Netrin-1对心肌细胞H9c2缺氧复氧损伤中的保护作用研究

目的研究Netrin-1在心肌细胞H9c2缺氧复氧损伤中的作用,并探讨其机制。方法建立心肌细胞H9c2缺氧复氧损伤模型;将A/R+Netrin-1组(转染pcDNA 3.1-Netrin-1)、A/R+Ctrl组(转染pcDNA 3.1)、A/R+Netrin-1+LY294002组(转染pcDNA 3.1-Netrin-1与抑制剂LY294002共处理)、A/R+Netrin-1+DMSO组(转染pcDNA 3.1-Netrin-1与DMSO共处理)均用脂质体法转染H9c2细胞;ELISA检测细胞中LDH、MDA、SOD的含量;MTT法检测细胞活力;WB检测细胞中Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、Netrin-1、p-AKT的蛋白表达;流式细胞术检测细胞的凋亡率。结果与A/R+Ctrl组相比,A/R+Netrin-1组细胞中LDH、MDA含量明显降低,SOD含量明显升高,细胞活力显著升高,Bax、Cleaved caspase-3的蛋白表达量均显著降低,Bcl-2蛋白表达量显著升高,Netrin-1、p-AKT蛋白表达均显著升高,细胞凋亡率显著降低(P0.05);与A/R+Netrin-1+DMSO组相比,A/R+Netrin-1+LY294002组细胞中LDH、MDA含量明显升高,SOD含量明显降低,细胞活力显著降低,Bax、Cleaved caspase-3的蛋白表达量均显著升高,Bcl-2蛋白表达量显著降低,Netrin-1、p-AKT蛋白表达均显著降低,细胞凋亡率显著升高(P0.05)。结论 Netrin-1可通过激活Akt通路促进缺氧复氧心肌细胞活力,抑制凋亡,发挥保护作用,将可为心肌损伤的治疗提供理论依据。     

lncRNA NEAT1调控miR-206对缺氧复氧大鼠心肌细胞氧化应激损伤和凋亡的影响

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)NEAT1调控miR-206对缺氧复氧诱导的心肌细胞氧化应激损伤和凋亡的影响和机制。方法 体外培养H9c2心肌细胞,构建心肌细胞缺氧复氧模型。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测缺氧复氧诱导后lncRNA NEAT1和miR-206的表达水平。将lncRNA NEAT1小干扰RNA(si-lncRNA NEAT1)、miR-206模拟物(miR-206 mimics)分别转染H9c2细胞,缺氧复氧诱导后,检测细胞中丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)含量以及细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved Caspase-3)和cleaved Caspase-9蛋白表达。利用荧光素酶报告基因实验以及RT-qPCR验证lncRNA NEAT1和miR-206的靶向结合关系。结果 缺氧复氧诱导后H9c2细胞中lncRNA NEAT1的表达显著升高,miR-206的表达显著降低(P＜0.05)。转染si-lncRNA NEAT1或miR-206 mimics处理缺氧复氧H9c2细胞,细胞存活率显著升高,MDA、ROS含量以及LDH活性显著降低,cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白的表达显著降低,细胞凋亡率显著降低(P＜0.05)。lncRNA NEAT1靶向miR-206并负调控miR-206表达。抑制miR-206部分逆转沉默lncRNA NEAT1对缺氧复氧诱导的心肌细胞氧化损伤和凋亡的影响(P＜0.05)。结论 沉默lncRNA NEAT1通过上调miR-206可减轻缺氧复氧诱导的心肌细胞氧化应激损伤和细胞凋亡,进而发挥心肌保护作用。     

