PI3K、p-mTOR蛋白表达水平对早期诊断评估帕金森发病及预后特异性、敏感性分析

目的对不同预后的帕金森病患者资料进行回顾性分析,研究帕金森病(PD)患者血清磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-m TOR)水平与疾病发生、发展及转归的关系。方法选取2014年1月至2017年6月来我院诊断为帕金森病的160例患者及同期160例健康体检者的临床资料进行回顾性分析,按照是否患有帕金森病分为对照组和PD组,并按照帕金森评分表(UPDRS)分为预后良好组(UPDRS35)和预后不良组(UPDRS≥35),采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)法对各组受检者血液标本中PI3K、p-mTOR蛋白的表达情况,比较各组均值并确定指标异常的检验标准。结果与对照组相比,PD患者组血清中PI3K、p-mTOR蛋白水平明显升高(9.66±2.76 vs 3.12±0.34,5.76±0.23 vs 1.54±0.14),差异有统计学意义(P0.05)。预后良好组的PI3K、p-m TOR蛋白表达量明显低于预后不良组,差异具有统计学意义(P0.05)。PI3K、p-mTOR蛋白水平与帕金森病预后评分之间均呈正相关(r=0.811,P0.05;r=0.734,P0.05)。(结果部分不全,请将正文2.1部分的结果加进去。否则结论中就不能提到PI3K、p-mTOR蛋白水平与帕金森病发病有相关性。)结论血清PI3K、p-m TOR蛋白水平与帕金森病发病、预后均有相关性,血清PI3K、p-mTOR蛋白水平可以作为帕金森病的早期诊断和预后评估的有效指标。     

栀子苷预处理对大鼠心肌缺血再灌注后PI3K/Akt信号通路的研究

目的探索栀子苷(GEN)对大鼠心肌缺血再灌注(I/R)后心肌细胞氧化应激水平及心肌凋亡的影响极其与PI3K/Akt信号通路的关系。方法60只SD大鼠随机分为3组:缺血再灌注组(I/R),栀子苷预处理+缺血再灌注组(GEN+I/R),栀子苷+缺血再灌注组+PI3K/Akt信号通路抑制剂(LY294002)组(GEN+I/R+LY),GEN+I/R组在I/R造模前给予50 mg/kg GEN预处理,GEN+I/R+LY组在GEN预处理前给予0.3 mg/kg LY294002。ELISA法检测大鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)、心肌组织丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)以及钙泵(Ca~(2+)-ATPase)水平;Western blot检测心肌组织p-e NOS,p-Akt,Akt以及Bcl-2、Bax蛋白表达;免疫组织化学染色检测p-e NOS,p-Akt蛋白表达。结果与I/R组比较,GEN+I/R组LDH、MDA含量显著降低,SOD、Ca~(2+)-ATPase显著升高(P0.05);与GEN+I/R组比较,GEN+I/R+LY组LDH、MDA含量显著升高,SOD、Ca~(2+)-ATPase显著降低(P0.05)。并且,与I/R组比较,GEN+I/R组p-eNOS、p-Akt、Akt、Bcl-2表达量以及p-e NOS,p-Akt免疫荧光强度显著提高(P0.05),Bax蛋白表达显著降低(P0.05);与GEN+I/R组比较,GEN+I/R+LY组p-eNOS、p-Akt、Akt、Bcl-2表达量以及pe NOS、p-Akt免疫荧光强度显著降低,Bax蛋白表达量显著升高(P0.05)。结论栀子苷可通过激活PI3K/Akt信号通路抑制心肌缺血再灌注后氧化应激及细胞凋亡从而发挥保护作用。     

基于缺氧诱导因子及PI3K-AKT-mTOR信号通路诱导佐剂关节炎滑膜血管新生的实验观察

目的观察佐剂关节炎大鼠滑膜血管PI3K-AKT-m TOR信号通路及缺氧诱导因子(HIF-1α)、血管内皮细胞生长因子(VEGF-A)、滑膜微血管密度(MVD)表达。方法采用随机数字表法将30只大鼠均分成两组:正常组,模型组,模型组采用弗氏完全佐剂建立佐剂关节炎模型。造模成功后19 d,采用免疫组织化学法检测滑膜血管MVD表达,酶联免疫吸附法检测血清白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、HIF-1α、VEGF-A表达,免疫印迹检测滑膜血管PI3K-AKT-m TOR通路蛋白表达。结果与正常组比较,模型组大鼠关节炎及MVD计数升高,血清IL-6、VEGF、HIF-1α和滑膜血管磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B1(AKT1)、p-AKT1、哺乳动物雷帕霉素靶向蛋白(m TOR)表达显著升高,IL-10降低(P0.05或P0.01)。结论 PI3K-AKT-m TOR通路过度激活可能是引起滑膜血管新生的原因之一。     

