RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌顺铂敏感性的影响

目的研究ERCC1基因表达与卵巢癌顺铂耐药的关系。构建携带ERCC1基因小发夹干扰RNA的重组质粒表达载体,观察RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌顺铂敏感性的影响。方法RT-PCR方法检测COC1、COC1/DDP细胞中ERCC1基因表达,基因重组技术构建携带ERCC1小发夹干扰RNA的重组质粒表达载体,脂质体法转染COC1/DDP细胞,RT-PCR及westernblot方法检测转染后细胞内ERCC1mRNA和蛋白的表达,MTT法检测转染后细胞对顺铂敏感性的改变。结果COC1/DDP细胞中ERCC1基因表达明显高于COC1细胞。重组质粒转染后,COC1/DDP细胞中ERCC1mRNA和蛋白表达显著下调。转染后细胞对顺铂的敏感性显著增加。结论COC1/DDP中ERCC1基因表达增强与卵巢癌顺铂耐药相关。RNA干扰抑制ERCC1基因表达能增加卵巢癌耐药细胞COC1/DDP对顺铂的敏感性。     

切除修复交叉互补基因表达与卵巢癌细胞顺铂耐药的关系

目的:探讨卵巢癌细胞系COC1、COC1/DDP、A2780、A2780/DDP中切除修复交叉互补基因(ERCC1)表达与顺铂耐药的关系.方法:采用RT-PCR方法检测4种卵巢癌细胞系中ERCC1基因的表达,MTT检测各细胞系对顺铂的敏感性.结果:4种细胞系中均有ERCC1基因表达,耐药细胞中的表达量明显高于敏感细胞(P＜0.05).DDP作用于COC1、COC1/DDP细胞72小时后,随着ERCC1基因表达的升高,细胞对顺铂的耐药性增加.结论:卵巢上皮性癌细胞系中ERCC1基因表达的升高与卵巢癌顺铂耐药相关.     

卵巢癌细胞系Smac基因的表达及意义

目的 探讨Smac基因在卵巢癌细胞系A2780、COC1及其顺铂(DDP)耐药株A2780/DDP、COC1/DDP中的表达及其意义.方法 半定量逆转录-聚合酶链反应和免疫印迹法检测卵巢癌细胞A2780、COC1及其顺铂耐药株A2780/DDP、COC1/DDP中Smac mRNA和蛋白的表达.结果 卵巢癌细胞A2780、COC1及其顺铂耐药株A2780/DDP、COC1/DDP四种细胞系中均有Smac mRNA和蛋白的表达;Smac在A2780、COC1中的表达高于其顺铂耐药株.结论 低表达Smac抑制凋亡,低表达Smac可能与耐药有关.     

Bcl2-siRNA提高人肺腺癌细胞A549/DDP对顺铂敏感性的研究

目的 探讨Bcl2-siRNA 对人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP 对顺铂敏感性的影响.方法 在人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP 细胞中转染bcl2-siRNA,48h 后加入不同浓度(0、3、6、9、12、15μg/ml) 新鲜配置的顺铂溶液,药物作用48h后,用CCK-8 法检测细胞生长抑制率.荧光实时定量PCR(Real time RT-PCR) 检测A549/DDP 细胞转染bcl2-siRNA 后Bcl-2mRNA 的变化,Western Blot 检测A549/DDP 细胞转染bcl2-siRNA 后Bcl-2 蛋白的变化.结果 在A549/DDP 细胞中转染bcl2-siRNA 后,细胞Bcl-2 mRNA 降低92.6%(P<0.05),Bcl-2 蛋白表达也明显降低,同时细胞对顺铂的敏感性增加57.8%(P<0.05).结论 Bcl2-siRNA 能降低A549/DDP 中Bcl-2 mRNA 及蛋白的表达,增加A549/DDP 对顺铂的敏感性.     