MicroRNA-181a调控缺氧/复氧诱导下心肌细胞的凋亡

目的:探讨microRNA-181a(miR-181a)对缺氧/复氧诱导下大鼠心肌细胞株H9c2凋亡的作用。方法:通过生物信息学软件筛选出可调控Bcl-2表达的miRNAs。建立H9c2细胞缺氧/复氧模型,通过Western blot检测Bcl-2蛋白表达变化,荧光定量PCR检测miR-181a表达变化。进一步构建Bcl-2的荧光素酶报告载体,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶的表达变化。采用体外合成的大鼠miR-181a的模拟物(mimic)和抑制剂(inhibitor),用脂质体转染培养的H9c2细胞48h后,缺氧/复氧处理细胞,实验分为4组:正常对照组(CTL)、缺氧/复氧组(H/R)、缺氧复氧加miR-181a的模拟物组(mimic)、缺氧复氧加miR-181a的抑制剂组(inhibitor)。TUNEL法检测各组细胞凋亡;Western blot分析各组凋亡关键蛋白cleaved caspase-3的表达量的变化。结果:生物学软件预测miR-181a可调控Bcl-2蛋白的表达,在缺氧/复氧模型中Bcl-2蛋白的表达明显下调,而miR-181a的表达上升近4倍。成功构建双荧光酶素报告载体以及突变体,实验组的报告荧光比对照组明显下降,而突变体的荧光强度下降不明显。与H/R组相比,inhibitor组cleaved caspase-3蛋白、凋亡率下降,mimic组却拮抗了上述变化。结论:miR-181a能够增加氧化应激条件下H9c2心肌细胞损伤,促进H9c2心肌细胞凋亡,miR-181a通过调控Bcl-2蛋白的表达,在H/R介导的凋亡途径中扮演了关键性的作用。     

石蒜碱上调Notch1信号通路并减轻心肌细胞缺氧/复氧诱导的损伤

目的 研究石蒜碱对H9c2心肌细胞缺氧/复氧（H/R）损伤的保护作用及机制。方法 将H9c2心肌细胞随机分为4组：对照组、H/R组、H/R+石蒜碱低剂量组、H/R+石蒜碱高剂量组；使用CCK-8分析H9c2心肌细胞活力；用试剂盒测定乳酸脱氢酶（LDH）释放量，丙二醛（MDA）和活性氧簇（ROS）的含量，超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性；用流式细胞仪检测细胞凋亡率；Western blot检测Notch1蛋白水平；用Realtime聚合酶链反应检测HES-1、HES-5和Hey-1 mRNA水平。结果 与对照组比较，H/R组H9c2心肌细胞的活力减弱（P<0.05）,SOD和GSH-Px的活性减弱（P<0.05），细胞凋亡率，LDH释放量，MDA和ROS含量，Notch1蛋白水平，HES-1、HES-5和Hey-1 mRNA水平均增加（P<0.05）；与H/R组相比，石蒜碱低、高剂量组H9c2心肌细胞的活力增强（P<0.05）,SOD和GSH-Px的活性增强（P<0.05），细胞凋亡率，LDH释放量，MDA和ROS含量均降低（...     

当归多糖对缺氧-复氧损害H9c2心肌细胞的保护作用

目的探讨当归多糖(angelica sinensis polysaccharide,ASP)对缺氧-复氧损害H9c2心肌细胞的保护作用。方法噻唑蓝[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]检测ASP对H9c2细胞增殖的影响;在体外ASP培养后,再缺氧-复氧培养H9c2心肌细胞为实验组,以正常培养细胞为对照组,以仅缺氧-复氧培养细胞为缺氧-复氧组。观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(2′,7′-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)检测细胞活性氧水平;生化检测细胞丙二醛(malondialdehyde,MDA)、8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine,8-OHdG)浓度;实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(humanγ-glutamyl systeine synthetase,γ-GCS)、红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、醌氧化还原酶1[NAD(P)H dehydrogenase 1,NQO1]mRNA表达;Western bloting实验检测细胞B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X(Bcl-2-Associated X,Bax)、核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)蛋白浓度。结果在常氧环境中ASP可浓度-时间依赖地抑制H9c2细胞增殖;缺氧-复氧诱导H9c2细胞显著凋亡(P0.05)、活性氧水平显著升高(P0.05),同时造成活性氧清除相关酶γ-GCS、HO-1、NQO1 m RNA表达及Nrf2蛋白表达显著下调(P0.05);而ASP可浓度依赖地显著抑制缺氧-复氧诱导的H9c2细胞凋亡(P0.05),降低缺氧-复氧诱导的H9c2细胞活性氧水平(P0.05),显著提高缺氧-复氧诱导的H9c2细胞中γ-GCS、HO-1、NQO1mRNA表达及Nrf2蛋白表达(P0.05)。结论 ASP可上调Nrf2表达,提高心肌细胞内抗氧自由基酶的表达,降低由缺氧-复氧所导致心肌细胞的氧化应激水平,抑制心肌细胞凋亡。     

