cDNA基因芯片对人胶质瘤组织原发性耐药相关基因的筛查

目的:利用cDNA基因芯片筛查与人脑胶质瘤原发性耐药相关的基因,为获取不同个体胶质瘤化疗药物药敏预报基因提供实验依据.方法:收集符合要求的临床手术切除的人脑胶质瘤组织标本共6例,原代培养肿瘤细胞;由MTT法检测替尼泊苷(teniposide ,VM-26)对胶质瘤细胞生长的抑制率,按VM-26 45 μg/ml(人血药峰浓度)时抑制率>30%为敏感、≤30%为耐药作为标准,将6例组织细胞分为耐药和敏感2组.cDNA芯片检测结合聚类分析方法筛查瘤细胞中与耐药相关的差异表达基因;以半定量RT-PCR法检测瘤细胞中HDAC1基因表达加以验证.结果:根据VM-26对细胞抑制率将6例胶质瘤细胞分为3例VM-26敏感和3例耐药.cDNA芯片结合聚类分析共筛选出有表达差异的基因21个,其中表达上调的基因6个、表达下调的基因15个.将表达差异明显的HDAC1经半定量RT-PCR验证,该基因在6例组织中都有表达,趋势与芯片结果一致.结论:胶质瘤原发性耐药可能与cDNA芯片筛查到的21个基因相关,其确切的耐药机制需要进一步深入研究.     

应用表达谱芯片筛选卵巢癌紫杉醇耐药差异表达基因

目的 应用表达谱芯片研究人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV3/TAX300及SKOV3/TAX30与敏感细胞SKOV3之间的基因表达谱差异,筛选耐药相关基因.方法 分别提取细胞的总RNA并纯化mRNA,mRNA逆转录合成cDNA后,用Cy5和Cy3-dUTP标记,与基因芯片进行杂交反应,扫描芯片荧光信号图像,用基因图像分析软件对扫描图像进行数字化处理和分析.采用荧光定量PCR、RT-PCR验证差异表达基因TNC mRNA和MDR1 mRNA水平,Western blot法验证TNC和MDR1蛋白表达.结果 SKOV3/TAX300细胞与敏感细胞SKOV3筛选出202个差异基因,其中上调基因88个,下调基因114个;SKOV3/TAX30细胞与SKOV3敏感细胞筛选出358个差异基因,其中上调基因144个,下调基因214个.这些基因主要包括细胞外基质、细胞信号传递、细胞周期、细胞凋亡、药物代谢等方面.其中细胞外基质成分TNC在两种耐药细胞中均为明显上调.荧光定量PCR、RT-PCR检测TNC mRNA和MDR1 mRNA水平,Western blot验证TNC和MDR1的表达,结果均与芯片结果一致.结论 本研究筛选出的基因可能为进一步探讨卵巢癌肿瘤细胞耐药机制提供新的途径,细胞外基质成分TNC可能是紫杉醇耐药的相关基因.     

脑胶质瘤细胞化疗耐药中p38MAPK信号通路的作用

探讨p38MAPK信号通路在脑胶质瘤细胞化疗耐药中的作用及相关机制。 方法 在 前期建立U251/TMZ胶质瘤耐药细胞株的基础上,用特异性阻断剂SB203580阻断耐药细胞株中 p38MAPK信号通路,替莫唑胺作用下检测耐药株的细胞活性变化,同时检测MDR1、TopoⅡ、BCL-2 等耐药相关基因的蛋白表达变化。 结果 阻断通路后替莫唑胺作用下细胞的抑制率明显低于未阻 断组,两组之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）,阻断后耐药细胞中BCL-2、MDR1的表达明 显升高,TopoⅡ的表达明显降低,与未阻断的耐药细胞相比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结 论 U251/TMZ胶质瘤耐药细胞中p38MAPK信号通路被阻断后细胞的耐药性增强,其机制可能与耐药 株中耐药相关基因BCL-2、TopoⅡ、MDR1的表达变化有关。     