电针对去神经支配骨骼肌萎缩大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

目的:研究电针对去神经支配骨骼肌萎缩大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响,探讨电针延缓去神经支配骨骼肌萎缩的治疗机制。方法:SD雄性大鼠63只随机分为假手术组(n=21)、模型组(n=21)和电针组(n=21)。模型组、电针组通过暴露并切断坐骨神经的方法制作去神经支配腓肠肌动物模型,假手术组暴露坐骨神经但不切断。术后1d,电针组术侧进行电针治疗,其余两组不做任何处理。分别在术后7d、14d和21d取材,测定术侧腓肠肌湿重比,Masson染色测定腓肠肌纤维直径、截面积,Western Blot检测PI3K、Akt以及mTOR蛋白表达、Akt以及mTOR蛋白磷酸化,PCR检测PI3K、Akt和mTOR基因表达。结果:模型组与电针组大鼠腓肠肌的湿重比、肌纤维截直径以及面积均显著低于假手术组(P0.001),且模型组与电针组比较,差异具有显著性(P0.05);电针组的PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达量均高于模型组与假手术组(P0.05);电针组的PI3K、Akt、mTOR m RNA表达也明显高于其余两组(P0.05)。结论:电针可延缓去神经性骨骼肌萎缩,其作用机制可能与电针激活PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。     

LY294002对Jeko-1细胞的增殖抑制及作用机制研究

本研究旨在探讨磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸激酶（PI3K/Akt）特异性抑制剂LY294002对人套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞生长、细胞凋亡的影响及其作用机制.四甲基偶氮唑盐（MTT）方法检测细胞增殖率;流式细胞术检测细胞凋亡水平;Western blot检测凋亡相关蛋白Cyclin D1、Bcl-2、procaspase-3及PI3 K/Akt信号通路相关蛋白p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K的变化.结果表明,LY294002能抑制Jeko-1细胞的增殖.Jeko-1细胞经LY294002 0、5、10和20 μmol/L作用24 h后,凋亡率分别为（3.25±1.27）％、（11.34±2.35）％、（22.81±2.74）％和（43.61±3.48）％,差异有统计学意义（P＜0.01）;Westem blot检测发现,凋亡相关蛋白Cyclin D1、Bcl-2、procaspase-3表达下降,PI3K/Akt信号通路相关蛋白p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K磷酸化水平降低.结论：LY294002可明显抑制Jeko-1细胞增殖,其机制可能通过下调PI3K/Akt信号通路中的p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K磷酸化水平,抑制PI3K/Akt信号通路,促进细胞凋亡.     

电针对缺氧缺血性脑损伤大鼠海马神经元自噬及IGF-1/PI3K/Akt通路的影响

目的 探讨电针对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠海马神经元自噬及胰岛素样生长因子1(IGF-1)/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路的影响。方法 将108只新生大鼠随机分为假手术组、模型组、IGF-1组(0.2 mg/kg)、电针组、电针联合LY294002组(电针+PI3K抑制剂0.3 mg/kg),每组18只。采用左颈总动脉结扎和低氧处理2 h的方法构建新生大鼠HIBD模型(造模成功率为80%)。各组大鼠在手术清醒后和电针治疗结束后进行神经功能缺陷评分;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测脑组织IGF-1的含量;苏木精-伊红(HE)染色观察脑组织病理学变化;透射电镜观察细胞自噬情况;免疫荧光双标法检测自噬标志物与神经元特异性核蛋白(NeuN)的共定位表达;Western blot法检测海马组织PI3K/Akt通路、自噬相关蛋白的表达[PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、Akt、磷酸化p-Akt(p-Akt)、Beclin-1、微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)、微管相关蛋白轻链3Ⅰ(LC3-Ⅰ)]。结果 与假手术组相比,HIBD模型组大鼠海马中神经元损伤...     