卡维地洛通过PI3K/AKT/GSK3β信号通路对H9c2缺氧/复氧损伤的保护

目的:研究卡维地洛预处理对缺氧/复氧诱导的大鼠心肌细胞保护作用及其机制。方法:对大鼠心肌细胞株(H9c2)进行缺氧/复氧(6h/2h),模拟大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,将H9c2细胞随机分成四组:正常对照组(control组)、缺氧/复氧组(H/R组)、缺氧/复氧+卡维地洛预处理组(H/R+CAR组)、缺氧/复氧+卡维地洛+PI3K/AKT阻滞剂LY294002组(H/R+CAR+LY294002组);分别采用MTT法检测心肌细胞活力,流式细胞仪法检测心肌细胞活性氧(ROS)水平,Western免疫印迹法检测心肌细胞Caspase-3、p-AKT、p-GSK3β蛋白表达情况。结果:与正常组相比,H/R组细胞活力下降,ROS水平升高,Caspase-3表达明显增多;经卡维地洛预处理后,细胞活力明显提高、p-AKT、p-GSK3β磷酸化水平较H/R组显著增加,ROS水平明显降低,而加入PI3K/AKT阻滞剂LY294002后卡维地洛的上述作用显著减弱。结论:卡维地洛预处理能显著减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤,对心肌细胞具有明显的保护作用,其可能的作用机制是通过激活PI3K/AKT/GSK3β通路而提高AKT、GSK3β磷酸化水平,减少ROS产生,增加细胞的活性而实现的。     

丁苯酞激活Hedgehog信号通路抑制缺氧复氧心肌细胞氧化应激、炎症、凋亡的机制研究

目的探讨丁苯酞(NBP)对缺氧复氧(H/R)心肌细胞氧化应激、炎症、细胞凋亡的影响及其分子机制。方法将心肌细胞分为空白组、H/R组、NBP-L组(NBP浓度为2μmol/L)、NBP-M组(NBP浓度为10μmol/L)、NBP-H组(NBP浓度为50μmol/L)。噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,酶联免疫(ELISA)法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)水平,试剂盒检测活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平,蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、活化的多聚ADP-核糖聚合酶(cleaved PARP)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)、PTCH、Smoothened(SMO)和Gli-1蛋白表达。使用Hedgehog信号通路抑制剂HPI-4处理心肌细胞,观察其对丁苯酞诱导的缺氧复氧心肌细胞氧化应激、炎症、凋亡的影响。结果与空白组比较,H/R组心肌细胞存活率、cyclinD1、CDK2蛋白表达量、SOD活性、PTCH、SMO和Gli-1蛋白表达量明显减少(P0.05),H/R组心肌细胞凋亡率、cleaved PARP、cleaved caspase-3蛋白表达量、TNF-α、IL-6、IL-1β、ROS、MDA水平显著增加(P0.05)。与H/R组比较,NBP-L、NBP-M、NBP-H组显著提高H/R心肌细胞存活率、cyclin D1、CDK2蛋白表达量、SOD活性(P0.05),显著降低心肌细胞凋亡率、cleaved PARP、cleaved caspase-3蛋白、TNF-α、IL-6、IL-1β、ROS、MDA水平、PTCH、SMO和Gli-1蛋白水平(P0.05)。HPI-4部分逆转丁苯酞对缺氧复氧心肌细胞的保护作用。结论丁苯酞通过激活Hedgehog信号通路,促进缺氧复氧心肌细胞增殖,并抑制缺氧复氧心肌细胞氧化应激、炎症、凋亡。     

miR-141-3p靶向调控Keap1对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡、氧化应激和Nrf2/HO-1通路的影响

