多重置换扩增结合短串联重复序列在植入前遗传学诊断中的应用

目的:探讨多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)结合短串联重复序列多态性在植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)中的应用。方法:采用多重置换扩增对单细胞进行全基因组扩增,针对单基因疾病和人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)配型选择位于致病基因内部或两侧的短串联重复序列位点进行单体型分析,同时对致病基因进行直接检测;针对染色体数量及结构异常或非整倍体筛查,选择位于相关染色体上的短串联重复序列位点进行等位基因数分析。结果:进行了以下5类12种类型植入前遗传学诊断的临床应用:(1)单基因疾病:脊髓性肌萎缩症、杜氏肌营养不良、X-连锁慢性肉芽肿、石骨症、骨软骨发育不全、X-连锁免疫缺陷综合征;(2)同时合并两种单基因疾病:α-和β-双重地中海贫血;(3)染色体罗氏易位;(4)单基因疾病结合HLA配型:β-地中海贫血、杜氏肌营养不良;(5)单基因疾病合并染色体异常:α-地中海贫血合并染色体罗氏易位、α-地中海贫血合并性染色体数目异常。对35个家系共进行了44个周期的PGD,共47个移植周期。MDA扩增成功率为96.4%(374/388),后续PCR扩增效率为97.1%,等位基因脱扣(allele drop out,ADO)率为12.6%(波动于0~47.5%),总体诊断效率为94.6%(367/388)。47个移植周期共移植91个胚胎,种植率为30.7%(28/91)。临床妊娠率为47.7%/PGD周期(21/44),共诞生了20个健康婴儿(12例单胎,4例双胎),5例继续妊娠。结论:采用多重置换扩增结合短串联重复序列多态性可建立一个通用的植入前遗传学诊断平台,其很大程度上缩短了新病种植入前遗传学诊断体系的研发时间,而且可同时进行两种或两种以上遗传学状态的诊断,也提高了诊断效率,有利于进一步拓宽植入前遗传学诊断的适应征。     

多重巢式聚合酶链反应在β地中海贫血植入前遗传学诊断中的应用

目的探讨应用多重巢式聚合酶链反应(PCR)技术在β地中海贫血(简称β地贫)植入前遗传学诊断(PGD)中的应用。方法获取β地贫基因携带者单个淋巴细胞,建立了稳定的单细胞多重巢式PCR检测技术,可同时检测β珠蛋白基因及与β珠蛋白基因紧密连锁的HumTH01基因,并对4例已出生的重型β地贫患儿及双方均为β地贫基因携带者的夫妇应用多重巢式PCR进行了β地贫的PGD。结果利用单细胞多重巢式PCR,可以同时检测中国人常见的16种β地贫突变类型,单个淋巴细胞平均扩增效率为91．3％,平均等位基因脱扣(ADO)率为17．0％。对4对夫妇进行4个周期PGD,共活检33个胚胎,获得33个卵裂球,其中30个卵裂球扩增成功,扩增效率为90．9％,ADO率为13．3％。26个胚胎经PCR分析后获得明确诊断,移植了8个胚胎,获得1例临床妊娠。孕17周时经脐带血穿刺,证实为完全正常胚胎,现已出生1名正常女婴。结论应用单细胞多重巢式PCR技术可对β地贫进行植入前遗传学诊断,达到优生目的。     

杜氏肌营养不良症(DMD)的植入前遗传学诊断

目的 对杜氏肌营养不良症(ducherule muscular dystrophy,DMD)进行植入前遗传学诊断(preim-plantafton genetic diagnosis,PGD),阻断DMD患儿的出生.方法 针对患者的DMD基因的48号外显子缺失位点采用巢式PCR分别对患者和携带者的单个淋巴细胞、行体外授精一胚胎移植治疗的健康志愿捐献者的单个卵裂球细胞进行扩增,建立稳定的经单细胞基因诊断DMD的方法 .再对在该中心进行超排和体外授精一胚胎移植治疗的DMD携带者的胚胎活检后完成PGD,根据诊断结果 选择健康的优质的胚胎移植入子宫.结果 携带者的单个淋巴细胞的PCR扩增成功率为90.5%(95/105),健康志愿捐献者的单个卵裂球细胞PCR扩增成功率为85.7%(54/63),假阳性率为0(0/28).分别对3例DMD携带者施行了植入前遗传学诊断,病例1移植了2枚未受累的优质胚胎,且成功妊娠单胎并已于2005年4月分娩了1个健康的女婴;病例2移植了2枚优良胚胎,不幸的是未能妊娠.病例3诊断为未受累的仅有的2枚胚胎因胚胎质量差而未能移植.结论 该组采用的方案可对DMD基因的48号外显子缺失突变的DMD家庭进行PGD,达到了阻断DMD惠儿出生的目的 .     

