突-靶器官”轴中断造成的。此结论为应用外源性GDNF治疗脊髓损伤提供了理论依据。     

大鼠脊髓损伤后坐骨神经GDNFmRNA表达变化及意义

目的探讨大鼠脊髓损伤后坐骨神经表达GDNFmRNA的变化及其意义.方法 Allen's方法致伤大鼠T13段脊髓,造成不完全性脊髓损伤,截取坐骨神经,以β-Actin(β-肌动蛋白)为内参照物,应用半定量RT-PCR方法,观察大鼠坐骨神经在脊髓损伤前、后不同时间GDNFmRNA表达变化.结果脊髓损伤前GDNFmRNA在大鼠坐骨神经仅有微量表达,脊髓损伤后24小时表达增加4倍,72小时增加15倍,7天增加3倍,10天仍高于正常水平.结论脊髓损伤后坐骨神经高表达GDNF,是神经元通过"胞体-轴突-靶器官"途径自我保护的一种反应形式,GDNF治疗脊髓损伤时应早期用药.     

不同类型坐骨神经损伤对相应脊髓节段基因表达的影响

目的：比较坐骨神经夹伤与坐骨神经结扎后神经元胞体基因表达的差异,探讨外周神经损伤后再生与否与基因表达差异的关系。方法：根据坐骨神经损伤基因表达谱分析的结果,选择部分表达变化的基因;通过RT-PCR的相对定量的方法检测其在坐骨神经夹伤与坐骨神经结扎后相应脊髓节段的表达水平。结果：比较两种模型差异表达的基因类别可以发现,可再生神经元胞体上调表达的基因与组织细胞的增殖(PCNA)、生长(FRAGl,NCAM)及抗凋亡(Bcl-2)有关;而不可再生的神经元胞体这些基因的表达下调。结论：外周神经元胞体对不同类型神经损伤的反应存在差异,这种差异可能与神经再生能力的不同有关。     

腺病毒介导的LacZ基因在培养许旺细胞中的表达

目的 观察腺病毒介导的LacZ基因在培养许旺细胞中的表达。方法 用报告基因LacZ重组腺病毒感染原代培养的许旺细胞，X-gal组织化学染色检测LacZ基因的表达。结果 用LacZ重组腺病毒感染培养的许旺细胞时，有较好的量效关系和时效关系。当感染增殖率分别为200、100时，24、48h后接近100％的许旺细胞被感染。而且感染后许旺细胞的形态无明显异常，增殖能力也没有受到影响。结论 腺病毒介导的LacZ基因可转入体外培养的许旺细胞并高效表达，同时许旺细胞的生长特性并不受影响，为腺病毒介导神经营养因子等基因治疗促进外周周围神经损伤再生奠定了基础。     

腺病毒介导的NT-3基因在骨髓间质干细胞中的表达

目的:研究腺病毒介导的NT-3基因在培养的大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中的表达.方法:在293细胞中培养扩增NT-3重组腺病毒(adenovirus vector for NT-3,Ad-NT-3),测定病毒滴度,然后用Ad-NT-3感染传代培养的MSCs,RT-PCR技术检测NT-3基因的表达.结果:Ad-NT-3扩增后获得了较高滴度的病毒,MSCs经Ad-NT-3感染后有NT-3 mRNA的转录.结论:腺病毒介导的NT-3基因可转入培养的MSCs并高效表达,为NT-3基因治疗的研究奠定了基础.     

雪旺细胞移植与周围神经再生

广泛阅读近年来有关人工神经方面的文献，重点了解桥接神经的移植体和雪旺细胞移植方面的研究进展。自体材料，异体材料和合成材料均可作为桥接神经缺损的神经导管，以化学萃取的同种异体神经较为理想，雪旺细胞体外纯化和培养后仍具有生物活性，用微注入法把雪旺细胞植入移植物内可促进神经轴突的再生。理想的人工神经应由有特定的三维结构的生物材料和有生物活性的雪旺细胞构成，雪旺细胞在支架内有序的分布，类似于Bungner带。     