复方地黄颗粒对阴虚动风证帕金森病大鼠纹状体细胞凋亡及PI3K/Akt信号通路的影响

目的探讨复方地黄颗粒(CRG)对阴虚动风证帕金森病(PD)大鼠纹状体细胞凋亡及对PI3K/Akt信号通路的影响。方法采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)注射损毁黑质法制备阴虚动风证PD大鼠模型,造模成功30只大鼠。随机分为模型组、美多芭(MAD)组、复方地黄颗粒低(L-CRG)、中(M-CRG)、高(H-CRG)剂量组,每组6只。另纳入正常对照组和假手术组各6只。美多芭组予美多芭150 mg/(kg·d)灌胃; L-CRG、M-CRG、H-CRG组予复方地黄颗粒3. 5 g/(kg·d)、7 g/(kg·d)、14 g/(kg·d)灌胃;正常对照组、假手术组及模型组予等量生理盐水灌胃。用药6周后处死大鼠,取纹状体。采用TUNEL法检测纹状体细胞凋亡情况;采用透射电子显微镜观察纹状体细胞超微结构;采用蛋白印迹(WB)法检测Bcl-2、Bax、PI3K、Akt、p-Akt蛋白水平。结果与对照组和假手术组比较,模型组细胞凋亡指数明显升高,差异有统计学意义(P 0. 05),细胞凋亡特征明显,Bax蛋白水平明显升高(P 0. 05),Bcl-2、PI3K、p-Akt蛋白水平降低(P 0. 05);与模型组比较,低中高剂量复方地黄颗粒组细胞凋亡指数显著下降(P 0. 05),细胞形态趋于正常,Bax蛋白水平明显降低(P 0. 05),Bcl-2、PI3K、p-Akt蛋白水平升高(P 0. 05),且呈剂量依赖效应。结论复方地黄颗粒可能通过PI3K/Akt信号通路调节凋亡相关蛋白表达,抑制阴虚动风证PD大鼠纹状体细胞凋亡,呈剂量依赖效应。     

SATB1在甲状腺癌启动PI3K/Akt信号通路中的作用研究

目的研究甲状腺癌细胞在发生、发展、侵袭及转移过程中富含AT序列的特异结合蛋白1(SATB1)所起的作用,探讨SATB1在启动PI3K/Akt信号通路中的作用。方法将甲状腺癌细胞随机分成4组:未处理组:除DMEM外不加任何处理;LY294002抑制组:DMEM培养集中加LY294002抑制剂10μmol/L;SATB1诱导剂组:DMEM培养集中加SATB1抗体200μg/L;TSATB1诱导抑制组:DMEM培养集中加SATB1L抗体200μg/L,加LY294002抑制剂10μmol/L。培养24 h后采集培养基中甲状腺癌细胞中血清采用酶联免疫(ELASE)法检测基质金属蛋白酶9(MMP9)、白细胞介素1(IL-1)和IL-6的表达情况,对甲状腺细胞裂解使用Western blotting方法测定PI3K、Akt、P-Akt及PIP3的表达情况,使用免疫组化方法检测甲状腺癌细胞中SATB1的表达。结果免疫组化方法可以看出:在甲状腺癌细胞胞核中SATB1表达为黄色,黄色越深表明表达越重,而在胞浆中无任何表达。不同实验组中SATB1的表达的深浅不一致且差异有统计学意义(P0.05);其中SATB1诱导剂组蛋白SATB1的表达最高,表达最低的LY294002抑制组,且差异具有统计学意义(P0.05)。Western blot研究证实,各组中PI3K、Akt、P-Akt及PIP3的表达不同且差异有统计学意义(P0.05);其中SATB1诱导剂组PI3K、Akt、P-Akt及PIP3的表达最高,而LY294002抑制组最低(P0.05)。ELASE法结果表明各组中MMP9、IL-1和IL-6的表达不同且差异有统计学意义(P0.05);SATB1诱导剂组MMP9、IL-1和IL-6的表达最高,而LY294002抑制组最低(P0.05)。结论 SATB1与甲状腺癌侵袭转移有关;SATB1在PI3 K/Akt信号通路具有启动的作用,同时SATB1可能参与肿瘤的微环境和炎性因子的表达。     

