一种新型增殖型腺病毒治疗肝癌的体外研究

目的 评价增殖腺病毒CNHK500对肝癌细胞的治疗效果。方法 利用病毒增殖实验、细胞活力实验(MTT)、蛋白印迹分析来检测增殖病毒CNHK500在端粒酶阳性的肝癌细胞株HepGⅡ、Hep3B、SMMC7721及正常细胞中选择性增殖和溶解细胞的特性。结果 CNHK500感染人肝癌细胞株HepGⅡ、Hep3B、SMMC7721细胞后大量增殖,在感染后96小时增殖倍数分别为52000、396984．9和632911．3倍,同野生型5型腺病毒(wtAd5)类似。然而在正常细胞中,CNHK500的增殖能力较wtAd5大大减弱,感染96小时后仅增殖3．1～100倍,而wtAd5却高达3160～17357倍。MTT实验观察到在肝癌细胞HepGⅡ和Hep3B中,感染后第7天达到半数杀伤的MOI值(IC50)分别为2和0．01,而在正常成纤维细胞BJ细胞中却高达1000。在常氧情况下,用蛋白印迹可在肿瘤细胞中检测到腺病毒ElA蛋白的表达,但在正常细胞却检测不到。EIB蛋白仅在缺氧条件下(0．1％O2)的肿瘤细胞中表达。结论 实验结果表明CNHK500能有效地选择性在肝癌细胞中增殖、复制、杀伤,而在正常细胞中增殖和溶解细胞能力却大大减弱。联合治疗基因,CNHK500可能为肝癌的治疗提供一种新的策略。     

慢病毒载体介导端粒酶逆转录酶小干扰RNA治疗肝癌的实验研究

目的 探讨慢病毒介导的端粒酶逆转录酶(hTERT)小干扰RNA(siRNA)对肝癌细胞生长的影响.方法 构建携带hTERT siRNA的慢病毒表达载体,在体外转染人肝癌HepG2细胞系,以MTT法测定细胞生长变化,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测hTERT mRNA的表达.将转染hTERT siRNA的HepG2细胞,接种于裸鼠腋窝皮下,观察移植瘤生长情况.取移植瘤组织,常规HE染色,行组织学观察,应用原位末端标记(TUNEL)技术检测细胞凋亡情况.结果 hTERT siRNA转染HepG2细胞后,随着时间的延长,对细胞增殖的抑制作用逐渐增强,到第8天,干扰组细胞抑制率为57.5%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01).RT-PCR产物凝胶电泳图显示,hTERT siRNA转染后,肿瘤细胞的端粒酶活性明显下降.转染后72 h,干扰组hTERT mRNA的表达水平为0.035±0.007,明显低于空载体对照组(0.151±0.016)和空白对照组(0.155±0.014,均P<0.01).转染细胞皮下接种后,干扰组的肿瘤生长速度明显慢于两个对照组,随着时间的延长,差异越来越明显.移植瘤组织常规HE染色显示,组织坏死增多,周围炎性细胞浸润.TUNEL检测结果显示,细胞凋亡增多,增殖减慢.结论 慢病毒介导的hTERT siRNA转染能明显抑制肝癌细胞的生长.     

非增殖型腺病毒和肿瘤特异性增殖型腺病毒携带IL-12基因治疗肝癌的体外实验研究

目的 比较携带小鼠IL-12基因的增殖型腺病毒(CNHK200-mIL12)和非增殖型腺病毒(Adv-mIL12)对IL-12基因的表达以及对肝癌细胞的杀伤能力。方法 通过MTT以及病毒增殖实验．评估E1B-55000缺陷的增殖型腺病毒CNHK200-mIL12和ONYX-015(dl1520),以及非增殖型腺病毒Adv-mIL12对人正常肝细胞株LO2、人肝癌细胞株HepG2和Hep3B的杀伤能力。采用蛋白质印迹分析和ELISA法,检测CNHK200-mIL12和Adv-mill2感染HepG2和Hep3B细胞后,小鼠IL-12基因的表达情况。结果 CNHK200-mIL12感染HepG2和Hep3B细胞后大量增殖,在感染后96h时检测,分别增殖3160倍和630倍,在极低的MOI(空斑形成单位／细胞)值和极短的时间内(HepG2细胞：MOI=0．2,第4天;Hep3B细胞：MOI=0．005,第2天),可大量杀伤肿瘤细胞,而对LO2细胞无明显杀伤。CNHK200-miLl2和Adv-mIL12感染HepG2细胞后,其IL-12基因表达量,前者是后者的101倍;感染Hep3B细胞后,前者是后者的20倍。结论 增殖型腺病毒载体对肿瘤细胞的杀伤能力和目的基因的表达,明显优于传统的非增殖型腺病毒载体,应用前景广阔。     

