一种新型增殖型腺病毒治疗肝癌的体外研究

目的 评价增殖腺病毒CNHK500对肝癌细胞的治疗效果。方法 利用病毒增殖实验、细胞活力实验(MTT)、蛋白印迹分析来检测增殖病毒CNHK500在端粒酶阳性的肝癌细胞株HepGⅡ、Hep3B、SMMC7721及正常细胞中选择性增殖和溶解细胞的特性。结果 CNHK500感染人肝癌细胞株HepGⅡ、Hep3B、SMMC7721细胞后大量增殖,在感染后96小时增殖倍数分别为52000、396984．9和632911．3倍,同野生型5型腺病毒(wtAd5)类似。然而在正常细胞中,CNHK500的增殖能力较wtAd5大大减弱,感染96小时后仅增殖3．1～100倍,而wtAd5却高达3160～17357倍。MTT实验观察到在肝癌细胞HepGⅡ和Hep3B中,感染后第7天达到半数杀伤的MOI值(IC50)分别为2和0．01,而在正常成纤维细胞BJ细胞中却高达1000。在常氧情况下,用蛋白印迹可在肿瘤细胞中检测到腺病毒ElA蛋白的表达,但在正常细胞却检测不到。EIB蛋白仅在缺氧条件下(0．1％O2)的肿瘤细胞中表达。结论 实验结果表明CNHK500能有效地选择性在肝癌细胞中增殖、复制、杀伤,而在正常细胞中增殖和溶解细胞能力却大大减弱。联合治疗基因,CNHK500可能为肝癌的治疗提供一种新的策略。     

慢病毒载体介导端粒酶逆转录酶小干扰RNA治疗肝癌的实验研究

目的 探讨慢病毒介导的端粒酶逆转录酶(hTERT)小干扰RNA(siRNA)对肝癌细胞生长的影响.方法 构建携带hTERT siRNA的慢病毒表达载体,在体外转染人肝癌HepG2细胞系,以MTT法测定细胞生长变化,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测hTERT mRNA的表达.将转染hTERT siRNA的HepG2细胞,接种于裸鼠腋窝皮下,观察移植瘤生长情况.取移植瘤组织,常规HE染色,行组织学观察,应用原位末端标记(TUNEL)技术检测细胞凋亡情况.结果 hTERT siRNA转染HepG2细胞后,随着时间的延长,对细胞增殖的抑制作用逐渐增强,到第8天,干扰组细胞抑制率为57.5%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01).RT-PCR产物凝胶电泳图显示,hTERT siRNA转染后,肿瘤细胞的端粒酶活性明显下降.转染后72 h,干扰组hTERT mRNA的表达水平为0.035±0.007,明显低于空载体对照组(0.151±0.016)和空白对照组(0.155±0.014,均P<0.01).转染细胞皮下接种后,干扰组的肿瘤生长速度明显慢于两个对照组,随着时间的延长,差异越来越明显.移植瘤组织常规HE染色显示,组织坏死增多,周围炎性细胞浸润.TUNEL检测结果显示,细胞凋亡增多,增殖减慢.结论 慢病毒介导的hTERT siRNA转染能明显抑制肝癌细胞的生长.     

非增殖型腺病毒和肿瘤特异性增殖型腺病毒携带IL-12基因治疗肝癌的体外实验研究

目的 比较携带小鼠IL-12基因的增殖型腺病毒(CNHK200-mIL12)和非增殖型腺病毒(Adv-mIL12)对IL-12基因的表达以及对肝癌细胞的杀伤能力。方法 通过MTT以及病毒增殖实验．评估E1B-55000缺陷的增殖型腺病毒CNHK200-mIL12和ONYX-015(dl1520),以及非增殖型腺病毒Adv-mIL12对人正常肝细胞株LO2、人肝癌细胞株HepG2和Hep3B的杀伤能力。采用蛋白质印迹分析和ELISA法,检测CNHK200-mIL12和Adv-mill2感染HepG2和Hep3B细胞后,小鼠IL-12基因的表达情况。结果 CNHK200-mIL12感染HepG2和Hep3B细胞后大量增殖,在感染后96h时检测,分别增殖3160倍和630倍,在极低的MOI(空斑形成单位／细胞)值和极短的时间内(HepG2细胞：MOI=0．2,第4天;Hep3B细胞：MOI=0．005,第2天),可大量杀伤肿瘤细胞,而对LO2细胞无明显杀伤。CNHK200-miLl2和Adv-mIL12感染HepG2细胞后,其IL-12基因表达量,前者是后者的101倍;感染Hep3B细胞后,前者是后者的20倍。结论 增殖型腺病毒载体对肿瘤细胞的杀伤能力和目的基因的表达,明显优于传统的非增殖型腺病毒载体,应用前景广阔。     