脊髓损伤模型大鼠星形胶质化形成与Akt/mTOR/p70S6K信号通路的激活

背景:既往研究集中于如何促进大鼠脊髓损伤后的神经再生,但对于如何抑制脊髓损伤后星形胶质细胞过度增殖反应的因素、从而改善神经再生的环境研究尚少。目的:观察Akt/m TOR/p70S6K蛋白激酶信号转导通路对大鼠脊髓损伤后反应性星形胶质化形成的影响,从而为改善脊髓损伤后神经再生环境、修复脊髓损伤提供分子学机制依据。方法:建立SD大鼠轻型脊髓损伤模型,分为4组:实验组造模后行ATP治疗7 d;对照组造模后行等量生理盐水治疗7 d;干预组造模后行等量的ATP联合雷帕霉素治疗7 d;假手术组椎板切除后行等量生理盐水治疗7 d。分别于造模后1,3,7,14 d采用免疫组化、Western blot法检测Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR、p70S6K、p-p70S6K、胶质纤维酸性蛋白表达变化,并采用BBB运动功能评分评价大鼠脊髓损伤后经不同方法治疗后运动功能的恢复情况。结果与结论:假手术组大鼠脊髓中Akt/m TOR/p70S6K信号通路分子呈低水平表达,在脊髓损伤后其表达增加。外源性ATP可显著增强大鼠受损脊髓中Akt/m TOR/p70S6K信号分子的表达,而雷帕霉素可明显抑制ATP诱导的表达上调。激活的Akt/m TOR/p70S6K信号通路可显著减弱受损脊髓组织中胶质纤维酸性蛋白的表达、抑制脊髓损伤后过度的星形胶质细胞增生反应,促进脊髓损伤后BBB运动功能评分增加,而雷帕霉素阻碍了由ATP诱导的上述效应。结果证实,ATP通过诱导Akt/m TOR/p70S6K信号通路激活抑制大鼠脊髓损伤后星形胶质瘢痕的形成,具有改善脊髓损伤后神经再生环境、促进脊髓损伤修复和改善神经功能的潜能,此信号通路是治疗脊髓损伤的重要干预环节。     

疏肝理气法通过PI3K/PDK1/Akt信号通路调控胃Cajal间质细胞凋亡的机制研究

目的探究疏肝理气法对胃Cajal间质细胞凋亡的调控作用及可能的作用机制。方法选用120只Wistar大鼠,平均分为三组进行处理:对照组,阳明腑实证组和疏肝理气法治疗组。阳明腑实证造模成功后,疏肝理气法治疗组每日灌服柴胡疏肝散水煎剂,连续灌胃处理5 d,阳明腑实证组和对照组每日灌服等量的0.9%氯化钠,连续处理5d。处理20 d后,观察各组大鼠的存活率,检测存活大鼠的平均体重;利用放射免疫法检测血浆P物质(SP)水平;分离各组大鼠胃Cajal间质细胞,利用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况;Western-blot检测胃Cajal间质细胞中凋亡相关蛋白和PI3K/PDK1/Akt信号通路相关蛋白表达情况。结果处理20 d后,阳明腑实证组大鼠存活率、存活大鼠平均体重、SP含量均显著低于对照组(P0.05),疏肝理气法治疗组大鼠存活率、存活大鼠平均体重、SP含量显著高于阳明腑实证组(P0.05)。阳明腑实证组细胞凋亡率及Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表达显著高于对照组,Bcl-2、PI3K、PDK1、Akt、p-Akt蛋白表达显著低于对照组(P0.05),疏肝理气法治疗组细胞凋亡率及Bax、Cleavedcaspase3、Cleaved-caspase9蛋白表达均显著低于阳明腑实证组,Bcl-2、PI3K、PDK1、Akt、p-Akt蛋白表达显著高于阳明腑实证组(P0.05)。结论疏肝理气法可能通过PI3K/PDK1/Akt信号通路减少由阳明腑实证引起的胃Cajal间质细胞凋亡,有效改善胃肠功能。     

骨形态发生蛋白7通过PI3K/Akt通路可抑制人髓核细胞的凋亡

背景：骨形态发生蛋白7可促进人髓核细胞的细胞外基质合成,减缓椎间盘退变.近年来,有学者提出其可能通过对抗髓核细胞凋亡从而发挥上述作用,但其进一步的分子机制一直未被详细阐明.目的：观察骨形态发生蛋白7对无血清诱导下发生凋亡的人髓核细胞产生的作用及其对PI3K/Akt通路的影响,分析并探讨骨形态发生蛋白7抑制人髓核细胞凋亡的分子机制.方法：通过改良Pfirrmann分级及相关条件选取12例患者获取椎间盘组织,采用酶消化法获取人髓核细胞后分组实验,以含体积分数15％胎牛血清的培养基正常培养的髓核细胞设为空白组;使用无血清培养基培养48 h诱导凋亡作为阳性对照组;在无血清条件下,通过加入不同剂量的骨形态发生蛋白7以及同时添加PI3K/Akt通路拮抗剂LY294002形成处理组和拮抗组.使用流式细胞术检测各组细胞凋亡率;免疫荧光观察p-Akt表达;蛋白印迹法检测Akt,p-Akt,BAD和Caspase 9等通路蛋白的表达变化.结果与结论：无血清凋亡诱导下,流式细胞术结果显示,随着骨形态发生蛋白7处理浓度上升,髓核细胞凋亡率明显下降,加入LY294002共同作用后细胞凋亡率再次升高（P＜0.05）.p-Akt免疫荧光和蛋白印迹法检测结果进一步表明,与凋亡阳性对照组相比,加入骨形态发生蛋白7的实验组中,p-Akt表达明显增加,其下游凋亡相关蛋白BAD、Caspase 9蛋白表达减少（P＜0.05）,而在同时加入Akt通路拮抗剂LY294002后,p-Akt蛋白表达下降而凋亡相关蛋白的表达又恢复到相对较高的水平（P＜0.05）.结果证明,骨形态发生蛋白7在无血清诱导的人类髓核细胞凋亡中通过激活PI3K/Akt通路,拮抗了BAD-Caspase 9相关的细胞凋亡过程,抑制了髓核细胞的退变.     

