基于纳米材料提取肝细胞癌患者血浆外泌体的研究

目的建立一种快速、高效提取肿瘤患者血浆外泌体的新方法。方法采用ExoQuick新型纳米材料分离外泌体,考马斯亮蓝染色进行蛋白定量,透射电子显微镜观察外泌体的形态。蛋白质印迹法分析外泌体标记和肝细胞癌相关蛋白。结果以纳米材料为基础的新提取方法分离出的胞外泌体直径为30～100 nm,与传统方法分离的外泌体直径相似;蛋白浓度是传统方法提取的外泌体蛋白浓度的19倍;鉴定到典型的外泌体蛋白:跨膜蛋白CD63和热休克蛋白70(HSP70)。肝细胞癌患者外泌体中含有TGM2,而无膜联蛋白A2表达。结论基于纳米材料提取外泌体方法快速有效。肝癌相关蛋白TGM2可以通过外泌体介导的非经典分泌途径分泌,可能是一种有价值的肿瘤标志物。     

血浆外泌体miR-452作为胃癌诊断的生物标志物

目的筛选胃癌血浆外泌体中差异表达的miRNA,分析其对胃癌诊断的敏感性与特异性及与胃癌患者的疾病特点之间的相关性。方法收集南京医科大学第一附属医院消化内科病理确诊为胃癌的住院患者与消化内科及体检中心的无癌健康对照人群的血液样本,离心后试剂盒抽提血浆外泌体及其RNA,通过透射电子显微镜观察、蛋白质印迹分析(Western blotting)鉴定标志蛋白及纳米粒径分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)对血浆外泌体进行鉴定,定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)鉴定与胃癌发病相关的miRNA。结果共纳入胃癌患者80例和健康对照80名。成功对2例血浆外泌体(GC1和NC1)进行鉴定以证实其相关特性。在初始筛选阶段,对12例胃癌和12名健康对照者的血浆外泌体RNA进行qRT-PCR验证并依据其各自的2~(-△Ct)值,分析受试者的诊断ROC曲线下面积(AUC)。与健康对照者相比,胃癌的血浆外泌体miR-452-5p表达量显著升高(P=0.002),miR-452-5p的AUC值为0.798(95%CI:0.552～0.883)。而后纳入新的68对样本对筛选结果进一步验证,miR-452-5p的表达趋势与初始筛选一致,且诊断AUC值为0.733(95%CI:0.647～0.818)。分析已验证的miR-452-5p表达水平与胃癌病理特征无相关性(P0.05)。结论血浆外泌miR-452-5p可能为检测胃癌的新型潜在生物标志物,然而其对疾病的病理特性的影响仍需更大样本量的实验进一步研究。     

肝癌细胞来源外泌体对肿瘤相关M2型巨噬细胞极化的影响

目的 探讨来源于肝癌细胞的外泌体对肿瘤相关巨噬细胞极化的影响，揭示肝癌形成新机制。方法 通过超速离心法分离肝癌细胞来源外泌体，透射电子显微镜、动态光散射粒度分析仪、蛋白免疫印迹法对外泌体表征进行鉴定；诱导巨噬细胞极化模型，实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法验证其极化状态。符合正态分布的计量资料两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。结果 透谢电子显微镜显示肝癌细胞来源外泌体为圆形或椭圆形囊泡结构，外泌体粒径大小为(172.65±2.34)nm,蛋白免疫印迹分析显示肝癌细胞来源的外泌体中标志蛋白TSG101和CD63呈高阳性表达。佛波酯15 ng诱导人源单核细胞巨噬细胞24 h贴壁后CD68表达显著增加(6.67±0.98 vs 1.00±0.25,t=11.20,P<0.001)。蛋白免疫印迹分析显示，相比对照组(L02来源外泌体组),HCC细胞来源外泌体(低、中、高3种剂量)诱导巨噬细胞表达M2型巨噬细胞标志物Arg-1、CD163均明显增加(P值均<0.05)。结论 肝癌细胞来源外泌体可促进巨噬细胞M2型极化。     

