透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在阿维链霉菌的整合表达

pHZ1276是透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的诱导型表达载体，携带有硫链丝菌素诱导的强启动子PtipA和ФC31int，attP基因使载体整合在染色体上。本研究利用组成型启动子ermP1P2替代pHZ1276上的诱导型启动子PtipA构建了组成型表达血红蛋白基因的质粒pHZ1291。将vgb基因去掉后构建了组成型链霉菌表达载体pHZ1294。将pHZ1276。pHZ1291导人阿维链霉菌(Streptomyces avermitiHs)NRRL8165，所得重组子经Southern杂交验证后，蛋白粗提物经Western杂交和CO结合实验表明vgb基因在该菌中表达出了有活性的VHb蛋白。     

透明颤菌血红蛋白基因的克隆及其在林可链霉菌中的表达

目的通过将透明颤菌血红蛋白基因vgb克隆到林可链霉菌染色体黑色素生物合成基因m elC位点,使m elC基因被破坏失活,vgb基因实现表达同时提高林可霉素产量。方法构建大肠杆菌-链霉菌重组质粒pYHT04,通过接合转移实验将重叠延伸PCR得到的具有红霉素抗性基因启动子的透明颤菌血红蛋白基因,以双交换的方式整合进林可链霉菌黑色素生物合成基因m elC中。采用不同装瓶量摇瓶发酵,HPLC检测发酵液中林可霉素含量。结果重组菌株颜色变浅,CO结合差光谱显示在420 nm处有明显吸收峰,随着装瓶量的增加重组菌株发酵液中林可霉素效价与对照菌株相比降低幅度较小。结论重组菌株m elC基因失活不能继续合成黑色素,vgb基因得到表达并表现出生物学功能,限氧条件下重组菌株发酵液中林可霉素效价高于对照菌株,有希望应用于工业发酵生产。     

透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在那西肽产生菌—活跃链霉菌中的表达

目的将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)整合到那西肽产生菌—活跃链霉菌(Streptomyces actuo-sus)的染色体上进行表达,从而提高菌体对溶解氧的利用,提高那西肽的发酵产量。方法采用分子生物学方法构建了携带vgb的重组质粒pZV02,采用接合转移的方法将其导入那西肽产生菌—活跃链霉菌中,采用抗生素抗性标记筛选法获得了基因重组菌株。结果在低溶氧的发酵条件下,重组菌株的那西肽产量显著高于对照菌株。结论 vgb在活跃链霉菌中的表达,可以改善菌体对溶解氧的利用,在低溶氧的条件下可以提高发酵产物那西肽的产量。     

透明颤菌血红蛋白基因在龟裂链霉菌中的表达及其对土霉素合成的影响

目的 考察透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在大肠埃希菌(E. coli)和龟裂链霉菌(S. rimosus)中的表达,研究在不同溶氧条件下表达的透明颤菌血红蛋白(VHb)对龟裂链霉菌生长和土霉素合成的影响。方法 将vgb插入表达型质粒pET-28a中,导入E. coli BL21(DE3)用以表达VHb并测定其活性。以整合型质粒pSET152为载体,利用ermE*启动子组成型表达vgb基因,将构建的质粒通过接合转移整合到S. rimosus M4018基因组上,利用CO差示光谱法和SDS-PAGE鉴定两个重组菌中的血红蛋白。在5L罐上考察不同溶氧条件下VHb的表达对重组龟裂链霉菌生长和土霉素合成的影响。结果 重组大肠埃希菌和重组龟裂链霉菌都能够表达具有生物活性的VHb,发酵结果表明,在117h时与对照菌相比,重组龟裂链霉菌在高氧和低氧条件下的干重分别提高了6%和32%,同时单位干重土霉素的产量分别提高了41%和93%。结论 VHb在重组龟裂链霉菌中成功表达,改善了菌体的生长和土霉素的合成,为解决工业发酵过程中氧限制问题提供了策略。     