高糖对RF/6A细胞内PI3K-Akt信号通路的影响

目的 探讨高糖对视网膜血管内皮细胞内血管新生关键信号通路PI3K-Akt信号通路的影响.方法 以猴视网膜血管内皮细胞RF/6A细胞为研究对象,分为空白对照组、甘露醇对照组、高糖组和PI3K-Akt信号通路特异性阻断剂LY294002组,分别采用MTs法检测RF/6A细胞增殖、划痕实验检测细胞迁移以及Mmrigel法检测细胞管腔形成能力,Western blot法检测PI3K-Akt信号通路中关键蛋白Akt的表达以及磷酸化.结果 与空白对照组相比,甘露醇对照组细胞增殖率、迁移率、管腔形成数以及细胞内Akt及P-Akt的表达无统计学差异(P>0.05);高糖组细胞增殖增加15.12%(P<0.05),细胞迁移增加39.24%(P<0.01),管腔形成数增加59 10%(P<0.01),细胞内Akt及p-Akt的表达分别增加27.34%(P<0.05)、25.23%(P<0.05);LY294002组细胞增殖减少17.56%(P<0.05),细胞迁移减少45 71%(P<0.01),管腔形成减少39.08%(P<0.01),Akt及p-Akt的表达量分别减少37.78%(P<0.01)、42.08%(P<0.01);与高糖组相比,LY294002组细胞增殖减少29.06%(P<0.05),细胞迁移减少61.01%(P<0.01),管腔形成减少62.14%(P<0.01);Akt及p-Akt的表达分别减少51.15%(P<0.01)、53.75%(P<0.01).结论 高糖可经上调RF/6A细胞内PI3K-Akt信号通路促进血管新生,PI3K-Akt信号通路阻断剂可拮抗高糖的促RF/6A细胞血管新生的作用.     

干扰PKM2对急性白血病细胞增殖和凋亡的影响及分子机制

目的:探讨糖酵解酶丙酮酸激酶M2型(PKM2)对人白血病细胞HL-60增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法:以干扰PKM2的质粒转染HL-60细胞株(si-PKM2组),同时将转染空载体的HL-60细胞设为对照组(si-Ctl组)。采用RT-q PCR和Western blot技术分别检测si-Ctl组和si-PKM2组PKM2 m RNA和蛋白水平的变化;CCK-8检测两组细胞的增殖能力;采用流式细胞术检测两组细胞周期和凋亡的变化;Western blot和RT-q PCR技术检测两组细胞中PI3K/Akt/m TOR信号通路的变化及糖酵解相关基因的表达变化,并检测两组细胞中葡萄糖消耗和乳酸生成的变化情况。过表达PKM2的细胞给予PI3K抑制剂LY294002或给予半乳糖培养后检测细胞的增殖能力、周期和凋亡的变化以及葡萄糖消耗和乳酸生成的变化。结果:干扰PKM2表达后,si-PKM2组中PKM2的m RNA (t=45.21,P0.001)和蛋白水平(t=13.56,P0.01)显著降低,si-PKM2组的细胞增殖能力较对照组明显下降(F=253.59,P0.05),敲低PKM2后细胞被显著阻滞于G_1期,且明显诱导了细胞的凋亡(t=56.38,P0.05)。与对照组相比,si-PKM2组p-Akt和p-m TOR水平显著降低(t=50.23、13.51,P0.01),葡萄糖消耗和乳酸生成显著下降(t=23.16、15.20,P0.05)。补救实验结果显示,过表达PKM2给予PI3K抑制剂LY294002后减弱了其诱导的葡萄糖消耗和乳酸的产生(t=45.13、26.35,P0.05),半乳糖培养过表达PKM2的HL-60细胞对细胞增殖能力(t=16.52,P0.05)、周期及凋亡无显著影响(t=48.63,P0.05)。结论:敲低PKM2可以抑制白血病HL-60细胞的增殖并诱导其凋亡,其分子机制可能与PKM2介导的PI3K/Akt/mTOR糖酵解轴抑制有关,提示PKM2可能作为白血病防治的一个分子靶点。     