结直肠癌患者血清外泌体lnc-KIAA1586-2的表达及其临床意义

目的 探讨血清外泌体来源lnc-KIAA1586-2在结直肠癌(colorectal cancer, CRC)患者中的表达水平及其临床意义。方法收集2019年1月至2020年12月临床明确诊断的110例CRC患者及同期100名健康体检者血清标本,同时收集所有患者的临床资料。qRT-PCR法检测血清外泌体中lnc-KIAA1586-2的表达水平,电化学发光法检测血清CEA与CA19-9的表达水平。采用ROC曲线评价不同指标的诊断效能,并分析其与患者临床病理特征的关系。采用Cox比例风险模型进行多变量回归分析。结果 CRC患者血清外泌体中lnc-KIAA1586-2的相对表达水平(2.96±0.13)显著高于健康对照组(1.56±0.11)(t=9.53,P<0.001),患者术后血清外泌体lnc-KIAA1586-2相对表达水平显著下降。ROC曲线分析结果表明,血清外泌体lnc-KIAA1586-2诊断CRC的AUC为0.832,显著优于传统肿瘤标志物CEA、CA19-9的诊断效能。单因素分析发现血清外泌体lnc-KIAA1586-2相对表达量与肿瘤长径(χ²...     

心力衰竭患者血浆外泌体microRNA检测及其功能分析

目的明确心力衰竭(心衰)患者血浆外泌体microRNA(miRNA)表达谱的差别,寻找其在心衰早期诊断和预后评估中的价值。方法应用外泌体提取试剂盒抽提10例心衰患者及10例非心衰对照者外周血浆外泌体,对血浆外泌体miRNA进行高通量测序,初步筛选差异表达miRNA,并通过实时荧光定量PCR方法验证,分析差异表达miRNA的功能及其与NT-proBNP的相关性。结果 miRNA高通量测序共筛选出24条显著差异表达的血浆外泌体miRNA。其中14条miRNA表达显著上调,10条miRNA表达明显下调。定量PCR验证和高通量测序筛选结果一致。差异表达miRNA的功能涉及炎性反应、细胞凋亡、增值、自噬等。相关性分析提示miR-122-5p与NT-proBNP具有相关性(r=0.537,P=0.015)。结论血浆外泌体来源miRNA可能成为潜在的辅助诊断心力衰竭和评估预后的一类新型生物标志物。     

非小细胞肺癌组织中外泌体差异蛋白表达及临床意义

目的分析非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清外泌体差异蛋白表达在临床诊断中的意义。 方法选择2017年1月至2018年1月新疆医科大学附属肿瘤医院肺内一科收治的NSCLC患者85例为NSCLC组,同期医院健康体检志愿者50例为对照组,利用蛋白组学技术筛选出两组患者血清外泌体中表达差异性最大的蛋白,采用Western blot与酶联免疫吸附法检测其在NSCLC患者中的表达水平,分析在诊断NSCLC中的应用价值。 结果NSCLC组患者血清外泌体总蛋白质平均浓度显著高于对照组(t＝18.723,P＝0.000);两组血清外泌体中TMEM88蛋白表达量差异显著,Gel-Pro软件定量分析血清外泌体TMEM88蛋白条带积分光密度值(IOD),提示NSCLC患者血清外泌体中TMEM88蛋白质表达水平显著高于对照组(t＝13.316,P＝0.000); NSCLC患者在肿瘤Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴结转移及有血管癌栓中血清外泌体来源TMEM88蛋白表达升高(t＝7.376、3.958、4.304,P＝0.000);血清来源外泌体TMEM88蛋白表达超过589.41时,诊断NSCLC的AUC＝0.787,灵敏度及特异度分别为74.1%和87.1%,约登指数为0.612。 结论NSCLC患者血清外泌体来源TMEM88蛋白表达量异常升高,表达量与患者肿瘤分期、淋巴转移、脉管癌栓及肿瘤负荷量有关,在NSCLC诊断中有临床意义。     