链霉菌噬菌体1010和P13启动子在大肠杆菌中的克隆和表达

将螺旋链霉菌噬菌体1010和红霉菌噬菌体P13的San3A和HindⅢ酶切片段分别插入启动子探测质粒pGA46的BgIⅡ和HindⅢ位点,在大肠杆菌中获得了氯霉素抗性、四环素抗性的重组质粒。限制性内切酶酶切产物的电泳分析和DNA分子杂交分析结果表明重组质粒确由载体pGA46和噬菌体酶切片段连接而成。以限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、SolⅠ等对重组质粒进行酶切分析,并应用限制性内切酶和核酸酶BAl-31酶切重组质粒pSS31中的噬菌体DNA插入顺序。得到分子量由1.2Kb缩短至0.25Kb而仍保留启动子功能的片段,用大肠杆菌的启动子探测质粒pGA46作为载体分别克隆于San3A和HindⅢ酶切的大肠杆菌的启动子和探测质粒,在含有抗生素的培养基上分别选择T_c~r和C_m~r转化子。     

透明颤菌血红蛋白基因在产黄青霉中的克隆与表达

将透明颤菌血红蛋白基因（vg6）克隆至质粒载体pMK4中，构建成表达载体pMK4-LV，并将表达载体pMK4-LV转化青霉素生产菌株——产黄青霉的原生质体，获得转化子。经发酵实验表明，vg6的表达可以使产黄青霉的生物量提高9．76％，青霉素的产量提高9．68％。     

外源基因在链霉菌中的表达

链霉菌是一类好氧、丝状的革兰阳性菌,广泛存在于土壤中.在业已发现的7000多种抗生素中,有60%以上是由链霉菌产生的.此外,它还产生了一些重要的工业用酶,例如纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、木质素酶、木聚糖酶、淀粉酶、胰蛋白酶等.这些酶可以将一些无用的森林、农业废物转化为有用的石油、动物饲料或工业原料,并被应用于一些工业生产过程中(如造纸工业).所以,链霉菌是一个非常重要的工业微生物.链霉菌在其土壤生存环境中,必须大量地分泌各种胞外酶,以便将土壤中的多种有机物质分解成可以被自己吸收利用的小分子营养物质,以利于自己的生存.这说明链霉菌中存在着一种高效分泌蛋白质的机制.近年来,链霉菌作为基因工程的宿主菌已得到了广泛的研究,并建立了卓有成效的导入外源基因的方法.由于链霉菌具有很强的蛋白质分泌能力,它作为蛋白质分泌的宿主菌有着大肠杆菌无可比拟的优点,即可使蛋白质的分离纯化过程较为简化和经济,因此,它引起了人们的兴趣并对此进行了深入的研究.目前,已在与蛋白质的分泌有关的诸方面取得了一些可喜的研究进展.本文将从宿主载体系统、启动子、信号肽、密码便向、终止于、分泌机制及目前已成功地表达分泌的外源蛋白等几个方面加以描述.     

透明颤菌血红蛋白基因在生黑葡萄糖酸杆菌中的克隆与表达

目的在生黑葡萄糖酸杆菌中克隆并表达透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla Hemoglobin gene,vgb)。方法构建重组质粒p UC19-vgb并电转化生黑葡萄糖酸杆菌。采用十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfonate,SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和一氧化碳(carbon monoxide,CO)-示差光谱进行血红蛋白表达和生物活性测定。结果 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示有大量与目的蛋白大小相当(约15 ku)的蛋白表达。CO-示差光谱在420 nm处有一吸收峰,显示重组质粒p UC19-vgb成功转化入生黑葡萄糖酸杆菌,并表达具有生物活性的透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla Hemoglobin,VHb)。结论成功构建vgb重组质粒,并实现在生黑葡萄糖酸杆菌中表达VHb。     

生米卡链霉菌启动子的克隆和表达

用高拷贝启动子探针质粒pIJ486为载体,变青链霉菌(S.lividans)TK24为受体,克隆并表达了生米卡链霉菌(S.mycarofaciens)的启动子,得到了对新霉素抗性不同的5个转化子。其中对新霉素有高抗性的转化子中重组质粒pIJM2的插入片段约为2kb,将 pIJM2转化生米卡链霉菌SM90919原生质体,得到新的转化子SM9pM201和SM9pM205,从SM9pM205菌株中分离到的质粒要比pIJ486和pIJM2小,约3.5kb。     