肠三叶因子介导PI3K/Akt信号通路保护胃黏膜上皮细胞紧密连接

目的：探讨肠三叶因子对胃黏膜上皮细胞紧密连接的保护作用,并研究PI3K/Akt信号通路在其中的作用机制。方法：体外培养GES-1细胞,分别设正常对照组,LPS组,ITF组,LPS＋ITF组,LPS＋ITF＋LY294002组,ITF＋LY294002组。正常对照组：正常培养;LPS组：加入浓度为10mg/L的LPS;ITF组：加入浓度为100μg/L的ITF;LPS＋ITF组：加入浓度为10mg/L的LPS,同时加入100μg/L的ITF;LPS＋ITF＋LY294002组：加入浓度为10mg/L的LPS、100μg/L的ITF,同时加入PI3K/Akt信号通路的抑制剂LY294002（15μM）;ITF＋LY294002组：加入100μg/L的ITF,同时加入15μM的LY294002。培养48h,采用Western blot检测ITF对PI3K/Akt信号通路的作用,采用免疫荧光和Western blot检测细胞紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的变化情况。结果：Western blot检测结果说明,与对照组相比,ITF提高了pAkt蛋白的表达水平,而LY294002抑制了ITF激活的pAkt蛋白的表达,说明ITF可以通过激活PI3K/Akt信号通路来调控GES-1细胞的生理活动。免疫荧光和Western blot结果显示LPS导致GES-1细胞的紧密连接遭到破坏,降低紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达水平,而ITF可以通过激活PI3K/Akt信号通路来保护GES-1细胞的紧密连接的完整性。结论：ITF保护胃黏膜上皮细胞紧密连接的完整性,提高紧密连接蛋白的表达水平,其发挥作用的主要分子机制是通过激活PI3K/Akt信号通路来实现的。     

GIRK通道在匹罗卡品癫痫模型中的表达改变

目的：研究匹罗卡品诱导癫痫发作后不同时期G蛋白耦联内向整流钾通道（GIRK通道）在海马神经元细胞膜表面表达变化情况，并探索可能的调控机制。 方法：将成年雄性SD大鼠随机分为对照组和匹罗卡品造模组，利用致痫剂匹罗卡品诱导癫痫持续状态（Status epilepticus，SE）后，分别在急性期（24h）和慢性期（30d）取海马组织提取膜蛋白，利用Western Blot方法检测海马膜蛋白GIRK通道亚基蛋白GIRK1、GIRK2的表达改变，并同时检测海马组织PI3K/Akt通路激活情况。建立细胞癫痫模型，观察PI3K抑制剂渥曼青霉素和LY294002对海马神经元内向整流钾通道（Kir）电流的影响。 结果：匹罗卡品诱导大鼠SE发作后急性期细胞膜上GIRK1和GIRK2蛋白的表达较对照组相比显著下调（P<0.05）。海马膜蛋白中GIRK1的表达在大鼠SE发作后慢性期较对照组下降（P<0.05），而GIRK2蛋白表达量没有显著改变（P>0.05）。p-Akt（308）、Akt蛋白表达量的比值在匹罗卡品诱导大鼠SE发作后急性期与对照组相比显著上升（P<0.05），而在SE发作后慢性期无显著差异（P>0.05）。在细胞癫痫模型中，PI3K抑制剂渥曼青霉素和LY294002对痫样放电神经元的Kir电流未发现显著影响。 结论：在大鼠匹罗卡品诱导SE发作后急性期，海马中GIRK通道蛋白表达量下调， PI3K/Akt通路存在明显激活。癫痫急性期GIRK通道表达的调控机制尚需进一步研究。     