神经营养素3基因修饰的神经干细胞对周围神经再生修复的影响

目的 探讨神经营养素3基因修饰的神经干细胞对周围神经再生的影响。方法 54只SD大鼠随机分为3组，造成坐骨神经切断损伤模型，神经外膜端端缝合，于小腿三头肌每周分别注射生理盐水、未被神经营养素3基因修饰的神经干细胞、及神经营养素3基因修饰的神经干细胞。术后3、6、9周动态观察坐骨神经功能指数(SFI)以了解后肢功能恢复情况、组织学切片观察、肌湿重恢复率测定、9周后吻合口神经干的电镜观察。结果 神经营养素3基因修饰的神经干细胞组动物的有髓神经纤维密度、神经组织面积、髓鞘厚度、肌湿重以及坐骨神经功能指数均显著优于未被神经营养素3基因修饰的神经干细胞组和生理盐水组，9周时差异有统计学意义。单纯神经干细胞组各项指标优于生理盐水组。结论 将神经营养素3基因修饰的神经干细胞移植于修复的周围神经，使局部释放的NT-3加快轴突再生速度以促进周围神经再生，减缓失神经支配肌肉的萎缩。     

化学萃取同种异体神经种植许旺细胞的体外实验

目的：通过自体许旺细胞与化学萃取同种去细胞异体神经桥接物体外结合培养的研究，寻找一种在结构功能上与自体神经相似而抗原性少或无的物质来修复较长距离的神经缺损。方法：使用近交系F344乳鼠和双差速贴壁及Arab-C抑制成纤维细胞生长的细胞培养方法来获得大量纯度的许旺细胞。成年SD大鼠作为异体神经来源，利用化学萃取去除其中细胞成分降低其抗原性，制备去细胞神经桥接物，再把前者通过微注射方法注入到后者内部继续培养观察细胞生长情况。用抗S-100标记许旺细胞计算纯度，用HE染色、电镜观察神经萃取及细胞种植其内后生长情况。结果：许旺细胞培养纯度达92%以上。Triton-X-100及脱氧胆酸钠具有完全萃取掉神经纤维中的许旺细胞及髓鞘，萃取后所得到的桥接物适合于许旺细胞体外生长，并且细胞在其内有迁移排成行的特性。结论：通过化学萃取方法所得到的异体去细胞神经桥接物种植自体许旺细胞后可能为一种理想的神经缺损修复材料。     

重组腺病毒介导LacZ基因在大鼠肺脏的表达

目的探讨重组腺病毒介导的β-半乳糖苷酶(LacZ)基因在大鼠肺脏的转基因表达。方法Wistar大鼠70只,随机分为Ad-Null组和Ad-LacZ组(n=35),分别应用1．67×10~9pfu／ml复制缺陷型重组腺病毒AdCMV和AdCMVLacZ各600μl,经气管导管滴入；各组于滴人病毒后2、5、7、14、21、28和35 d行肺组织X-gal染色。另取大鼠20只,随机分为C组、L组、M组和H组(n=5),分别应用病毒保存液和低滴度(1．67×10~8pfu／ml)、中滴度(1．67×10~9pfu／ml)、高滴度(5×10~9pfu／ml)的AdCMVLacZ各600μl,滴入病毒后7 d行肺组织X-gal染色和HE染色。结果滴入病毒后2 d,Ad-LacZ组肺组织内即有转基因表达,滴人后7 d达高峰,并维持至35 d；转基因表达位于气管、支气管上皮细胞和肺泡细胞。H组、M组转基因阳性细胞率明显高于L组和C组(P＜0．01)。HE染色显示,H组中3只大鼠肺组织有轻度炎性浸润。所有动物均未见远隔器官转基因表达。结论气管内滴人重组腺病毒可呈剂量依赖性介导LacZ基因在大鼠肺内表达,但过高剂量可诱发机体炎性反应。     