SIRT3在食管鳞癌中的表达及作用机制

目的探讨SIRT3在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中的表达及其相关作用机制,为ESCC的早期诊断提供依据。方法收集ESCC患者癌组织、正常食管组织标本各20例,免疫组化(IHC)、蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测各组标本中SIRT3的表达;Western blotting检测ESCC细胞株Eca109在常氧、缺氧(6 h、12 h、24 h)状态下SIRT3、HIF-1α蛋白的表达。结果 SIRT3蛋白在ESCC组织中的表达水平高于正常食管组织,差异有统计学意义(0.51±0.06 vs 0.26±0.04,P0.05);缺氧状态下Eca109细胞中SIRT3表达水平降低,HIF-1α表达水平升高。结论 SIRT3的高表达可能与ESCC的发生、发展有关;HIF-1α对ESCC的发生、发展有促进作用,对其表达的检测可能会成为ESCC的早期诊断手段之一。     

X线辐射后A549细胞上清外泌体GPC1表达与细胞周期的关系

目的观察X线辐射对A549肺腺癌细胞周期及对细胞上清外泌体磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC)1表达的影响。方法培养肺腺癌细胞A549并分别给予0、0.5、1、1.5、2 Gy剂量照射,照射后继续培养6、12 h收集细胞,用PI法检测细胞周期;收集细胞上清液,超速离心法提取外泌体,Western印迹检测外泌体GPC1表达。结果 G_2期细胞的比例随着剂量的增加而增加,差异有统计学意义(P<0.001),其他各剂量组与2 Gy组比较差异有统计学意义(P<0.05);各剂量组S期细胞比例均高于0 Gy组(P<0.05);Western印迹结果显示,随辐射剂量增大,GPC1表达量逐渐降低。结论辐射能够诱导A549细胞G2期、S期阻滞,同时细胞上清外泌体GPC1蛋白表达减少,二者具有相关性。     

CD137信号通过外泌体传递活化T细胞核因子c1介导小鼠血管平滑肌细胞钙化

目的探讨外泌体在CD137信号诱导的小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙化中的作用。方法组织贴壁法提取小鼠胸主动脉VSMC,将细胞分为2组,即对照组和CD137激动组,用试剂盒提取外泌体,并用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析法及Western blot鉴定和分析,荧光显微镜观察VSMC摄取外泌体。构建活化T细胞核因子c1(sh-NFATc1)慢病毒载体并感染VSMC。实验分为3组:对照组外泌体处理组、CD137激动组外泌体处理组、沉默NFATc1+CD137激动组外泌体处理组。采用Western blot检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、骨形成蛋白2(BMP-2)、Runt相关转录因子2(Runx-2)蛋白表达量。Von Kossa染色检测VSMC内钙盐沉积情况。结果 Western blot结果显示,2组微囊泡均表达外泌体表面标记蛋白CD9、CD81;电镜下外泌体成圆形和杯托状,直径在30～100 nm;CD137激动组外泌体中NFATc1蛋白表达显著增多。与对照组外泌体处理组比较,CD137激动组外泌体处理组钙化相关指标BMP-2、Runx-2蛋白表达显著增高,同时α-SMA表达显著下降;与CD137激动组外泌体处理组比较,沉默NFATc1+CD137激动组外泌体处理组BMP-2、Runx-2蛋白表达显著减少,α-SMA表达显著增高。Von Kossa染色结果显示,CD137激动组外泌体处理组VSMC钙盐沉积多于对照组外泌体处理组,而沉默NFATc1+CD137激动组外泌体处理组钙盐沉积比CD137激动组外泌体处理组显著降低。结论 CD137信号通路通过外泌体转运NFATc1介导VSMC钙化。     

肝癌细胞低氧环境下分泌的外泌体对同源细胞活性的影响

目的 探讨肝癌细胞低氧环境下分泌的外泌体对同源细胞活性的影响.方法 采用差速超速离心法提取低氧环境下人肝癌细胞(HHCC)分泌的外泌体,通过投射电子显微镜观察外泌体的形态学特征,Western印迹检测外泌体特异性蛋白表达.采用CCK-8检测细胞增殖能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能...     