地中海贫血胚胎着床前行遗传学诊断2例报告

目的 探讨胚胎着床前遗传学诊断技术( PGD)阻断地中海贫血向下一代遗传的有效性. 方法 采用常规黄体期长方案促排卵,用卵胞浆内单精子显微注射法授精,第5天或第6天对囊胚活检3~5 个细胞后进行冷冻保存,活检细胞采用PCR及反向斑点杂交技术进行β-地中海贫血的遗传学检测. 结果 根据PGD结果及胚胎质量,对2例患者的可移植囊胚进行解冻并进行移植,均获得了临床妊娠;孕期抽取绒毛或羊水进行产前诊断,其结果与 PGD 的结果一致.结论 PGD是阻断地中海贫血向下一代遗传的有效手段.     

罗式易位携带者胚胎植入前遗传学诊断的研究

【目的】应用荧光原位杂交(FISH)技术对罗式易位携带者进行胚胎植入前遗传学诊断。【方法】分别用化学打洞法及机械打洞法对3例罗式易位t（13q14q）患者的体外受精的胚胎活检,用VysisLSI13q14,TelVysion14q探针对卵裂球进行FISH分析,选取正常或平衡的胚胎移植入子宫腔。【结果】3个周期共获卵23个,受精率79%。活检14个胚胎,其中化学打洞法活检9个胚胎,活检后胚胎继续分裂率67%;机械打洞法活检5个胚胎,活检后胚胎继续分裂率为40%。2个周期分别有1个胚胎显示正常或平衡,进行移植,其中1例获得妊娠,妊娠20周时经羊水细胞核型分析证实为正常。【结论】对罗式易位携带者进行胚胎植入前遗传学诊断,可以解决患者的生育障碍。     

α-地中海贫血种植前基因诊断妊娠成功

【目的】探讨种植前基因诊断的临床应用。【方法】对 1例夫妇均为东南亚缺失型α 地中海贫血携带者 ,经超排取卵、卵母细胞单精子显微注射受精及胚胎细胞活检 ,吸取的单个卵裂球采用针对α SEA基因的 gap PCR引物和荧光探针用荧光定量PCR技术进行诊断 ,将诊断为不致病的 3个胚胎进行宫腔内移植。【结果】胚胎移植后 7周B超诊断单胎妊娠 ,18周羊膜腔穿刺产前诊断证实为不致病胎儿。【结论】应用成熟的显微操作技术进行胚胎细胞活检 ,活检的单个卵裂球用荧光定量PCR技术进行诊断 ,获得国内首例α 地中海贫血胚胎种植前基因诊断后妊娠成功。     

α—地中海贫血种植前基因诊断妊娠成功

目的 探讨种植前基因诊断的临床应用。方法 对1例夫妇均为东南亚缺失型α－地中海贫血携带者，经超排取卵、卵母细胞单精子显微注射受精及胚胎细胞活检，吸取的单个卵裂球采有针对α－SEA基因的gap－PCR引物和荧光探针用荧光定量PCR技术进行诊断，将诊断不致病的3个胚胎进行宫腔内移植。结果 胚胎移植后7击B超诊断单胎妊娠，18周羊膜腔穿刺产前诊断证实为不致病胎儿。结论 应用成熟的显微操作技术进行胚胎细胞活检，活检的单个儿裂球用荧光定量PCR技术进行诊断，获得国内首例α－地中海贫血胚胎种植前基因诊断后妊娠成功。     

对曾育21三体综合征患儿者行胚胎种植前遗传学诊断获妊娠1例

目的在体外受精-胚胎移植过程中,对高危夫妇进行胚胎种植前遗传学诊断以避免21三体综合征患儿的出生。方法常规激素替代治疗,对患者夫妇行胞母细胞质内单精子注射(ICSI),正常受精培养到第3天,对6~10细胞期胚胎活检1个细胞,利用荧光原位杂交技术(FISH)进行胚胎种植前遗传学诊断(PGD),挑选染色体数目正常的胚胎移植入患者子宫。结果共对8个胚胎进行PGD,7个有诊断结果者中6个为正常胚胎、1个为21三体胚胎。挑选3个胚胎移植,获得妊娠并产下一健康男婴。结论应用FISH对染色体数目异常的遗传疾病,如21三体综合征,进行胚胎种植前遗传学诊断是切实可行的。     