链霉菌抗生素生物合成基因的克隆策略

链霉菌具有许多不同于其它原核生物(如大肠杆菌等)的生物学特性,它们在生长过程中常伴有营养菌丝、气生菌丝和顶端结成孢子等形态分化类似霉菌的特性。链霉菌含有一个单环染色体,其基因组大小约10~4kb(近似大肠杆菌的3倍),在DNA组成中G+C含量高达70mol%以上,接近自然界中所观察到的上限。这些生物学上的差异使得链霉菌不能用其它遗传上了解得很清楚的原核系统进行研究,而必须自成研究体系。近年来,链霉菌自身的质粒和噬菌体载体系统的开发进展迅速。利用这些体系统已经分离获得了包括抗生素抗性基因、初级代谢方面的基因、各种输出酶基因、形态分化基因以及许多抗生素(如红霉素、四环素、放线紫红     

螺旋链霉菌U-1941中PKSII型基因在淡青链霉菌tcmK变异株中的克隆(I)

利用螺旋霉素产生菌螺旋链霉菌(S trep tomy ces sp iramy ceticus U-1941)中发现的PK S II型基因,经测序和同源性比较证明在4174bp片段中含有PK S II型K S(K Sα)基因,该基因(pCG 4-K,aspA)由1229bp组成编码432个氨基酸,与产二素链霉菌A lpA和淡青链霉菌T cmK同源性分别为74.4%和69.7%。将含aspA基因的重组质粒pCG 4在四并菌素(tetracenom yc in C)产生菌(S.g laucescens GLA 4-26)tcmK基因缺陷型变异株中进行克隆,TLC分析表明转化子的发酵产物比对照株多一个明显的黄色斑点,该物质经分离、提纯后分析确定为一个含苯式结构的小分子化合物A S-5。     

螺旋链霉菌U-1941中PKSⅡ型基因在淡青链霉菌tcmK变异株中的克隆(Ⅰ)

利用螺旋霉素产生菌螺旋链霉菌（Streptomyces spiramyceticus U-1941）中发现的PKSⅡ型基因，经测序和同源性比较证明在4174bp片段中含有PKSⅡ型KS（KSα）基因，该基因（pCG4-K，aspA）由1229bp组成编码432个氨基酸，与产二素链霉菌AlpA和淡青链霉菌TcmK同源性分别为74．4％和69．7％。将含aspA基因的重组质粒pCG4在四并菌素（tetracenomycin C）产生菌（S．glaucescens GLA4—26）tcmK基因缺陷型变异株中进行克隆，TLC分析表明转化子的发酵产物比对照株多一个明显的黄色斑点，该物质经分离、提纯后分析确定为一个含苯式结构的小分子化合物AS-5。     

生米卡链霉菌麦迪霉素抗性基因的克隆

应用碱性裂解法提取质粒载体pIJ61和pIJ702,并通过氯化铯—溴化乙锭密度梯度离心纯化,得到了较好的结果。对TK64、TK24、TK23和JI1326四个受体菌作麦迪霉素抗性基因克隆,结果只有TK24对麦迪霉素敏感。 用Bam HI酶切质粒pIJ702,并通过碱性磷酸酶去除磷酸根。生米卡链霉菌的"total"DNA用MboI部分酶切,得到1～8kb大小的DNA片段,1μgBam H1酶切pIJ702DNA和5μgMbo1部分酶切的染色体DNA片段通过T4-DNA连接酶连接,转化变铅青链霉菌TK24原生质体,在R_2YE平板上再生,经过硫链丝菌素和麦迪霉素筛选,得到8个抗性转化子,进一步复证发现pIJ702-5的抗性最强,pIJ702-7的抗性最弱,并且它们在基本培养基上产生的色素也不同。 提取抗性转化子重组质粒,通过再转化实验进一步证实在杂合质粒上确实含有麦迪霉素的抗性基因。将重组质粒转化麦迪霉素产生菌—生米卡链霉菌63的原生质体,经过再生、筛选、得到9个转化子。对转化子进行发酵实验,发现它们的发酵效价与原始菌株相比,有明显的变化。     

委内瑞拉链霉菌中氯霉素生物合成基因的克隆

目的克隆委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)ISP5230中的氯霉素生物合成基因。方法以pabAB基因片段为探针,通过菌落杂交技术从该菌的基因文库中钓取相关基因。结果得到一7.5kbBamHIBamHI DNA片段,突变株的互补实验表明,该7.5kb DNA片段使氯霉素生物合成阻断变株CML-4恢复了氯霉素的生物合成。从野生菌株的染色体上删除该7.5 kb DNA片段中的一段3.5 kbNcoINcoI DNA片段后,野生菌株丧失了氯霉素的生物合成能力。结论该7.5 kb DNA片段含有氯霉素生物合成所需的基因。     