肝癌细胞外泌体的分离与鉴定

目的:针对目前尚缺理想的肿瘤细胞提取方案,探寻分离纯化肝癌细胞培养液中外泌体的新方法.方法:连续适应无血清培养肝癌SMMC-7721细胞,收集细胞上清液,采用改良超速离心法分离、纯化培养上清液中肝癌细胞外泌体;透射电镜观察其形态,Nanosight技术分析粒径;Western blot分析其特异蛋白Alix、CD63、CD9的表达并利用SDS-PAGE电泳分析肝癌细胞和外泌体的蛋白谱.结果:透射电镜观察到的肝癌细胞外泌体,外形呈圆形或椭圆形;Nanosight技术分析颗粒直径峰值为122 nm,直径30-150 nm之间颗粒占72.16%;Western blot证实在细胞培养上清液和外泌体提取液中均能检测到Alix、CD63、CD9的蛋白表达;SDS-PAGE电泳清晰显示外泌体中高丰度大分子结构蛋白明显少于肝癌细胞.结论:利用连续适应无血清细胞培养结合改良超速离心法能提取高纯度的外泌体,为肝癌细胞外泌体标志物研究奠定基础.     

高、低表达miR-296-5p的肿瘤细胞外泌体对食管鳞癌细胞迁移和侵袭的调控作用

目的 探讨高、低表达miR-296-5p的肿瘤细胞外泌体对食管鳞癌细胞（ESCC）迁移和侵袭的调控作用及其机制。方法 提取转染miR-296-5p过表达和miR-296-5p干扰及其阴性对照物（NC）后的ESCC细胞外泌体,并采用透射电镜与Western blotting法进行鉴定;将ESCC细胞分为三组,干扰组、过表达组分别加入miR-296-5p干扰或过表达细胞的外泌体培养,NC组加入NC转染细胞的外泌体培养48 h;取各组细胞,MTT法检测细胞活力、Transwell法检测细胞侵袭迁移能力,RT-PCR、Western blotting法检测细胞黏附分子3(CADM3)、CADM1、CADM4、钙黏蛋白E(E-cadherin)及血管内皮细胞生成浸润相关蛋白CD31、CD44。结果 细胞活力、迁移和侵袭细胞数过表达组>NC组>干扰组（P均<0.05）。细胞中CADM1、CADM4、E-cadherin基因及蛋白表达水平干扰组>NC组>过表达组,CADM3、CD31、CD44基因及蛋白表达水平过表达组>NC组>干扰组（P均<0.05）...     

不同Hp感染的老年慢性胃炎患者S100蛋白表达及意义

目的 探讨不同幽门螺旋杆菌(Hp)感染情况的老年慢性胃炎患者S100蛋白表达特点及意义。方法 选取老年慢性胃炎患者92例，根据病理检查结果分为慢性非萎缩性胃炎组39例，慢性萎缩性胃炎组53例。接受碳13尿酸呼气试验，并结合快速尿素酶试验结果进行综合判断，分为Hp感染阳性(阳性组)、Hp感染阴性(阴性组)。胃镜下随机采集胃窦部黏膜组织标本，免疫组化法检测S100A8、S100A9阳性表达情况；RT-PCR检测S100A8、S100A9 mRNA表达水平；Western印迹检测S100A8、S100A9蛋白表达水平。结果 慢性萎缩性胃炎组S100A8、S100A9表达阳性率明显高于慢性非萎缩性胃炎组(P<0.01)。慢性萎缩性胃炎组S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表达水平明显高于慢性非萎缩性胃炎组(P<0.01)。Hp感染阳性的老年慢性胃炎患者S100A8、S100A9表达阳性率明显高于Hp感染阴性的患者(P<0.01)。Hp感染阳性的老年慢性胃炎患者S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表达水平明显高于Hp感染阴性的患者(P<0.01)。慢性萎缩性胃...     