特异性增殖型腺病毒CNHK200-mIFN-γ表达mIFN-γ及体外肿瘤杀伤实验

目的:构建增殖型腺病毒CNHK200-mIFN-γ和增殖缺陷型腺病毒AdEasy-mIFN-γ,比较两者在肿瘤细胞中表达mIFN-γ蛋白的能力以及CNHK200-mIFN-γ,ONYX-015及野生型腺病毒Ad5在正常及肿瘤细胞中的增殖力,进一步观察其抗瘤效果.方法:以病毒增殖试验检测病毒在细胞中的增殖能力;透射电镜观察CNHK200-mIFN-γ在Hep3B细胞中的增殖复制;检测病毒感染肿瘤细胞后mIFN-γ的表达;CPE实验观察增殖病毒对细胞的杀伤效应.结果:CNHK200-mIFN-γ和ONYX-015仅在肿瘤细胞中增殖,且前者增殖力较强.CNHK200-mIFN-γ在肿瘤细胞中表达mIFN-γ,且表达量与病毒增殖密切相关,而AdEasymIFN-γ在肿瘤细胞中的mIFN-γ表达几乎不能测到.ONYX-015与CNHK200-mIFN-γ对正常的细胞无杀伤性,但能有效地杀伤癌细胞.结论:外源基因mIFN-γ的插人没有改变增殖病毒在肿瘤细胞中选择性增殖的特性.增殖型腺病毒CNHK200-mIFN-γ具有良好的肿瘤选择性及增殖性,且可以有效表达mIFN-γ,并且有效杀伤癌细胞,显示其良好的临床应用前景.     

肝癌的分子靶向治疗研究进展

不能手术和已转移的原发性肝细胞癌预后很差,放化疗难以使患者受益。近年来,分子靶向治疗对一些肿瘤已取得突破性进展,肝癌的分子靶向治疗也在临床试验中取得了令人鼓舞的结果。目前的肝癌临床研究主要针对EGFR、VEGF/VEGFR、Raf/MAPK-ERK、HGF、乙肝表面抗原等靶点。本文针对肝癌的分子靶向治疗的研究进展进行了综述。     

经皮微波热凝固治疗肝癌的疗效观察

目的:观察超声引导经皮肝穿刺微波热凝固治疗肝癌的疗效。方法:21 例肝癌患者经皮肝穿刺植入频率为2 450 MHz的单导或双导微波天线,在丙泊酚静脉麻醉下对肿瘤进行一次整体覆盖原位热凝固治疗。结果:对21 例患者的23 个瘤体进行28 次治疗,平均随访6.7 个月,16 例生存,4 例死亡,1 例失访,术后AFP正常或明显下降,10 个瘤径≤5.0 cm的瘤体一次整体凝固,13 个瘤径>5.0 cm的瘤体术后肿块内血流信号大部分消失,治疗前后肝功能无明显变化,16 例次术后2 d ~ 6 d中度发热,1 例出现胸腔积液。结论:超声引导经皮肝穿刺微波热凝固治疗肝癌近期疗效满意,是一种定位准确、操作简单、安全价廉、可重复的微创手术。     

经皮微波凝固治疗原发性肝癌

经皮微波凝固（PMCT）治疗原发性肝癌不仅能用影像检查及病理活检等方法证实肿瘤凝固坏死情况，而且能使肿瘤周围免疫细胞明显增多、增大、功能增强，最终显著提高患者生存率，降低肝癌复发率。目前PMCT治疗肝癌临床应用尚存在一些问题，有待进一步研究解决。     

肝癌组织细胞质和细胞核中端粒酶活性比较

 目的 比较肝癌组织细胞质和细胞核中端粒酶活性。方法 以端粒酶延伸产物液体闪烁计数法和端粒重复序列扩增法分别检测肝癌组织细胞质与细胞核中端粒酶活性。结果 细胞质抽提液端粒酶活性（ｃｐｍ）为３２３９±９０１，细胞核抽提液为２５１４±７２２，细胞核中端粒酶活性显著低于细胞质。结论 肝癌组织细胞质中端粒酶活性高于细胞核，细胞质可能是端粒酶的装配贮存部位。     