坐骨神经创伤性华勒氏变性中雪旺细胞凋亡初步研究

目的探讨成年大鼠坐骨神经创伤性华勒氏变性中雪旺细胞凋亡的存在及其时相性变化规律.方法利用成年雌性SD大鼠坐骨神经横断复制华勒氏变性模型.将74只SD大鼠随机分为12组.1个正常组(8只)、11个实验组(66只).每只实验组大鼠双后肢再随机分为试验肢(构成试验组)和对照肢(构成对照组).分别于术后1 h,6 h,12 h,24 h,2 d,3 d,4 d,8 d,14 d,21 d,30 d共11个时相点,切取坐骨神经中下段标本.检测各组神经纤维形态学改变,雪旺细胞S-100蛋白和凋亡基因相关产物Bcl-2、Fas、Bax表达水平变化,并用TUNEL法检测雪旺细胞凋亡指数.结果①试验组雪旺细胞数量术后24 h开始明显减少,术后8 d才开始重新增多.②S-100蛋白表达对照组变化无统计意义(P＞0.05),试验组则在术后1 h,21 d两个时间点变化有统计意义(P＜0.05).③雪旺细胞凋亡抑制基因产物Bcl-2表达,正常组双侧肢变化无差异(P＞0.05),而对照组术后6 h明显升高,术后24 h、4 d、21 d轻度增高(P＜0.01),试验组术后6 h,24 h,8 d,14 d,30 d进行性升高(P＜0.01).④雪旺细胞凋亡促进基因产物Bax表达,正常组双侧肢比较无差异(P＞0.05),而对照组术后6 h,3～21 d持续高表达(P＜0.01),试验组14 d开始进行性上升(P＜0.01).⑤雪旺细胞凋亡促进基因产物Fas表达,正常组双侧肢比较无差异(P＞0.05),对照组仅轻度增高(P＞0.05),而试验组术后12 h开始进行性升高(P＜0.01).⑥TUNEL法凋亡试剂盒原位检测显示正常组雪旺细胞凋亡发生率极低,双侧肢比较无差异(P＞0.05);试验组分别在术后6 h,24 h,2 d,21 d出现大量雪旺细胞凋亡阳性核(P＜0.01),高峰出现在华勒氏变性早期.结论成年大鼠坐骨神经横断后,远侧段创伤性华勒氏变性早期存在雪旺细胞凋亡高峰.并且雪旺细胞凋亡的发生,及凋亡相关促进基因Bax、Fas和抑制基因Bcl-2的表达均具有特定的时相性变化特点.     

新型组织工程化神经导管修复大鼠周围神经缺损

目的观察丝素/胶原蛋白支架联合许旺细胞(SCs)/脂肪源性干细胞(ADSCs)共培养所构建的新型组织工程化神经导管修复大鼠坐骨神经缺损的实验效果。方法2015年2月至2016年8月,分别体外分离、培养及纯化SD大鼠SCs和ADSCs,并将SCs与ADSCs按照2∶1的比例和丝素/胶原蛋白支架共培养,来构建新型组织工程化神经导管,用于修复大鼠坐骨神经10mm缺损。实验随机分为4组:单纯丝素/胶原支架移植组(Scaffold组)、组织工程化神经导管移植组(TENC组)、自体神经移植组(Autograft组)、未手术对照组(Normal组),每组10只大鼠。采用Instron5865力学试验机测试导管的力学性能,扫描电镜(SEM)观察导管内部空间结构及细胞的生长增殖情况,术后12周分别行电生理学及形态分析学等一系列检查评估神经再生情况,并采用单因素方差分析(one-wayANOVA)进行数据分析,如果组间差异有统计学意义,则进一步采用Turkey法进行两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果扫描电镜观察可见导管内部相通性良好,在三维的孔隙中及表面上有许多神经元样细胞生长并伸出长突起,细胞生长状况佳。力学试验机测试显示导管最大和平均弹性模量分别为(10.80±0.30)MPa、(8.14±0.20)MPa。根据再生神经大体观察、电生理学检查及形态学结果统计分析可得,各组实验动物都不同程度上实现缺损神经的修复再通。但从实验动物神经修复效果来讲,TENC组和Autograft组都较为相似,差异无统计学意义(P>0.05),但都优于Scaffold组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论丝素/胶原蛋白支架联合SCs/ADSCs共培养所构建的新型组织工程化神经导管具备初步生物神经样结构,且对大鼠坐骨神经缺损的再生修复具有良好的桥接及促进神经生长作用。