抑制ERCC1基因对肺癌细胞顺铂敏感性的影响

目的 探讨RNA干扰切除修复交叉互补基因(ERCC)1对肺腺癌细胞A549顺铂敏感性的影响.方法 体外设计合成针对ERCC1基因的小干扰RNA(siRNA).转染肺腺癌细胞A549,应用RT-PCR、Western印迹和免疫细胞化学方法检测转染后ERCC1基因mRNA和蛋白的改变,应用四唑盐比色(MTT)法检测干扰ERCC1基因后A549细胞对顺铂敏感性的变化.结果 转染针对ERCC1基因的siRNA后24、48、72 h,A549细胞ERCC1基因mRNA和蛋白水平显著下降;关闭ERCC1基因后,A549细胞对顺铂的敏感性增加3.07倍.结论 RNA干扰ERCC1基因能增加肺腺癌A549细胞对顺铂的敏感性.     

hMLH1基因对人卵巢癌耐药细胞株顺铂敏感性的研究

目的 探讨错配修复基因hMLH1对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP顺铂耐药的逆转作用及其机制.方法 分别用重组质粒pcDNA3.1-hMLH1和空质粒pcDNA3.1转染SKOV3/DDP细胞.RT-PCR和Western blot检测hMLH1的表达.MTT检测转染前后SKOV3/DDP细胞对顺铂敏感性的变化.经顺铂DDP作用后,流式细胞术和Western blot法检测细胞凋亡情况.结果 与对照组相比,瞬时转染24 h后,SKOV3/DDP细胞中hMLH1 mRNA和蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05).MTT结果显示,转染细胞的IC50值(13.95±2.45)较未转染的细胞(94.16±5.18)明显减小.流式细胞仪和Western blot检测结果表明,顺铂作用24 h后,转染了重组质粒的耐药细胞的凋亡率提高到(33.33±2 31)%,同时凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达受到抑制(1.35±0.39),与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 hMLH1基因能增强卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性,其机制可能与降低该耐药细胞内Bcl-2的表达水平,促进细胞凋亡有关.     

拓扑替康对COC1/DDP凋亡诱导作用及分子机制的初步探讨

目的探讨拓扑替康（TPT）对人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP的杀伤和诱导凋亡活性及其作用机制。方法MTT法与软琼脂克隆形成测定TPT对人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP的杀伤效应;流式细胞仪研究TPT对靶细胞的早期凋亡诱导作用;透射电镜观察细胞的凋亡形态;采用Western Blot印迹杂交法以检测TPT对凋亡相关蛋白bcl-2和bax表达的影响。结果TPT对COC1/DDP细胞有明显细胞毒性作用,有明显的剂量依赖性;COC1/DDP细胞在TPT作用后出现特征性凋亡形态特征,且对早期凋亡的诱导作用呈剂量依赖性（P〈0.05）。经TPT作用后,COC1/DDP细胞内bax蛋白增加,而bcl-2蛋白不表达,bax/bcl-2比值增加。结论TPT对人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP有明显的杀伤和促凋亡作用,其机制可能与bax蛋白高表达及bcl-2蛋白不表达有关。     

凋亡相关基因及蛋白的表达与人卵巢癌细胞顺铂耐药的关系

目的探讨COC1/DDP和COC1中凋亡相关基因及凋亡相关蛋白的表达与人卵巢癌顺铂耐药的关系。方法采用流式细胞仪检测不同浓度顺铂作用于COC1及COC1/DDP细胞48h后细胞凋亡率;RT-PCR及Western blot法检测凋亡相关基因及蛋白Bcl-2、Caspase-3、Smac和Survivin在COC1和COC1/DDP中的表达。结果DDP作用于COC1和COC1/DDP细胞48h后细胞随着DDP浓度的升高,凋亡率也相应增高。COC1/DDP中抗凋亡基因及蛋白Bcl-2、Survivin的表达明显高于COC1。COC1/DDP中促进凋亡的基因及蛋白Smac、Caspase-3的表达明显低于COC1。结论在COC1/DDP中抗凋亡基因及蛋白Bcl-2、Survivin的高表达以及促进凋亡的基因及蛋白Smac和Caspase-3的低表达可能参与COC1/DDP对DDP耐药的发生机制。     