链霉菌聚酮体类抗生素生物合成基因的克隆和分析

前言链霉菌体内遗传研究25年后,对这类丝状菌的天然基因交换机制已逐步有所了解,发现了各种质粒与感染链霉菌的温和噬菌体,各种代谢、发育和抗生素产生的基因也已分离,测定特性并制得突变图谱。这类微生物的分子遗传学时代于1980年随着首次克隆实验开始,以后,其进展相当迅速。分子遗传学正提供与链霉菌生物学的几个方面有关的基因组成和调节的基本信息,包括它们的两个最明显的“特异”性质:菌丝生长和孢子形成间的发育变化和与抗生素产生相关的特性。     

链霉菌启动子的克隆和抗生素的产生

用启动子探针质粒pIJ486作载体,变青链霉菌TK24作受体,克隆来自金霉素链霉菌UK81的启动子,得到了三个转化子。其中转化子变青链霉菌TK24(pTA1)是含高活性外源启动子的重组子。而变青链霉菌TK24(pTA5)和变青链霉菌TK24(pTA7)中的外源启动子活性很低,但变青链霉菌TK24(pTA7)产生了新抗生素。其抗菌谱与供体金霉素链霉菌UK81的不同,当重组质粒,pTA7再转化金霉素链霉菌UK81时,得到的再转化子的抗菌谱仍与金霉素链霉菌UK81相同,但再转化子的抗生素产生被促进。经高压电泳和薄层层析表明,变青链霉菌TK24(pTA7)产生的胞内抗生物质为两种成份。金霉素链霉菌UK81(pTA7)和金霉素链霉菌UK81产生的抗生素成份相同而与变青链霉菌TK24(pTA7)产生的不同。实验得到的三个重组质粒pTA1、pTA5和pTA7上的插入片段大小分别为2.7kb、3.75kb和2.2kb。     

始旋链霉菌HCCB2003-8 snaA、snaB和snaC基因的克隆、序列分析及原核表达

以始旋链霉菌（Streptomyces pristinaespiralis）HCCB2003—8的染色体DNA为模板，通过优化PCR条件扩增出FMN还原酶、PII．合酶的基因片段。与文献报道的基因序列做同源比较，snaA和snaB碱基序列分别只有一个碱基的差异，snaC碱基序列完全匹配。将snaA、snaB和snaC的基因片段插入原核表达载体pET30a中，并转化至大肠埃希菌BL21（DE3）。SDS—PAGE结果表明。经IPTG诱导后基因分别得到表达。     

透明颤菌血红蛋白基因在弗氏链霉菌中的表达及其对菌体生长和泰乐星合成的影响

质粒 p IJ4 0 2 6和 p RK4 0 4 - vhb分别含有红霉素抗性基因启动子 (Perm E)和透明颤菌血红蛋白基因 (vhb) ,先用 PCR分别扩增二者 ,再用 SOE- PCR(Splicing by overlap extension PCR)将不含自身启动子的vhb基因置于 Perm E之下 ;将 SOE- PCR产物克隆到链霉菌整合性载体 p SET15 2上 ,构建成 vhb基因表达载体 p WQ2 0 0 4。通过大肠埃希氏菌 -链霉菌属间接合转移的方式将 p WQ2 0 0 4导入弗氏链霉菌 (Streptomycesfradiae)中 ,利用 p WQ2 0 0 4上 Φ C31整合性位点使 vhb基因整合到弗氏链霉菌染色体上。PCR验证表明 ,vhb基因已整合到染色体上 ,CO结合差光谱分析则表明 vhb基因在弗氏链霉菌中成功表达。摇瓶与上罐发酵显示 vhb基因的表达可明显促进菌体生长与泰乐星的生物合成     

透明颤菌血红蛋白的研究及应用

透明颤菌血红蛋白是来自专性好氧的革兰氏阴性细菌透明颤菌属的一种同源双亚基血红蛋白,其基因的转录受生境中氧浓度的调节。当这种蛋白在多种原核及真核生物中表达时,具有促进生长和提高各种有用代谢产物的作用。证据显示该蛋白的作用机制是进行对氧的传递。