罗式易位携带者胚胎植入前遗传学诊断的研究

[目的]应用荧光原位杂交（FISH）技术对罗式易位携带者进行胚胎植入前遗传学诊断。[方法]分别用化学打洞法及机械打洞法对3例罗式易位t(13q14q）患者的体外受精的胚胎活检,用Vysis LSI13q14,Tel Vysion14q探针对卵裂球进行FISH分析,选取正常或平衡的胚胎移植入子宫腔。[结果]3个周期共获卵23个,受精率79％。活检14个胚胎,其中化学打洞法活检9个胚胎,活检后胚胎继续分裂率67％;机械打洞法活检5个胚胎,活检后胚胎继续分裂率为40％。2个周期分别有1个胚胎显示正常或平衡,进行移植,其中1例获得妊娠,妊娠20周时经羊水细胞核型分析证实为正常。[结论]对罗式易位携带者者胚胎植入前遗传学诊断,可以解决患者的生育障碍。     

Preimplantation gender diagnosis by fluorescence in situ hybridization

目的：应用荧光原位杂交技术进行人类胚胎植入前性别诊断。方法：对2例甲型血友病基因携带、1例男性葡萄糖6磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺乏患和2例Y染色体异常的患进行了6个周期的超排卵治疗。胚胎活检后取单个细胞进行固定,然后用荧光原位杂交技术检测胚胎的性别,根据遗传学规律选择胚胎性别后将胚胎移植入子宫。结果：5例患经6个治疗周期共取卵123个。可供活检的胚胎共61个,活检成功率为86.9％,活检后继续分裂率为62.3％,活检细胞固定率为98.1％。我们共移植了16个女性胚胎和3个男性胚胎,获得1例生化妊娠和3例临床妊娠,分别在羊水细胞和减胎组织中证实诊断的准确性。结论：荧光原位杂交技术用于遗传病的种植前诊断准确有效。对血友病等进行植入前性别诊断能避免选择性流产和重型患儿的出生,有利于优生。     

Birth of healthy children after preimplantation diagnosis of β-thalassemia

Background Clinical programs for preventing β-thalassemia are presently based on prospective carrier screening and prenatal diagnosis. This paper report an achievement of a pregnancy with unaffected embryos using in vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET), in combination with preimplantation genetic diagnosis (PGD), for a couple at risk of having children with β-thalassemia.Methods A couple carrying different thalassemia mutations, both a codon 41-42 mutation and the IVS Ⅱ 654 mutation, received standard IVF treatment, with intracytoplasmic sperm injection, embryo biopsiy, single cell polymerase chain reaction (PCR) and DNA analysis. Only unaffected or carrier embryos were transferred to the uterine cavity. After confirmation of pregnancy, a prenatal diagnosis was performed.Results Of a total of 13 embryos analyzed for β-globin mutations, PGD indicated that 2 were normal,3 were affected, and 6 were carriers. Diagnosis could not be made in the other 2 embryos. Three embryos were transferred to the uterus on the third day after oocyte retrieval. Ultrasonography revealed a twin pregnancy with one blighted ovum. The prenatal genetic diagnosis revealed that both fetuses were unaffected, and two healthy boys were born, confirming the results of PGD.Conclusions We developed a single-cell based primer extension preamplification (PEP)-PCR assay for the detection of β-thalassemia mutations. The assays were efficient and accurate at all stages of the procedure, and resulted in the birth of PGD-confirmed β-thalassemia free children in China. PEP was used here in PGD for β-thalassemia.     

First unaffected pregnancy using preimplantation genetic diagnosis for sickle cell anemia.

CONTEXT: Sickle cell anemia is a common autosomal recessive disorder. However, preimplantation genetic diagnosis (PGD) for this severe genetic disorder previously has not been successful. OBJECTIVE: To achieve pregnancy with an unaffected embryo using in vitro fertilization (IVF) and PGD. DESIGN: Laboratory analysis of DNA from single cells obtained by biopsy from embryos in 2 IVF attempts, 1 in 1996 and 1 in 1997, to determine the genetic status of each embryo before intrauterine transfer. SETTING: University hospital in a large metropolitan area. PATIENTS: A couple, both carriers of the recessive mutation for sickle cell disease. INTERVENTIONS: Standard IVF treatment, intracytoplasmic sperm injection, embryo biopsy, single-cell polymerase chain reaction and DNA analyses, embryo transfer to uterus, pregnancy confirmation, and prenatal diagnosis by amniocentesis at 16.5 weeks' gestation. MAIN OUTCOME MEASURE: DNA analysis of single blastomeres indicating whether embryos carried the sickle cell mutation, allowing only unaffected or carrier embryos to be transferred. RESULTS: The first IVF attempt failed to produce a pregnancy. Of the 7 embryos analyzed in the second attempt, PGD indicated that 4 were normal and 2 were carriers; diagnosis was not possible in 1. Three embryos were transferred to the uterus on the fourth day after oocyte retrieval. A twin pregnancy was confirmed by ultrasonography, and subsequent amniocentesis revealed that both fetuses were unaffected and were not carriers of the sickle cell mutation. The patient delivered healthy twins at 39 weeks' gestation. CONCLUSION: This first unaffected pregnancy resulting from PGD for sickle cell anemia demonstrates that the technique can be a powerful diagnostic tool for carrier couples who desire a healthy child but wish to avoid the difficult decision of whether to abort an affected fetus.     