特异性增殖型腺病毒CNHK200-mIFN-γ表达mIFN-γ及体外肿瘤杀伤实验

目的:构建增殖型腺病毒CNHK200-mIFN-γ和增殖缺陷型腺病毒AdEasy-mIFN-γ,比较两者在肿瘤细胞中表达mIFN-γ蛋白的能力以及CNHK200-mIFN-γ,ONYX-015及野生型腺病毒Ad5在正常及肿瘤细胞中的增殖力,进一步观察其抗瘤效果.方法:以病毒增殖试验检测病毒在细胞中的增殖能力;透射电镜观察CNHK200-mIFN-γ在Hep3B细胞中的增殖复制;检测病毒感染肿瘤细胞后mIFN-γ的表达;CPE实验观察增殖病毒对细胞的杀伤效应.结果:CNHK200-mIFN-γ和ONYX-015仅在肿瘤细胞中增殖,且前者增殖力较强.CNHK200-mIFN-γ在肿瘤细胞中表达mIFN-γ,且表达量与病毒增殖密切相关,而AdEasymIFN-γ在肿瘤细胞中的mIFN-γ表达几乎不能测到.ONYX-015与CNHK200-mIFN-γ对正常的细胞无杀伤性,但能有效地杀伤癌细胞.结论:外源基因mIFN-γ的插人没有改变增殖病毒在肿瘤细胞中选择性增殖的特性.增殖型腺病毒CNHK200-mIFN-γ具有良好的肿瘤选择性及增殖性,且可以有效表达mIFN-γ,并且有效杀伤癌细胞,显示其良好的临床应用前景.     

肝癌的分子靶向治疗研究进展

不能手术和已转移的原发性肝细胞癌预后很差,放化疗难以使患者受益。近年来,分子靶向治疗对一些肿瘤已取得突破性进展,肝癌的分子靶向治疗也在临床试验中取得了令人鼓舞的结果。目前的肝癌临床研究主要针对EGFR、VEGF/VEGFR、Raf/MAPK-ERK、HGF、乙肝表面抗原等靶点。本文针对肝癌的分子靶向治疗的研究进展进行了综述。     

经皮微波热凝固治疗肝癌的疗效观察

目的:观察超声引导经皮肝穿刺微波热凝固治疗肝癌的疗效。方法:21 例肝癌患者经皮肝穿刺植入频率为2 450 MHz的单导或双导微波天线,在丙泊酚静脉麻醉下对肿瘤进行一次整体覆盖原位热凝固治疗。结果:对21 例患者的23 个瘤体进行28 次治疗,平均随访6.7 个月,16 例生存,4 例死亡,1 例失访,术后AFP正常或明显下降,10 个瘤径≤5.0 cm的瘤体一次整体凝固,13 个瘤径>5.0 cm的瘤体术后肿块内血流信号大部分消失,治疗前后肝功能无明显变化,16 例次术后2 d ~ 6 d中度发热,1 例出现胸腔积液。结论:超声引导经皮肝穿刺微波热凝固治疗肝癌近期疗效满意,是一种定位准确、操作简单、安全价廉、可重复的微创手术。     

经皮微波凝固治疗原发性肝癌

经皮微波凝固（PMCT）治疗原发性肝癌不仅能用影像检查及病理活检等方法证实肿瘤凝固坏死情况，而且能使肿瘤周围免疫细胞明显增多、增大、功能增强，最终显著提高患者生存率，降低肝癌复发率。目前PMCT治疗肝癌临床应用尚存在一些问题，有待进一步研究解决。     