人结直肠癌LoVo/HCT116细胞来源外泌体促肿瘤迁移能力及Wnt3a/Wnt5a蛋白鉴定

目的鉴定人结直肠癌LoVo/HCT116细胞上清外泌体中Wnt3a和Wnt5a蛋白的表达情况,探讨外泌体对人结直肠癌迁移的调节作用。方法培养人结直肠癌LoVo/HCT116细胞,提取上述两种细胞的上清液抽提外泌体,运用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)、蛋白印迹法(Western blot)对外泌体进行鉴定。结果透射电镜下观察到外泌体具有膜结构,NTA检测提示粒径大小主要分布在94 nm左右,可检测到外泌体膜标志蛋白HSP70、CD63、CD9以及Wnt3a、Wnt5a表达。人结直肠癌LoVo/HCT116细胞外泌体能被人结直肠癌细胞摄取,并对人结直肠癌细胞迁移有促进作用。结论人结直肠癌LoVo/HCT116细胞能抽提得到外泌体,外泌体表达膜标志蛋白HSP70、CD63、CD9以及Wnt3a、Wnt5a蛋白。外泌体能被结直肠癌细胞吸收,而吸收了外泌体的人结直肠癌细胞其迁移能力增强。     

高通量技术筛选主动脉夹层生物标志物的研究

目的:通过iTRAQ联合Label-free法筛选主动脉夹层潜在诊断标志物。方法:入选急性主动脉夹层及对照组(急性冠状动脉综合征)血清各50例。将两组患者中各15例血清标本用于iTRAQ及Label-free分析筛选表达差异蛋白。对所有收集血清进行差异蛋白的免疫吸附测定(ELISA)验证。结果:两组血清标本使用iTRAQ方法共鉴定出84种差异表达蛋白质,Label-free方法共鉴定有或无差异蛋白20种。通过Panther软件进行生信分析与主动脉夹层发病机制9种相关蛋白作为候选生物标志物。进行ELISA验证后得出2种差异蛋白Lumican、PI16有统计学差异,且特异性和敏感性较高。结论:蛋白Lumican、PI16可能成为主动脉夹层潜在的诊断标志物。     

血清外泌体来源的microRNA-221-3p在肝细胞癌中的表达及意义

目的探讨肝细胞癌(HCC)患者血清外泌体来源microRNA(miRNA)-221-3p的表达水平及分析其临床意义。方法选取2010年2月-2014年12月南京大学医学院附属南京鼓楼医院经手术治疗后诊断为HCC的66例患者作为HCC组,选取25例同期在本院接受健康检查的体检者作为对照组。通过外泌体提取试剂盒分离HCC组和对照组血清中的外泌体,采用蛋白免疫印迹检测外泌体标记蛋白分子,透射电镜鉴定血清外泌体形态;实时荧光定量PCR方法检测两组血清外泌体来源的miRNA-221-3p表达水平。计量资料两组间比较采用Mann-Whitney U检验,计数资料两组间比较采用χ~2检验。采用Kaplan-Meier方法及logrank检验分析血清外泌体来源的miRNA-221-3p表达与预后关系,采用Cox比例风险回归模型分析预后影响因素。结果血清来源的外泌体是直径为40～100 nm囊泡体,表达HSP70、Alix及CD63。HCC组血清来源外泌体中miRNA-221-3p较对照组表达水平升高,差异具有统计学意义(U=354.00,P0.001)。HCC患者血清外泌体miRNA-221-3p高表达与肿瘤大小(χ~2=6.016,P=0.014)、包膜侵犯(χ~2=7.580,P=0.006)和TNM分期(χ~2=6.340,P=0.012)有关。此外,血清外泌体来源的miRNA-221-3p表达水平较高的HCC患者总体生存率较低,差异具有统计学意义(χ~2=17.105,P0.001)。多因素分析结果表明血清外泌体来源的miRNA-221-3p表达水平(风险比=2.434,95%可信区间:1.178～5.027,P=0.016)及肿瘤分期(风险比=2.653,95%可信区间:1.222～5.760,P=0.014)是影响HCC患者预后的独立危险因素。结论 HCC患者血清外泌体来源的miRNA-221-3p表达水平明显升高,对HCC诊断及预后判断具有参考价值。     