新型肝癌组织的体外三维培养模型

目的:利用肝癌组织进行体外的三维（three-dimension,3D）组织块培养,通过添加PD98059和霍乱毒素（cholera toxin,CT）优化培养条件,建立一种高活性的肝癌组织体外培养模型。方法:收集中山大学肿瘤防治中心肝胆科的肝癌组织标本,经清洗、冻存、复苏等处理后分为对照组、PD组、CT组、PD+CT组,同时进行体外的二维（two-dimension,2D）和三维培养。各组组织采用DNA断裂的原位末端标记法（TUNEL）检测组织细胞凋亡情况,qRT-PCR检测BCL-2、BID、Caspase 3、Cyclin D1、CDK2、ELK-1、C-FOS、C-MYC、C-JUN等相关基因的mRNA表达水平,免疫荧光染色检测BCL-2和cleaved caspase-3蛋白表达情况,筛选并确定最优的体外培养方法。结果:3D培养组的组织细胞凋亡均少于2D培养组;PD98059通过上调BCL-2蛋白的表达,下调cleaved caspase-3蛋白的表达,激活MEK/ERK下游基因,从而减少体外培养的组织细胞凋亡,增强其抗凋亡能力;霍乱毒素通过上调Cyclin D1、CDK2的基因表达,促进其增殖。结论:我们开发了一种新型肝癌组织的体外三维培养模型,它可以作为进一步的药物试验和人源性异种移植(PDX)模型的工具。     

肿瘤选择性增殖腺病毒CNHK300 治疗乳腺癌的体外实验研究

Objective： To evaluate the tumor selectivity and therapeutic efficiency of replication-competent adenovirus CNHK300 on human breast cancer cells. Methods： RT-PCR was used to detect the hTERT mRNA activity in various breast cancer and normal fibroblast cell lines. Virus proliferation assay, cell viability assay and Western blot were applied to evaluate the proliferation and cytolysis selectivity of CNHK300. Results： The telomerase activity of MCF-7, BT-549 and SK-BR-3 was positive, while telomerase in MRC-5 and BJ was negative. The progeny virus titers in MCF-7, BT-549 and SK-BR-3 after 48 h of CNHK300 exposure was 40 625, 1 265 and 20 000 fold higher than those of 0 h, even slightly higher than those of wtAd5 （except in SK-BR-3）. ONYX-015 virus proliferation ability was weaker than that of CNHK300 in cancer cells. However, CNHK300 exhibited attenuated replicative ability as compared with wtAd5 in MRC-5 and BJ. The CNHK300 replicatative multiple was 63 and 192 fold at 48 h respectively, while the wtAd5 still multiplied 3 160-4 846 fold. CNHK300 could cause about half of breast cancer cells to die within 7 days at MOI 10 pfu/cell and below, whereas the IC50 in BJ and MRC-5 was as high as MOI 100 pfu/cell. CNHK300 E1A protein could be detected in breast cancer cells and 293 cells but not in normal fibroblast cells. Conclusion： hTERT promoter can successfully modulate the CNHK300 to be selectively replicated in breast cancer cells positive for telomerase, which may be a potential treatment strategy in breast cancer.     

肿瘤选择性增殖腺病毒CNHK300治疗乳腺癌的体外实验研究(英文)

目的观察肿瘤选择性增殖腺病毒 CNHK300对乳腺癌的选择性杀伤作用。方法用 RT-PCR 方法检测各种细胞株的端粒酶活性;CNHK300、ONYX-015(E1B 55 KDa 蛋白缺失的2型和5型嵌合型腺病毒)、wtAd5(野生型腺病毒)分别行病毒增殖实验和细胞生长抑制实验,验证 CNHK300选择性复制和杀伤能力;Western Blot 检测腺病毒E1A 在细胞中的表达。结果乳腺癌细胞株 MCF-7、BT-549和 SK-BR-3端粒酶 hTERT mRNA 均为阳性表达,而正常成纤维细胞株 MRC-5和 BJ 端粒酶hTERT mRNA 为阴性。CNHK300在乳腺癌细胞 MCF-7、BT-549和 SK-BR-3中48 h 复制倍数分别为40 625、1265和20000倍,与wtAd5的增殖能力相似,较 ONYX-015增殖能力强,在 MCF-7和 BT-549细胞中复制能力甚至强于野生型腺病毒。然而,在正常成纤维细胞 MRC-5和 BJ 中 CNHK300病毒增殖能力减弱,48 h 增殖倍数为63～192倍,而 wtAd5增殖仍可高达3160～4846倍CNHK300 MOI 10 PFU/cell 作用7天,可有效杀伤半数乳腺癌细胞,与 ONYX-015相比,CNHK300具有更强的肿瘤杀伤能力CNHK300对正常成纤维细胞的杀伤力较 wtAd5明显减弱,CNHK300在 MOI 100 PFU/cell 时 BJ 细胞存活率50%以上。正常成纤维细胞株中未检测到 CNHK300 E1A 基因表达,在293细胞和感染 CNHK300的乳腺癌细胞株中能够检测到 E1A 基因表达。结论 hTERT 启动子可成功地调控腺病毒 CNHK300选择性在端粒酶阳性的乳腺癌细胞中复制,并产生溶瘤作用。可望成为治疗乳癌的一种新的治疗策略。     