姜黄素对卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP的增敏作用及其机制的研究

目的:探讨姜黄素对卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP的增敏作用并探讨其机制.方法:采用MTT法检测姜黄素对COC1/DDP细胞的增敏作用;用流式细胞仪检测单用顺铂、单用姜黄素、顺铂与姜黄素合用作用于COC1/DDP细胞48 h后的细胞凋亡率;Western blot法检测单用顺铂及顺铂与姜黄素合用后各组细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3、Survivin的表达.结果:姜黄素浓度在15～35 μmol/L以内时以一定的剂量-效应关系对COC1/DDP有明显的增殖抑制作用.顺铂的浓度在1.25～5 mg/L时加入20 μmol/L姜黄素后耐药细胞生存率下降明显(P＜0.05),尤以2.5 mg/L顺铂和20 μmol/L姜黄素联合作用时,耐药细胞生存率下降最明显;COC1/DDP中顺铂与姜黄素联合用药与单独用顺铂及单用姜黄素相比,凋亡率明显增加(P＜0.05);顺铂与姜黄素联合用药与单独用顺铂相比Bcl-2、Survivin蛋白的表达明显降低(P＜0.05),Caspase-3蛋白的表达明显增高(P＜0.05).结论:姜黄素能够显著抑制COC1/DDP增殖,并能增强该细胞系对顺铂的敏感性,其机制可能与降低Bcl-2、Survivin蛋白的表达,增加Caspase-3蛋白的表达有关.     

功能蛋白在氯化镧逆转卵巢癌顺铂耐药中的差异表达分析

目的 从蛋白质水平研究氯化镧对人卵巢癌顺铂耐药细胞(COC1/DDP)功能蛋白表达的影响,为探讨氯化镧逆转卵巢癌顺铂耐药的机制提供实验依据.方法 取对数生长期COC1/DDP细胞分为4组,对照组只加入10%胎牛血清培养基培养,顺铂组加入23.08 μg/mL顺铂,氯化镧组和氯化镧+顺铂组分别加入1.5 μmol/L氯化镧,处理8 h后氯化镧+顺铂组加入23.08 μg/mL顺铂.采用蛋白印迹(Western blot)技术检测顺铂和氯化镧分别作用于COC1/DDP后,4组中ERCC1、Ki67、CDK6、HDAC2、c-Cbl和微管末端结合蛋白1(EB1)6种功能蛋白的表达变化.结果 与对照组相比,COC1/DDP的4种功能蛋白ERCC1、Ki67、CDK6、c-Cbl在顺铂组和顺铂+氯化镧组中表达显著下调,差异有统计学意义(P<0.05);且顺铂+氯化镧组较顺铂组表达明显下调,差异有统计学意义(P<0.05).与对照组比较,顺铂组中HDAC2和EB1表达明显下调,差异有统计学意义(P<0.05);顺铂+氯化镧组与顺铂组、氯化镧组中表达比较有下降趋势,但差异无统计学意义(P>0.05).结论 氯化镧可能通过多种途径下调ERCC1、Ki67、CDK6和c-Cbl表达,从而介导逆转卵巢癌顺铂耐药.     