超声引导下射频消融治疗肝癌的体外研究

目的探索超声引导下射频消融治疗肝癌的有效消融模式。方法观察人肝癌细胞HepG2和人永久化肝细胞LO2经高温处理后的形态变化,采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测其增殖能力。收集47℃处理后仍然存活的HepG2细胞(ΔHepG2细胞)和LO2细胞(ΔLO2细胞),行二次高温处理,采用CCK-8法检测其增殖能力。在离体猪肝的不同位置进行消融,比较超声声像图汽化区与肉眼观消融灶的一致性,观察声像图汽化区各区域的温度。结果水浴加热至50℃后,随着培养时间的延长,HepG2和LO2细胞的贴壁细胞数目愈来愈少,且逐渐失去正常细胞形态。水浴加热至50℃及以上后,HepG2、LO2、ΔHepG2和ΔLO2细胞的细胞增殖率降低,与37℃组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05),并对细胞产生不可逆性损伤。声像图中汽化区横径与肉眼观消融灶横径较为一致,差异均无统计学意义(均P>0.05)。射频消融9 min时,超声图像上高回声团边缘及其内部猪肝组织温度均≥53℃,为有效消融时间。结论初始功率200 W、目标温度105℃,当有效消融时间持续9 min以上时,超声声像图汽化区内的肝癌细胞均可发生不可逆性损伤。     

醋酸甲地孕酮联合三氧化二砷对肝癌HepG2细胞株体外抑制作用的研究

目的 探讨醋酸甲地孕酮（MA）联合三氧化二砷（As2O3）对肝癌HepG2细胞株体外增殖的影响及其可能机制。方法 将对数生长期HepG2细胞分为4组：MA单药组、As2O3单药组、MA+As2O3联合组和对照组,根据前期研究结果确定药物剂量分别为75.0 μmol/L MA、1.0 μg/ml As2O3,对照组加入等量细胞培养液。24 h后采用CCK-8方法、流式细胞学检测及Western blotting检测MA单药组、As2O3单药组及MA+As2O3联合组对HepG2细胞增殖、细胞凋亡及X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）表达的影响。结果CCK-8法显示MA+As2O3组较MA或As2O3单药组均能够明显抑制HepG2细胞生长;流式细胞仪结果显示MA+As2O3联合组的细胞凋亡率高于MA或As2O3单药组。MA+As2O3作用后XIAP表达较MA或As2O3单药组降低。结论MA联合As2O3能够发挥对HepG2细胞协同抑制作用,其中诱导细胞凋亡可能是其机制之一。     

肿瘤选择性增殖腺病毒CNHK300 治疗乳腺癌的体外实验研究

Objective： To evaluate the tumor selectivity and therapeutic efficiency of replication-competent adenovirus CNHK300 on human breast cancer cells. Methods： RT-PCR was used to detect the hTERT mRNA activity in various breast cancer and normal fibroblast cell lines. Virus proliferation assay, cell viability assay and Western blot were applied to evaluate the proliferation and cytolysis selectivity of CNHK300. Results： The telomerase activity of MCF-7, BT-549 and SK-BR-3 was positive, while telomerase in MRC-5 and BJ was negative. The progeny virus titers in MCF-7, BT-549 and SK-BR-3 after 48 h of CNHK300 exposure was 40 625, 1 265 and 20 000 fold higher than those of 0 h, even slightly higher than those of wtAd5 （except in SK-BR-3）. ONYX-015 virus proliferation ability was weaker than that of CNHK300 in cancer cells. However, CNHK300 exhibited attenuated replicative ability as compared with wtAd5 in MRC-5 and BJ. The CNHK300 replicatative multiple was 63 and 192 fold at 48 h respectively, while the wtAd5 still multiplied 3 160-4 846 fold. CNHK300 could cause about half of breast cancer cells to die within 7 days at MOI 10 pfu/cell and below, whereas the IC50 in BJ and MRC-5 was as high as MOI 100 pfu/cell. CNHK300 E1A protein could be detected in breast cancer cells and 293 cells but not in normal fibroblast cells. Conclusion： hTERT promoter can successfully modulate the CNHK300 to be selectively replicated in breast cancer cells positive for telomerase, which may be a potential treatment strategy in breast cancer.     