胃癌耐药细胞株SGC-7901/5-FU的建立及其耐药机制的初步探讨

目的构建耐5-FU的胃癌耐药细胞株,初步探讨细胞发生5-FU耐药的可能机制.方法 通过药物耐药间歇冲击并浓度梯度递增法诱导建立胃癌耐药细胞株SGC-7901/5-FU.应用MTT法检测亲代细胞对4种化疗药物的IC50并计算耐药指数(RI).通过MTT法绘制细胞的生长曲线计算细胞倍增时间.流式细胞仪分析细胞周期分布.RT-PCR检测抑癌基因P53、癌基因Bcl-2、促凋亡基因半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(caspase-3)、死亡相关蛋白激酶(death associated protein kinase,DAPK)家族成员(DAPK-1、DAPK-2、DAPK-3)、多药耐药蛋白(multidrug resistance proteins,MRP)亚家族中的MRP-6、多药耐药基因1(multidrug resistance 1,MDR1)、切除交叉互补修复基因(excision repair cross-complementing 1,ERCC-1)的表达.Western Blot检测MDR1 编码的P糖蛋白(P-gp)的表达水平.结果SGC-7901/5-FU对5-FU、顺铂、环磷酰胺的耐药指数分别为6.26、3.71、5.25.SGC-7901与SGC-7901/5-FU细胞倍增时间分别为(30.82±1.46)h和(46.01±4.15)h,SGC-7901/5-FU细胞增殖速率显著变缓(P＜0.05).与亲代细胞比较,耐药子株S期细胞显著减少,G0/G1期细胞则显著增高(P＜0.01),而G2/M期细胞无显著差异(P＞0.05).耐药子株SGC-7901/5-FU细胞MDR-1、MRP-6、DAPK-3和P-gp表达显著上调(P＜0.01),而ERCC-1、caspase-3、P53、DAPK-1、DAPK-2、Bcl-2的表达均无显著变化(P＞0.05). 结论成功构建胃癌耐5-FU细胞株SGC-7901/5-FU,其对顺铂、环磷酰胺具有交叉耐药,耐药机制与细胞周期S期细胞比例减少、G0/G1期细胞比例升高有关,可能与MDR-1、MRP-6、DAPK-3基因及P-gp蛋白表达上调有关.     

探讨bcl-2下调后对胶质瘤细胞系的增殖、凋亡和侵袭能力的影响

目的 研究下调bcl-2基因表达后对神经胶质瘤细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。方法 利用小分子RNA干扰（Small interfering RNA,siRNA）技术人工合成bcl-2靶向siRNA,转染神经胶质瘤细胞系SHG44和TJ905细胞,特异性沉默神经胶质瘤细胞SHG44和TJ905细胞bcl-2基因表达。通过蛋白质印迹（Western blot）分析、噻唑蓝（MTT）实验、Transwell实验和流式细胞仪（FCM）检测,观察bcl-2 siRNA对转染细胞bcl-2基因抑制效果、增殖能力的变化、侵袭能力的改变和细胞凋亡的影响。结果 bcl-2 siRNA可特异性下调神经胶质瘤细胞系SHG44和TJ905细胞bcl-2基因表达。bcl-2下调的神经胶质瘤细胞增殖能力在不同时间点都受到抑制,侵袭能力也明显下降,但实验中未见细胞明显凋亡。结论 下调bcl-2基因表达可有效抑制神经胶质瘤细胞生长,降低细胞增殖和侵袭能力。     

人肺腺癌多药耐药细胞系A549/cDDP的建立及相关基因表达检测

背景与目的 现有研究表明,肺癌细胞多药耐药造成的化疗失败是影响患者生存率的主要原因.本研究旨在建立人肺癌多药耐药细胞系,研究其耐药特性和机制.方法 应用人肺腺痛细胞株A549,采用顺铂(cDDP)大剂量间歇诱导法,建立多药耐药细胞系A549/cDDP.相差显微镜观察细胞形态和结构差异,绘制两种细胞的体外生长曲线.用MTT法检测该耐药细胞株对多种化疗药物的多药耐药性,采用流式细胞术检测该耐药细胞表面多耐药基因(MDR)的表达产物P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)及谷胱甘肽硫转移系统(GSH/GST)的表达情况,应用RT-PCR检测MDR、MRP基因表达水平.结果 A549/cDDP对多种抗癌药物耐药,各种抗癌药物IC50显著提高:(70.±4.9)%的A549/DDP细胞表面P-gp表达阳性,而对照细胞A549表达仅为(42.4±5.6)%;(29.4±2.9)%的A549/DDP细胞表面MRP表达阳性,而对照细胞A549表达仅为(21.4±3.5)%,二者有差异(t=11.94;t=5.56,P均<0.01);A549/cDDP和A549细胞的GSH/GST表达无明显变化(P>0.05).RT-PCR检测发现A549/cDDP中的MDR mRNA及MRP mRNA高表达.结论 建立的A549/cDDP具有明确的多药耐药性,其多药耐药基因MDR mRNA及MRP mRNA表达升高.     