应用荧光聚合酶链反应对α地中海贫血进行植入前遗传学诊断

目的探讨应用跨越断裂点荧光聚合酶链反应（PCR）技术在α地中海贫血（简称α地贫）植入前遗传学诊断（PGD）中的应用。方法获取Ot地贫东南亚缺失型携带者单个淋巴细胞,建立了稳定的单细胞跨越断裂点荧光PCR检测技术,并对4对夫妇双方均为α地贫——SEA缺失型杂合子应用荧光PCR进行了α地贫的PGD。结果单个淋巴细胞平均扩增效率为90．0％（72／80）,平均等位基因脱扣（ADO）率为8．3％（6／72）。对4对夫妇进行4个周期PGO,共检测38个胚胎,获得38个卵裂球,其中34个卵裂球扩增成功,扩增效率为89．5％（34／38）,ADO率为5．9％（2／34）。经PCR分析,共获得11个正常胚胎,8个杂合子胚胎,15个重型地贫胚胎。移植了11个胚胎,获得2例临床妊娠。孕17周时经脐带血穿刺,分别证实为完全正常胚胎和杂合子胚胎,现已出生两名健康男婴。结论应用单细胞荧光PCR技术可对α地贫进行植入前遗传学诊断,达到优生的目的。     

TaqMan-MGB探针实时荧光PCR在β地中海贫血植入前诊断中的应用研究

目的建立单细胞MGB探针荧光PCR检测β地贫的方法以及在β地贫PGD中的应用研究。方法获取β地贫基因携带者单个淋巴细胞,建立稳定的单细胞MGB探针荧光PCR检测技术,并对2例双方均为β地贫基因携带者的夫妇应用MGB探针荧光PCR进行了β地贫的PGD。结果利用单细胞MGB探针荧光PCR检测了β地贫基因携带者的200个单个淋巴细胞的基因型,平均扩增效率为94%,平均等位基因脱扣(ADO)率为2.5%。对两对夫妇进行4个周期PGD,共活检16个胚胎,获得16个卵裂球,其中15个卵裂球扩增成功,扩增效率为93.8%,ADO率为6.2%。14个胚胎经PCR分析后获得明确诊断,移植了4个胚胎,获得1例临床妊娠。孕11周时经腹吸取绒毛,证实为完全正常胚胎,最终分娩了一正常女婴。结论应用单细胞MGB探针荧光PCR技术可对β地贫以及其它单基因遗传病进行植入前遗传学诊断,达到优生目的。     

用荧光原位杂交技术进行染色体异常者胚胎植入前遗传学诊断

目的：初步探索应用荧光原位杂交(FISH)技术为染色体异常患者进行胚胎植入前遗传诊断(PGD)。方法：针对染色体结构异常的种类．分别选择亚端粒探针及着丝粒探针，用荧光原位杂交技术为5例染色体异常患者进行植入前遗传学诊断。结果：5例患者共行7个PGD周期，共获卵134个，活检47个胚胎，FISH分析可供移植胚胎16个，6个移植周期移植其中15个胚胎，获得1例临床妊娠，并经产前诊断验证，已顺利诞生1健康男婴。结论：荧光原位杂交技术能有效地应用于染色体异常者胚胎植入前遗传学诊断。     

Preimplantation diagnosis for Fanconi anemia combined with HLA matching.