Mifepristone对卵巢癌细胞的单己糖神经酰胺表达及耐药性的影响

目的研究单己糖神经酰胺在卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP对顺铂耐药性中的作用,探索mifepristone对COC1/DDP细胞耐药性逆转的机制.方法将耐药细胞分为顺铂组、顺铂+mifepristone组,MTT方法检测各组细胞抑制率;采用改良的Hahomori方法分别提取、纯化耐药细胞COC1/DDP(用mifepristone处理前后)和敏感细胞COC1的中性鞘糖脂,高效薄层层析、凝胶光密度成像系统分析各组CMH的差异将耐药细胞分为三组顺铂组、mifepristone组、顺铂+mifepristone组,用透射电镜观察各组细胞的超微形态结构变化.结果mifepristone可以逆转COC1/DDP细胞对顺铂的耐药性,1.25μmol/L的mifepristone与浓度为(0.1～1.25)μg/ml的顺铂联合应用,使细胞的抑制率从单用上述浓度顺铂时的(8.84±6.29)%～(17..71±8.00)%上升为(15.26±6.75)%～(27.15±7.69)%(P＜0.001),且有剂量依赖性.耐药细胞的CMH表达率为(37.14±3.34)%,明显高于敏感细胞的(14.05±1.44)%(P＜0.001),耐药细胞经1.25μmol/L、5μmol/L mifepristone处理后,CMH分别下降到(26.62±2.63)%(P＜0.05)和(17.50±0.67)%(P＜0.001).顺铂和mifepristone联合作用,透射电镜观察到耐药细胞出现异染色质浓缩、边聚,产生了凋亡小体.结论mifepristone在较低浓度即可逆转卵巢癌细胞COC1/DDP对顺铂的耐药性,其增敏机制可能与抑制单己糖神经酰胺的表达、促进细胞凋亡相关.     

bcl-2基因表达在人卵巢癌多药耐药现象中的作用

为探讨凋亡抑制基因bcl-2的表达在人卵巢癌顺铂耐药现象中的作用,采用DNA电泳,流式细胞仪技术及逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,分别对顺铂诱导的人卵巢癌细胞敏感株COC1及耐药株COC1/DDP的细胞凋亡及其bcl-2基因表达进行研究.结果发现①不同浓度顺铂作用下敏感细胞株和耐药细胞株中均见凋亡梯度,且随顺铂浓度的增加凋亡梯度增大.②不同浓度顺铂作用下流式细胞仪分析结果显示耐药细胞株中凋亡率明显低于敏感细胞株(P＜0.05).③耐药细胞株中bcl-2基因表达明显强于敏感细胞株.在顺铂作用下敏感细胞株和耐药细胞株中bcl-2基因表达下调.结果表明顺铂可诱导卵巢癌细胞凋亡;凋亡抑制基因bcl-2在人卵巢癌多药耐药细胞中高表达,是导致其细胞凋亡受抑制的重要原因.     

米非司酮对卵巢癌细胞2的增敏作用及其机制的研究

OBJECTIVE: To observe the effect of mifepristone in enhancing chemosensitivity of drug-resistant ovarian cancer cell line to cisplatin and investigate its mechanism. METHODS: Human ovarian cancer cell lines COC1 (DDP-sensitive) and COC1/DDP (DDP-resistant) were incubated with or without mifepristone. The proliferation rate of the cells was determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay and positive expression of apoptosis-associated proteins Bcl-2 and Bax were observed by means of flow cytometry. RESULTS: It was observed that mifepristone at the dose of 1.25 micromol/L reversed the resistance of COC1/DDP cells to cisplatin, and Bcl-2 protein expression was deceased from (23.8067+/-0.4382)% to (19.3967+/-0.6866)% (P=0.000) while Bax protein expression increased from (12.75+/-0.2524)% to (25.5967+/-0.8834)% (P=0.000). CONCLUSION: Mifepristone may act to enhance the sensitivity of COC1/DDP cells to cisplatin, possibly through regulating Bcl-2 and Bax protein expressions.     