肿瘤选择性增殖腺病毒CNHK300治疗乳腺癌的体外实验研究(英文)

目的观察肿瘤选择性增殖腺病毒 CNHK300对乳腺癌的选择性杀伤作用。方法用 RT-PCR 方法检测各种细胞株的端粒酶活性;CNHK300、ONYX-015(E1B 55 KDa 蛋白缺失的2型和5型嵌合型腺病毒)、wtAd5(野生型腺病毒)分别行病毒增殖实验和细胞生长抑制实验,验证 CNHK300选择性复制和杀伤能力;Western Blot 检测腺病毒E1A 在细胞中的表达。结果乳腺癌细胞株 MCF-7、BT-549和 SK-BR-3端粒酶 hTERT mRNA 均为阳性表达,而正常成纤维细胞株 MRC-5和 BJ 端粒酶hTERT mRNA 为阴性。CNHK300在乳腺癌细胞 MCF-7、BT-549和 SK-BR-3中48 h 复制倍数分别为40 625、1265和20000倍,与wtAd5的增殖能力相似,较 ONYX-015增殖能力强,在 MCF-7和 BT-549细胞中复制能力甚至强于野生型腺病毒。然而,在正常成纤维细胞 MRC-5和 BJ 中 CNHK300病毒增殖能力减弱,48 h 增殖倍数为63～192倍,而 wtAd5增殖仍可高达3160～4846倍CNHK300 MOI 10 PFU/cell 作用7天,可有效杀伤半数乳腺癌细胞,与 ONYX-015相比,CNHK300具有更强的肿瘤杀伤能力CNHK300对正常成纤维细胞的杀伤力较 wtAd5明显减弱,CNHK300在 MOI 100 PFU/cell 时 BJ 细胞存活率50%以上。正常成纤维细胞株中未检测到 CNHK300 E1A 基因表达,在293细胞和感染 CNHK300的乳腺癌细胞株中能够检测到 E1A 基因表达。结论 hTERT 启动子可成功地调控腺病毒 CNHK300选择性在端粒酶阳性的乳腺癌细胞中复制,并产生溶瘤作用。可望成为治疗乳癌的一种新的治疗策略。     

Reversal of Adriamycin Resistance of Hepatocellular Carcinoma by Targeting with Recombined Adenovirus Caning Antisense mdr1 RNA

OBJECTIVE Chemotherapy is an important therapy for hepatocellular carcinoma (HCC). However, it is not effective in many cases due to recurrence and metastasis even if the initial treatment produces a response. Multidrug resistance (MDR) is considered to be one of the considerable causes. The aim of this study was to reverse MDR of HepG2/ADM cells by blocking mdr1 with an adenovirus vector carrying antisense mdr1 in a tumor transplantated in athymic mice. METHODS pCMV IE was removed from the pshuttle vector. A 0.3 kb AFP promoter was inserted into the pshuttle vector and pCMV changed into pAFP. The pAFP and asmdr1 PCR products were doubly digested with Kpnl and Apal, the digested products were ligated by T4 ligase, the asmdrl gene was inserted into pAFP and a newly plasmid pAFP-asmdr1 was constructed. Following digestion with PI-Scel/l-Ceu l, pAFP-asmdr1 was ligated with Adeno-X genome DNA and amplified in E.coli XL 1-Blue. The HEK293 cells were transfected and virus collected. The HepG2 MDR cells (HepG2/ADM) were induced by graded resistance to ADM and were inoculated into athymic mice. After adeno-asmdr1 was injected, the expression of mdr1 -mRNA and the volume of the transplantated tumor and its cells were observed. RESULTS Following injection with Adeno-asmdr1, the tumor volume in the ADM Adeno-asmdr1 group did not increase. However the tumor volume in the PBS plus ADM group did significantly increase (P<0.05). In the tumor xenograft cells, mdr1 mRNA in the xenografts was assessed by RT-PCR and was found to be reduced at 1 week and 4 weeks in the ADM asmdr1 group, but it was stable in the ADM group. It was only 20% in the ADM asmdr1 group compared to the ADM group at the 4th week (P<0.05). Evidence of apoptosis was observed in the tumor xenograft cells treated with Adeno-asmdr1, but there was rare or no apoptosis in the group treated with ADM and PBS. CONCLUSION Adenovirus carrying antisense mdr1 RNA can partially reverse the MDR of HepG2/ADM cells and inhibit tumor growth by down-regulating mdr1 mRNA resulting in tumor cell apoptosis.     