CONTEXT: The advent of single-cell polymerase chain reaction (PCR) has presented the opportunity for combined preimplantation genetic diagnosis (PGD) and HLA antigen testing. This is a novel and useful way to preselect a potential donor for an affected sibling requiring stem cell transplantation. OBJECTIVE: To perform in vitro fertilization (IVF) and preimplantation HLA matching combined with PGD for Fanconi anemia (FA). DESIGN: DNA analysis for the IVS 4 + 4 A-->T (adenine to thymine) mutation in the FA complement C (FANCC) gene in single blastomeres, obtained by biopsy of embryos, to identify genetic status and HLA markers of each embryo before intrauterine transfer. SETTING: In vitro fertilization programs at large medical centers in Chicago, Ill, and Denver, Colo. PARTICIPANTS: A couple, both carriers of the IVS 4 + 4 A-->T mutation in the FANCC gene with an affected child requiring an HLA-compatible donor for cord blood transplantation. MAIN OUTCOME MEASURES: DNA analysis of single blastomeres to preselect unaffected embryos representing an HLA match for the affected sibling. RESULTS: Of 30 embryos tested in 4 IVF attempts, 6 were homozygous affected and 24 were unaffected. Five of these embryos were also found to be HLA-compatible, of which 2 were transferred in the first and 1 in each of the other 3 cycles, resulting in a pregnancy and birth of an unaffected child in the last cycle. CONCLUSION: To our knowledge, this is the first PGD with HLA matching, demonstrating feasibility of preselecting unaffected embryos that can also be an HLA-compatible source for stem cell transplantation for a sibling.     

对曾育21三体综合征患儿者行胚胎种植前遗传学诊断获妊娠1例

目的 在体外受精－胚胎移植过程中，对高危夫妇进行胚胎种植前遗传学诊断以避免21三体综合征患儿的出生。方法 常规激素替代治疗，对患者夫妇行胞母细胞质内精子注射（ICSI），正常受精培养到第3天，对6－10细胞期胚胎活检1个细胞，利用荧光原位杂交技术（FISH）进行胚胎种植遗传学诊断（PGD），挑选染色体数目正常的胚胎移植入患者子宫。结果 共对8个胚胎进行PGD，7个有诊断结果者中7个为正常胚胎、1个为21三体胚胎。挑选3个胚胎移植，获得妊娠并产下一健康男婴。结论 应用FISH对染色体数目的遗传疾病，如21三体综合征，进行胚胎种植前遗传学诊断是切实可行的。     

224例冻融胚胎移植周期分析

目的：探讨胚胎冷冻时机对复苏后胚胎发育的可能影响，并分析移植胚胎数量和质量与冻融胚胎移植妊娠结果的关系。方法：（1）将224个冻融胚胎移植周期，根据冷冻时间分为第2天（D2组）97例，第3天（D3组）127例两组，回顾比较解冻后两组的胚胎存活率、胚胎完好率和临床妊娠率等.（2）比较了移植不同胚胎个数（3、2、1个）和优质胚胎个数（3、2、1、0个）的临床妊娠率。结果：（1）D2组胚胎完好率为54．28％，显著高于D3组的40．65％（P〈0．05），D2组的胚胎存活率、妊娠率、种植率、多胎率和流产率分别为82．57％、26．80％、13．01％、34．62％、11．54％，与D3组（82．17％、37．01％、17．66％、36．17％、17．02％）的差异均无显著性（P〉0．05）。（2）移植3、2、1个胚胎分别可获得34．62％、26．47％、12．5％的临床妊娠率，各组之间比较差异无显著性（P〉0．05）；移植3个或2个优质胚胎的临床妊娠率没有差异，但其临床妊娠率显著高于只移植1个或没有优质胚胎组。结论：胚胎冷冻时机对早期分裂胚胎的发育潜能没有影响。冻融胚胎移植周期的妊娠率与移植的优质胚胎数目有关。     

男性罗氏易位的临床特点及其胚胎着床前遗传学诊断

目的：分析男性罗氏易位的生育期临床特点,探讨胚胎着床前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis, PGD）技术在男性罗氏易位携带者中的临床应用。方法：2005年1月至2011年10月,共对80例男性罗氏易位携带者进行了96个PGD周期,选择正常或罗氏易位核型的胚胎移植。分析男性罗氏易位携带者的临床特点及其PGD周期的临床特点。结果：80对男性罗氏易位者夫妇中,62对夫妇因男方严重少、弱精症而致原发不孕,占77.50%（62/80）;8对夫妇因男方继发少、弱精症而出现继发不孕,占10%（8/80）;10对夫妇因反复自然流产就诊,占12.50%（10/80）。80例男性罗氏易位携带者中,（13;14）易位有50例,占62.50%（50/80）;（14;21）易位有15例,占18.75%（15/80）。96个PGD周期中,17个周期无胚胎可以移植,79个周期进行了胚胎移植,25个PGD周期获得临床妊娠,妊娠率31.65%（25/79）。至目前,共有18对夫妇分娩了21个健康子代,3对夫妇持续妊娠中。结论：少、弱精症是男性罗氏易位携带者不育的主要原因,辅助生育技术可以解决其不育问题。PGD技术可以为男性罗氏易位携带者获得健康的子代提供帮助,减少了女方流产及分娩畸形儿的发生率。