低氧可诱导蛋白2作为新肾癌肿瘤标志物的临床应用

目的探讨定量检测肾癌(RCC)患者和健康人血清中低氧可诱导蛋白2(HIG2)的表达水平及其在临床诊断中的应用。方法本研究首先用已构建好的含有HIG2基因编码区HIG2/pGEX4T-3质粒,与谷胱甘肽-S转移酶(GST)蛋白一起融合表达。经GST亲和层析纯化HIG2融合蛋白,获得的HIG2纯蛋白用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)建立浓度标准曲线,并定量检测100名健康志愿者和100例RCC患者微量血液(血清)标本中的HIG2蛋白浓度。结果 ROC曲线分析结果显示:ELISA双抗体夹心法对两组受试血清HIG2蛋白临床检测的敏感度为76%,特异度为85%。结论 HIG2蛋白作为新的RCC肿瘤标志物在临床诊断上的适用性,并在定性分析的基础上进行定量检测。实验结果为HIG2蛋白作为RCC临床早期诊断的肿瘤标志物提供了可靠的实验依据。     

类风湿关节炎滑膜成纤维细胞来源外泌体提取方法的研究

目的从外泌体分离的常用方法中探索获取高质量人滑膜成纤维细胞外泌体的有效方法。方法分别用超速离心法、尺寸排阻法和改良的聚合物沉淀法3种方法提取人滑膜成纤维细胞外泌体, 采用透射电镜、蛋白质印迹法(Western Blot)、纳米颗粒追踪分析(NTA)鉴定并比较外泌体的形态特征、粒径分布、浓度以及标志蛋白的表达水平。3组差异比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验, 以P<0.05表示差异具有统计学意义。结果 3种方法均能成功提取得到外泌体, 透射电镜下均能观察到典型的"茶托状"结构, 蛋白质印迹法均能检测到标志蛋白肿瘤易感基因101(TSG101)、多配体聚糖结合蛋白1(Syntenin-1)、CD63的表达, 粒径主峰均符合30～150 nm范围。外泌体纯度方面:超速离心法杂质最少, 尺寸排阻法杂质中等, 而改良的聚合物沉淀法可观察到大量的聚合物颗粒和蛋白杂质。外泌体得率方面:3种方法得到的外泌体颗粒浓度差异有统计学意义(F=9.61, P=0.049), 改良的聚合物沉淀法得到的外泌体颗粒浓度高于超速离心法[(98.0±17.0)×1010个/ml和(11.6±...     

外泌体在心房颤动发生中的作用及其应用

研究表明外泌体参与心房颤动(简称房颤)的发生、发展过程,不同来源的外泌体在房颤微环境下携带不同DNA、RNA,尤其是非编码RNA等,特异性作用于靶细胞,调节相应蛋白的表达水平,参与房颤结构重构和电重构的发生。此外,血浆中的外泌体可能成为房颤临床生物学标志物,将外泌体应用于房颤的临床治疗有可能成为新的研究方向。     

shRNA干扰S100A13基因对人甲状腺癌细胞释放成纤维细胞生长因子1的影响

目的 探讨S100A13基因沉默对应激诱导人甲状腺癌细胞(TT细胞)成纤维细胞生长因子1(FGF-1)释放的影响.方法 将S100A13-shRNA pENTRTM/U6入门质粒转染TT细胞,应用实时PCR、间接免疫荧光法及Western印迹方法检测细胞内S100A13基因及蛋白表达的抑制效率,应用间接免疫荧光,RT-PCR及ELISA检测无血清处理TT细胞S100A13沉默后FGF-1释放变化.结果 S100A13-shRNApENTRTM/U6入门载体转染TT细胞后能够抑制S100A13基因及蛋白表达,抑制效率约为80%.间接免疫荧光法显示FGF-1主要位于细胞浆和细胞核,无血清培养6 h后胞浆内FGF-1基本消失.RT-PCR和ELISA结果均显示,S100A13沉默能降低无血清处理TT细胞培养上清中FGF-1的浓度(P＜0.05).结论 S100A13-shRNA pENTRTM/U6入门载体能有效、特异性地抑制S100A13基因及蛋白表达.S100A13基因的抑制可以减弱FGF-1从细胞内释放到细胞外的过程.