电针通过AKT/mTOR/P70S6K通路促进大鼠局灶脑缺血/再灌注大脑缺血皮质区血管再生的研究

目的:观察电针对大鼠局灶脑缺血/再灌注大脑缺血皮质区p-AKT、p-mTOR、p-P70S6K表达及CD34~+微血管密度变化的影响,探讨电针促进大脑缺血皮质区血管再生的机制。方法:140只雄性SD大鼠随机分为4组:假手术组、模型组、模型+电针组(电针组)、模型+电针+哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)特异性抑制剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)组(抑制剂组);采用线栓法制备SD大鼠右侧局灶脑缺血/再灌注模型,缺血2h后将假手术组、模型组、电针组和抑制剂组各分为再灌注12h、24h、48h、72h、7d五个亚组;取大鼠"百会"穴(GV 20)及左侧"四关"穴(合谷LI 4/太冲LR 3)为电针刺激穴位,刺激时间30min/次,每日1次,最长持续7d;采用Western Blot检测各组大脑缺血皮质区磷酸化的蛋白激酶B(p-protein kinase B,p-AKT)、磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mammalian target of rapamycin,p-mTOR)、磷酸化的核糖体蛋白S6乳激酶(p-ribosomal protein S6 kinase,p-P70S6K)蛋白的表达水平;免疫组化法检测大脑缺血皮质区VEGFR2蛋白、CD34~+微血管血管的表达;Longa法检测神经功能。结果:与假手术组相比,模型组p-AKT蛋白的表达在24h、48h和72h增加(P0.05),模型组p-mTOR和p-P70S6K的蛋白表达在48h、72h和7d增加(P0.05),与模型组相比较,电针组各个时间点p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K蛋白的表达均显著增加(P0.01),在RAPA的作用下,抑制剂组中各个时间点p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K蛋白的表达明显低于电针组(P0.05);与模型组相比,电针组再灌注72h和7d大脑缺血皮质区VEGFR2蛋白、CD34~+微血管的表达明显增多(P0.01),与电针组相比,抑制剂组再灌注72h和7d大脑缺血皮质区VEGFR2蛋白、CD34~+血管减少(P0.05);与模型组和抑制剂组相比,电针组再灌注72h、7d神经功能评分明显改善(P0.05)。结论:电针可提高大鼠局灶脑缺血/再灌注大脑缺血皮质区p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K的表达,可能通过AKT/mTOR/P70S6K通路促进大鼠大脑缺血皮质区血管的再生和神经功能的恢复。     

mTOR信号调控PPARγ对再生障碍性贫血BM-MSC成脂分化的作用

目的:研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通过调控过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达对再生障碍性贫血(AA)患者骨髓间充质干细胞(BM-MSC)成脂分化的影响。方法:采用激光共聚焦、Western blot和油红O染色等,观察AA组和对照组BM-M SC中m TOR信号、PPARγ蛋白表达和体外诱导成脂分化能力;通过雷帕霉素体外干预,分析m TOR信号和PPARγ在AA患者BM-MSC体外诱导成脂分化中的作用。结果:随着成脂诱导时间的延长,2组脂肪细胞转化率和FABP4表达均增高,在同一时间点,在AA组均高于对照组(P0.01)。2组BM-M SC的胞质及胞核均有p-m TOR和PPARγ的分布,而且AA组p-m TOR和PPARγ蛋白的荧光强度均显著高于对照组(P0.01)。随诱导时间的延长,2组PPARγ表达均呈逐渐增高的趋势;在同一时间点,AA组PPARγ表达明显高于对照组(P0.01)。雷帕霉素早、中和晚期干预组脂肪转化率和FABP4表达均较未干预组明显下降(P0.001)。雷帕霉素早、中和晚期干预组的PPARγ蛋白和m RNA表达均较未干预组均明显下降(P0.001)。结论:m TOR信号可能通过调控PPARγ表达在AA患者BM-MSC体外成脂分化中发挥重要的作用。     