CIK逆转耐顺铂人肺腺癌细胞对顺铂耐药与ERCC1的相关性

目的观察脐血来源的CIK细胞对A549/DDP细胞的耐药逆转作用。并探讨CIK逆转耐药机制是否与核苷酸切除修复交叉互补基因1（excision repair cross complementation group 1,ERCC1）的表达存在相关性。方法采集脐血单个核细胞经细胞因子体外诱导获得CIK细胞（cytokine induced killer cells,CIK）,MTT法检测顺铂（cisplatin,DDP）对A549细胞和A549/DDP细胞的体外杀伤作用,以及CIK细胞与A549/DDP细胞共培养前后对DDP敏感性的变化。Real-time RT-PCR法检测A549细胞、A549/DDP细胞以及CIK干预后的A549/DDP细胞中ERCC1 mRNA的表达情况。Western blot法检测A549细胞、A549/DDP细胞以及CIK干预后的A549/DDP细胞中ERCC1蛋白的表达情况。结果 A549/DDP细胞对DDP耐药,耐药指数为2.391。CIK细胞能逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性,逆转倍数为3.967。Real-time RT-PCR、Western blot测得A549/DDP细胞中ERCC1 mRNA和蛋白表达量比A549细胞高（P〈0.05）,CIK细胞共培养前后A549/DDP细胞中ERCC1 mRNA和蛋白表达量无明显变化。结论 CIK细胞能逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性,其逆转耐药的机制与ERCC1的表达无明显相关性。     

川芎嗪对人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP的逆转作用研究

目的建立人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP,探讨川芎嗪对COC1/DDP顺铂耐药性的逆转作用及其机制。方法采用逐步递增DDP浓度、体外间歇诱导法诱导建立人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP;CCK-8(cell counting kit-8)检测川芎嗪对COC1/DDP细胞顺铂耐药性的逆转作用;GSH和GSSG试剂盒检测细胞内GSH的水平,高效液相色谱测定细胞内顺铂的含量。结果历时5个月建立了在1.0μg/mL DDP作用下生长良好的耐药细胞株COC1/DDP,耐药指数为9.44,对卡铂、长春新碱和阿霉素有不同程度的交叉耐药性;川芎嗪0.25 mg/mL对COC1/DDP的顺铂耐药性有逆转作用,逆转倍数达到3.76倍;与COC1比较,COC1/DDP细胞内GSH水平增高,顺铂含量下降,但经川芎嗪0.25 mg/mL干预后,COC1/DDP胞内的GSH水平降低,顺铂的含量增加(P<0.01)。结论川芎嗪对COC1/DDP的顺铂耐药性有逆转作用,其机制可能与干预COC1/DDP细胞内GSH/GST-π解毒系统,增加细胞内顺铂的含量有关。     

卵巢癌顺铂耐药细胞中DNA转录与修复相关基因的表达

目的 研究DNA转录与修复相关基因的表达与卵巢癌顺铂耐药性之间的关系。方法 以卵巢癌亲本细胞系COC1为对照,应用cDNA微阵列检测其顺铂耐药细胞系COC1/DDP中DNA转录与修复相关基因的表达。结果和结论 与COC1细胞相比,COC1/DDP细胞有143个基因的表达水平发生改变,其中共有20个DNA转录与修复相关基因的表达发生改变,表达上调的有13个基因,表达下调的有7个基因,包括CAD、DDB1、DDIT4等大量DNA修复基因以及一般转录因子RNA多聚酶Ⅰ、Ⅱ基因和DHX9、DDX3X基因的表达上调以及MLH1和BTF3基因的低表达,提示COC1/DDP细胞对顺铂的耐药性与DNA转录和损伤修复能力的异常有关。     

卵巢癌顺铂耐药细胞中DNA转录与修复相关基因的表这

目的 研究DNA转录与修复相关基因的表达与卵巢癌顺铂耐药性之间的关系。方法 以卵巢癌亲本细胞系COC1为对照，应用cDNA微阵列检测其顺铂耐药细胞系COC1／DDP中DNA转录与修复相关基因的表达。结果 和结论与COC1细胞相比．COC1／DDP细胞有143个基因的表达水平发生改变，其中共有20个DNA转录与修复相关基因的表达发生改变，表达上调的有13个基因，表达下调的有7个基因，包括CAD、DDB1、DDIT4等大量DNA修复基因以及一般转录因子RNA多聚酶Ⅰ、Ⅱ基因和DHX9、DDX3X基因的表达上调以及MLH1和BTF3基因的低表达．提示COC1／DDP细胞对顺铂的耐药性与DNA转录和损伤修复能力的异常有关。