选择性增殖腺病毒CNHK500治疗乳腺癌的实验研究

目的: 观察选择性增殖腺病毒CNHK500对乳腺癌的特异性杀伤作用.方法: 行病毒增殖实验和细胞生长抑制实验,验证CNHK500选择性复制和杀伤能力; Western blot检测腺病毒E1A和E1B在细胞中的表达.结果: CNHK500在乳腺癌细胞中复制能力与野生型腺病毒wtAd5相似,较ONYX-015增殖能力强.在正常成纤维细胞中CNHK500病毒增殖能力明显减弱, 较wtAd5增殖能力弱1 000倍左右.CNHK500可有效杀伤乳腺癌细胞株;而CNHK500对正常成纤维细胞的杀伤力较wtAd5减弱约100倍.CNHK500病毒的E1A可以选择性在端粒酶阳性的乳腺癌细胞株中表达,在端粒酶阴性的正常成纤维细胞株BJ中不表达, CNHK500可以选择性地在缺氧条件下表达E1B.动物实验结果显示,静脉注射CNHK500可以显著抑制MCF-7乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的生长,治疗效果与给药剂量相关.结论: 肿瘤选择性增殖腺病毒CNHK500可选择性在端粒酶阳性的乳腺癌细胞中复制,并产生体内外杀伤作用.     

Reversal of Adriamycin Resistance of Hepatocellular Carcinoma by Targeting with Recombined Adenovirus Caning Antisense mdr1 RNA

OBJECTIVE Chemotherapy is an important therapy for hepatocellular carcinoma (HCC). However, it is not effective in many cases due to recurrence and metastasis even if the initial treatment produces a response. Multidrug resistance (MDR) is considered to be one of the considerable causes. The aim of this study was to reverse MDR of HepG2/ADM cells by blocking mdr1 with an adenovirus vector carrying antisense mdr1 in a tumor transplantated in athymic mice. METHODS pCMV IE was removed from the pshuttle vector. A 0.3 kb AFP promoter was inserted into the pshuttle vector and pCMV changed into pAFP. The pAFP and asmdr1 PCR products were doubly digested with Kpnl and Apal, the digested products were ligated by T4 ligase, the asmdrl gene was inserted into pAFP and a newly plasmid pAFP-asmdr1 was constructed. Following digestion with PI-Scel/l-Ceu l, pAFP-asmdr1 was ligated with Adeno-X genome DNA and amplified in E.coli XL 1-Blue. The HEK293 cells were transfected and virus collected. The HepG2 MDR cells (HepG2/ADM) were induced by graded resistance to ADM and were inoculated into athymic mice. After adeno-asmdr1 was injected, the expression of mdr1 -mRNA and the volume of the transplantated tumor and its cells were observed. RESULTS Following injection with Adeno-asmdr1, the tumor volume in the ADM Adeno-asmdr1 group did not increase. However the tumor volume in the PBS plus ADM group did significantly increase (P<0.05). In the tumor xenograft cells, mdr1 mRNA in the xenografts was assessed by RT-PCR and was found to be reduced at 1 week and 4 weeks in the ADM asmdr1 group, but it was stable in the ADM group. It was only 20% in the ADM asmdr1 group compared to the ADM group at the 4th week (P<0.05). Evidence of apoptosis was observed in the tumor xenograft cells treated with Adeno-asmdr1, but there was rare or no apoptosis in the group treated with ADM and PBS. CONCLUSION Adenovirus carrying antisense mdr1 RNA can partially reverse the MDR of HepG2/ADM cells and inhibit tumor growth by down-regulating mdr1 mRNA resulting in tumor cell apoptosis.     