柯萨奇病毒-腺病毒受体在结肠癌组织中的表达及意义

目的：柯萨奇病毒-腺病毒受体（coxsackie and adenovirus receptor，CAR）介导腺病毒与靶细胞之间的粘附，是腺病毒转染靶细胞的限速因子。本文分析CAR在瘤旁上皮组织、结肠肿瘤原发灶和淋巴结转移灶中的表达．为设计腺病毒载体基因治疗方案提供依据。方法：采用免疫组织化学方法检测62例结肠癌组织中CAR的表达．分析CAR表达与临床病理特征的关系。结果：与瘤旁上皮组织相比，肿瘤组织普遍存在CAR表达下调．但CAR在原发灶和淋巴结转移灶的表达水平无明显差异。CAR的表达水平与患者年龄及肿瘤大小相关。结论：结肠癌组织中存在CAR表达下调，提示在设计腺病毒载体基因治疗方案时应充分考虑CAR表达变化对疗效的影响.     

基因工程腺病毒(H101)瘤内注射联合化疗治疗鼻咽癌的疗效观察

目的:观察瘤内注射基因工程腺病毒(H101)联合化疗治疗鼻咽癌的近期疗效和不良反应方法:符合入选标准的鼻咽癌患者54例,给予H101瘤内注射,每天一次,每次一支(5×1011病毒颗粒/0.5ml),连续5天,同时联合PF方案(DDP 20mg/m2静滴,d1～5,5-FU 500mg/m2静滴,d1～5)或AF方案(ADM 50mg/m2静注d1;5-FU 500mg/m2静滴,d1～5)化疗,21天为一周期,所有患者均接受2个周期的治疗.结果:在可评价的54例患者中注射病灶的总有效率为77.7%,其中CR 10例,PR 32例.主要不良反应为注射部位局部疼痛20.4%,非感染性发热40.7%,流感样症状9.3%,未见严重不良事件.结论:在全身化疗的同时瘤内注射基因工程腺病毒(H101)对鼻咽癌有明确的治疗作用,不良反应低,易为患者接受.     

原发性肝癌伴门静脉癌栓的治疗进展

门静脉癌栓是原发性肝癌常见的表现之一,门静脉癌栓不仅导致肿瘤细胞在肝内播散和转移,且加重患者门静脉压力,常诱发上消化道大出血、肝功能衰竭等并发症,严重影响到肝癌患者的预后.近年来,虽然手术治疗、介入治疗、放疗、局部消融治疗、靶向治疗等在门静脉癌栓方面均有发展,但单模式治疗效果仍不理想,门静脉癌栓仍然是临床治疗的难点之一.全文就近些年来关于原发性肝癌伴门静脉癌栓的治疗新进展作一综述.     

E1B—55kDa缺陷腺病毒dl1520联合DDP抗鼻咽癌作用的实验研究

目的：探讨E1B－55kDa缺陷腺病毒dl1520联合（DDP）联合应用对鼻咽癌的抑制作用。方法：采用MTT法测定体外dl520联合DDP对鼻咽癌的细胞毒作用,在鼻咽癌裸鼠移植瘤上进行抗瘤实验。并用免疫组化检验腺病毒六邻体抗原的表达,分析dl520在肿瘤内的复制情况,结果：在体外,dl520能明显抑制CNE－2鼻咽癌细胞的生长,当感染复数（MOI）为0．032、0．160、0．800、4．000、20．000、100．00时,dl520对CNE－2细胞的抑制率分别为2．78％、7．41％、10．19％、24．07％、45．37％和67．59％,当同时加入1μg/ml顺铂时,抑制率分别为29．63％、32．41％、40．74％、52．78％、66．67％和74．07％,而单独顺铂对CNE－2的抑制率为24．07％,联合组与单用dl520组和单用DDP组比较均存在显著差异（P＜0．01）。在动物实验中,dl520单独及联合较低剂量DDP显著抑制裸鼠移植的生长,抑瘤率分别为35．71％和55．13％,与对照组比较,P值分别小于0．01和0．001,联合组与单独DDP组（抑瘤率为21．65％）比较也存在显著差异（P＜0．05）。免疫组化结果证实,在dl520组和联合组的肿瘤组织内存在大量腺病毒的复制,而对照组和DDP组中未见。结论：E1B－55kDa缺陷腺病毒dl520对鼻咽癌具有一定的抑制作用,而dl520与DDP联合应用可显著增强其抗癌效果。