目的:探讨miR-141-3p通过靶向调控Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)对缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞氧化应激、凋亡和Nrf2/血红素氧合酶1(HO-1)通路的影响。方法:体外培养大鼠胚胎心肌细胞H9c2,构建心肌细胞H/R损伤模型。将H9c2细胞随机分为control组(正常培养的H9c2细胞)、H/R组(H9c2细胞经H/R处理)、H/R+miR-NC组(H9c2细胞NC转染经H/R处理)和H/R+miR-141-3p组(H9c2细胞转染miR-141-3p经H/R处理),每组设3个复孔。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法检测不同组别心肌细胞中miR-141-3p和Keap1表达水平,细胞毒性试验(CCK-8)法检测心肌细胞存活率,流式细胞术检测心肌细胞凋亡,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组心肌细胞中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)表达水平,化学荧光法检测各组心肌细胞活性氧(ROS)含量,蛋白免疫印迹法(Western Blotting)检测Nrf2、HO-1蛋白表达,双荧光素酶报告基因实验和Western Blo...     

氧化应激在七氟醚保护大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用

目的探讨七氟醚预处理对缺氧/复氧（H/R）引起的心肌细胞损伤的保护作用及氧化应激在其中的作用。方法将H9 c2细胞随机分为正常对照组（C组）、H/R组及七氟醚预处理组（S组）,缺氧2 h后复氧1 h,观察心肌细胞活力及细胞内活性氧,同时检测心肌细胞超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量。结果与C组比较,H/R组细胞存活显著减少,细胞内活性氧增多,SOD及GSH-Px活性减弱,MDA含量增多（P均〈0.05）;与H/R组比较,S组细胞存活显著增多,细胞内活性氧减少,SOD及GSH-Px活性增强,MDA含量减少（P均〈0.05）。结论七氟醚可能通过抑制心肌细胞活性氧产生、增强抗氧化酶活性以减轻心肌细胞的H/R损伤。     

红花黄色素对心肌细胞H9C2的保护研究

目的探讨红花黄色素调控缺氧/复氧后心肌细胞对H9C2氧化应激的潜在机制。方法红花黄色素处理缺氧/复氧后心肌细胞H9C2后,检测其氧化应激指标丙二醛(MDA),过氧化氢酶(CAT),超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的水平。实时荧光定量PCR检测氧化应激关键基因的表达水平。RNA-seq检测红花黄色素处理后心肌细胞H9C2的miRNA表达差异。表达差异miRNA检测氧化应激关键基因的表达水平。结果红花黄色素处理缺氧/复氧后心肌细胞H9C2后,MDA的水平下降(P0.05),SOD、CAT、GSH-Px的水平上升(P0.05)。红花黄色素处理缺氧/复氧后心肌细胞H9C2后,氧化应激关键基因MPO的表达水平下降(P0.05),SOD2,CAT,谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达水平上升(P0.05)。过表达hsa-miR-887-5p时MPO的表达水平下降(P0.05)、过表达hsa-miR-382-5p时SOD2的表达水平下降(P0.05)、过表达hsa-miR-639时CAT2的表达水平下降(P0.05)、过表达hsa-miR-761时GPX4的表达水平下降(P0.05)。结论红花黄色素通过调控hsa-miR-382-5p、hsa-miR-887-5p、hsa-miR-639、hsa-miR-761的表达水平,分别靶向SOD2,MPO,CAT,GPX4 mRNA的3端非编码区,之后调控其表达水平,最终调节缺氧/复氧后心肌细胞H9C2的氧化应激。