柯萨奇病毒-腺病毒受体在结肠癌组织中的表达及意义

目的：柯萨奇病毒-腺病毒受体（coxsackie and adenovirus receptor，CAR）介导腺病毒与靶细胞之间的粘附，是腺病毒转染靶细胞的限速因子。本文分析CAR在瘤旁上皮组织、结肠肿瘤原发灶和淋巴结转移灶中的表达．为设计腺病毒载体基因治疗方案提供依据。方法：采用免疫组织化学方法检测62例结肠癌组织中CAR的表达．分析CAR表达与临床病理特征的关系。结果：与瘤旁上皮组织相比，肿瘤组织普遍存在CAR表达下调．但CAR在原发灶和淋巴结转移灶的表达水平无明显差异。CAR的表达水平与患者年龄及肿瘤大小相关。结论：结肠癌组织中存在CAR表达下调，提示在设计腺病毒载体基因治疗方案时应充分考虑CAR表达变化对疗效的影响.     

腺病毒介导microRNA-99a过表达抑制肝癌细胞生长

目的:利用腺病毒介导microrRNA-99a(miR-99a)的过表达,观察miR-99a对肝癌细胞生长的抑制作用,探讨一种腺病毒介导miRNA治疗肿瘤的新方法。方法:qRT-PCR检测正常肝细胞系L-02和肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721、Hep3B和Huh7细胞中miR-99a的表达,构建含miR-99a的重组5型腺病毒Ad5-miR-99a。用空载腺病毒Ad-blank和Ad5-miR-99a分别感染Huh7细胞,MTT法和集落形成实验检测miR-99a过表达对Huh7细胞生长的抑制作用。结果:与正常肝细胞L02和其他肝癌细胞相比,miR-99a在肝癌Huh7细胞中表达量相对最低(P<0.01)。成功构建重组腺病毒Ad5-miR-99a,Ad5-miR-99a感染Huh7细胞后,miR-99a可在Huh7细胞中稳定高表达。集落形成实验和MTT实验显示,相对于Ad-blank组,Ad5-miR-99a可显著抑制Huh7细胞的生长和集落形成(P<0.01)。结论:成功构建重组腺病毒Ad5-miR-99a,miR-99a能有效抑制肝癌细胞的增殖,Ad5-miR-99a有可能成为治疗肝癌的新药物。     

Rb基因导入对膀胱癌细胞生长的抑制作用

由于免疫原性,鼠源性单克隆抗体在人体疾病治疗方面受到限制,运用基因重组技术,将抗体轻链、重链可变区基因连接,构建单链Fv(ScFv)基因.表达制备ScFv片段,由于其分子小,免疫原性弱,有潜在应用前景.本实验将获得的抗人肺癌单克隆抗体轻重链可变区基因,通过Linker基因序列连接并克隆至pIg20表达载体,表达制备抗人肺癌scFv融合蛋白.现报道如下.l 材料与方法1.1 抗人肺癌单克隆抗体3D_3(McAb3D_3)重链可变区基因(VH)克隆至表达载体pIg20,以SmaⅠ,XbaⅠ分别双酶切VH及pIg20质粒,以粘末端方式,将SmaⅠ-VH-Xba片段连接到pIg20载体,连接产物电穿孔法转染BL21菌,筛选鉴定.阳性子命名为pIgVH.1.2 将McAb3D_3轻链可变区基因(VL)克隆至pIgVH,以BgLⅡ、NcoⅠ分别消化中pIgVH及VL,以粘     

抗CD3或B7.1与CD28共刺激PBLs膜表面分子表达与肝癌细胞凋亡的相关性

为探讨腺病毒载体介导的外源性Rb基因导入对膀胱癌细胞生长的抑制作用,为膀胱癌的基因治疗提供实验依据,构建了Rb基因的复制缺陷型重组腺病毒载体.体外转染人膀胱癌细胞株EJ.应用免疫组化法、免疫印迹及聚合酶链反应技术检测外源性Rb基因腺病毒载体的转染效率及Rb基因表达效果;用流式细胞仪分析细胞周期;以细胞计数及同位素掺入技术观察外源性Rb基因对EJ细胞生长的抑制效果.结果显示腺病毒载体可有效地将外源基因导入EJ细胞.Rb基因重组腺病毒载体转染细胞后,胞内DNA合成减少,细胞生长受到抑制.流式细胞仪分析显示68%的EJ细胞生长停滞在GO/GI期.结果提示,外源性Rb基因重组腺病毒载体转染膀胱癌细胞可有效抑制细胞生长