乌梅提取物对肾结石大鼠肾功能及NGAL/MCP-1水平的影响研究

目的本研究分析乌梅提取物对肾结石大鼠肾功能及中性粒细胞明胶酶相关脂质载运蛋白/单核细胞趋化因子蛋白1(NGAL/MCP-1)水平的影响,为相关药物研发及治疗提供参考。方法清洁级SD大鼠随机分为4组:对照组、模型组、乌梅提取物组和m TOR抑制剂雷帕霉素组。除对照组尾静脉注射生理盐水外,其余各组大鼠采用尾静脉注射纳米细菌复制肾结石模型,对照组和模型组给予羧甲基纤维素钠灌胃治疗,乌梅提取物组(20 mg/kg)和m TOR抑制剂雷帕霉素组(10 mg/kg)大鼠给予对应药物治疗。分析各组大鼠尿液中24 h尿生化指标[尿酸(UA)和尿柠檬酸(CA)]及肾脏NGAL/MCP-1和m TOR蛋白表达变化。结果与对照组相比,模型组大鼠血清CA及UA水平明显升高(P 0. 05),肾组织NGAL、MCP-1、AKT及m TOR蛋白的表达水平明显升高(P 0. 05);与模型组比较,雷帕霉素组及乌梅提取物组大鼠血清CA及UA水平明显降低,肾组织NGAL、MCP-1、AKT及m TOR蛋白的表达水平明显降低(P0. 05)。结论乌梅提取物对肾结石大鼠肾功能及NGAL/MCP-1和AKT/m TOR水平的异常有明显的恢复作用。     

血管生成素-1对HCT-8细胞的作用及其可能机制的研究

目的观察血管生成素-1（Angiopoietin-1,Ang-1）蛋白对无血清DMEM培养基培养的结肠癌细胞（HCT-8）存活率的影响,探讨其与PI3-’kinase/Akt通路的关系。方法将不同浓度（0、0.05、0.2、0.4、0.82、.0 mg/L）的Ang-1蛋白作用于HCT-8细胞,用MTT法检测细胞增殖,根据实验结果选定Ang-1蛋白的后续实验浓度,加入Ang-1及LY294002,应用Western blotting蛋白免疫印记法分析相关蛋白（Tie-2、PI3K、Akt）的变化。结果 Ang-1（0.05、0.2、0.4、0.82、.0 mg/L）＋DMEM组与无血清DMEM培养基组比较,Tie-2、PI3K、Akt三种蛋白在HCT-8细胞中的表达均增强（P〈0.01,P〈0.01,P〈0.01）,DMEM＋Ang-1＋LY294002组三种蛋白的表达均减弱（P〉0.05,P〈0.01,P〈0.01）。结论较低浓度（0.05 mg/L）的血管生成素-1蛋白在结肠癌细胞中即有抗凋亡作用,并且随着剂量的增加抗凋亡作用平稳,其诱导凋亡的机理可能与Tie-2/PI3-’kinase/Akt调节的通路有关,应用该途径的抑制剂LY294002可抑制结肠癌细胞的生长,实现抗肿瘤作用。     

雷帕霉素通过EZH2/Hedgehog信号通路诱导慢性髓系白血病细胞凋亡

目的:探讨雷帕霉素诱导慢性髓系白血病(CML)细胞凋亡的机制。方法:对CML细胞K562用雷帕霉素10(A组)、15(B组)和20(C组) nmol/L分别处理24 h,对照组不加雷帕霉素。采用MTT法检测雷帕霉素对K562细胞增殖的影响, AnnexinV-FITC/PI双染法检测雷帕霉素对K562细胞凋亡的影响, RT-PCR检测雷帕霉素对K562细胞EZH2/Hedgehog信号通路基因表达水平,Western blot检测雷帕霉素对K562细胞凋亡及相关信号通路蛋白表达水平。结果:MTT法检测发现,不同浓度雷帕霉素对细胞增殖有明显抑制作用,其中C组的细胞存活率37.6%±3.4%,显著低于其它各组(P0.05)。通过AnnexinV-FITC/PI双染法检测发现,C组细胞的凋亡率为93.1%±8.1%,显著高于其它各组(P0.05)。Western blot检测发现,K562细胞在雷帕霉素作用后,C组的Caspase-3和BAX蛋白相对表达水平分别为0.36±0.04、0.39±0.06,显著高于其它各组(P0.05);BCL-2蛋白水平0.17±0.03,显著低于其它各组(P0.05)。RT-PCR检测发现,K562细胞在雷帕霉素作用后,EZH2与Hedgehog基因mRNA水平明显下降(P0.05),而Ptch1基因m RNA水平明显上升(P0.05)。Western blot检测发现,K562细胞在雷帕霉素作用后,其EZH2与Hedgehog蛋白表达水平下降,而Ptch1蛋白水平上升(P0.05)。C组的EZH2与Hedgehog蛋白相对水平分别为0.21±0.03、0.16±0.05,显著低于其它各组(P0.05);Ptch1蛋白水平0.46±0.06,显著高于其它各组(P0.05)。结论:雷帕霉素可抑制白血病细胞中EZH2蛋白表达,从而干扰Hedgehog信号通路的激活,并促进凋亡蛋白的表达,减少抗凋亡蛋白水平,最终诱导白血病细胞的凋亡。