MDR1基因稳定表达的人肝癌多药耐药细胞株的建立

目的 建立多药耐药基因(MDR1)稳定表达的人肝癌Bel-7402耐药细胞株，为应用RNA干扰技术逆转肿瘤多药耐药基因的表达提供实验模型。方法 应用阿霉素(ADM)长期培养筛选建立Bel-7402耐药细胞株，应用MTT法、流式细胞仪(FCM)及逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)对该细胞株相关特性(耐药范围、致死剂量、p-糖蛋白功能及其表达阳性率、MDR1基因检测)进行比较研究。结果 经MTT法检测，耐药细胞株耐药性明显增高，FCM检查发现从敏感细胞到耐药细胞，其阿霉素潴留功能由77．7％降至25．1％，P-糖蛋白(P—gp)阳性率由1．4％升高至54．0％，RT-PCR检查显示该细胞中MDR1 mRNA呈高表达。结论 成功建立了稳定表达MDR1基因的人肝癌Bel-7402耐药细胞株，该细胞中P—gp呈高表达，稳定性好。     

紫杉醇诱导的卵巢癌耐药细胞株的生物学特性及其保存

目的 研究紫杉醇诱导的卵巢癌耐药细胞株的生物学特性,探索耐药细胞的长期保存条件,以建立稳定的体外实验模型。方法 选用卵巢癌化疗敏感细胞株SKOV3,分别采用大剂量冲击和小剂量浓度递增诱导建立耐药的卵巢癌细胞株SKOV3/TAX300、SKOV3/TAX30。四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测耐药细胞对化疗药物紫杉醇的IC50;比较耐药细胞和敏感细胞的细胞平板克隆形成、生长曲线倍增时间的差异;荧光定量PCR检测敏感细胞和耐药细胞中耐药相关基因的表达;比较无药冻存和加药冻存的方式对耐药细胞的保存效果。结果 耐药细胞SKOV3/TAX300,耐药指数为4.60,耐药细胞SKOV3/TAX30,耐药指数为51.31;与敏感细胞相比,耐药细胞体积增大,形态不规则,倍增时间延长。多药耐药基因1（MDR1）在两种耐药细胞中高表达,肺耐药相关蛋白（LRP）、蛋白激酶Cα（PRKCA）基因仅在SKOV3/TAX300中的表达增高,BCL-2样1基因（BCL2L1）在SKOV3/TAX30中低表达。耐药细胞冻存在含有药物的条件下,有利于耐药性的保持。结论 大剂量冲击和小剂量浓度递增两种方法诱导的耐药细胞为研究紫杉醇耐药机制建立了良好的体外模型,两种耐药细胞SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30具有不同的生物学特性。     

一条新的人肺腺癌耐药相关基因全长cDNA片段的克隆及序列分析

背景与目的：肺癌细胞的多药耐药（multi-drug resistance,MDR)是药物治疗失败的重要原因,但其机制尚未完全清楚。我们已经通过SSH发现了1条新的耐药相关基因片段,经检索GenBank,发现其与2001年4月公布的一条新的基因序列BC006151同源性高达99%。本研究旨在克隆该基因的全长,并检验该基因在几种肺癌细胞株中的表达,为进一步研究功能和调控奠定基础。方法：根据BC006151基因序列设计引物,通过RT-PCR证实肺腺癌MDR细胞SPC-A-1/CDDP确实包含BC006151基因后,扩增该基因全长cDNA,通过测序对所得序列进行分析,并对其编码蛋白的氨基酸序列进行预测。应用半定量RT-PCR方法检验小细胞肺癌SH77、大细胞肺癌H460、肺腺癌SPC-A-1和SPC-A-1/CDDP等细胞株中该基因mRNA的表达。结果：成功克隆了BC006151基因的全长CDNA片段,长1298bp,它具有完整的阅读框和编码区,并与经SSH获得的片段有极高的同源性。该基因在MDR细胞株SPC-A-1/CDDP的表达明显高于其亲代细胞株;SPC-A-1表达高于H460,SH77未见表达。结论：BC006151基因是与cDDP致肺腺癌MDR密切相关的一条新基因。该基因全长CDNA片段的克隆将有助于阐明其在肺癌MDR发生中的作用。     

人骨肉瘤耐药细胞系MG-63/PTX的建立及多药耐药机制研究

目的 建立人骨肉瘤细胞多药耐药亚系,探讨骨肉瘤细胞多药耐药的发生机制.方法 采用紫杉醇大剂量间断冲击培养法,诱导建立紫杉醇耐药骨肉瘤细胞系(MG-63/PTX),并运用MTT法检测6种药物敏感性变化及细胞生长规律变化,流式细胞仪分析亲本细胞系和耐药细胞系的细胞膜表面P-gp蛋白表达率、罗丹明123排出情况,RT-PCR检测细胞内耐药基因的变化,免疫细胞化学法检测细胞内P-gp蛋白的表达,Westernblotting法检测细胞内P-gp蛋白的表达.结果 历时12个月建成人骨肉瘤耐药细胞系MG-63/PTX,能在含PTX1μg/mL的培养基中稳定生长并传代,其对PTX的耐药指数为69.8,并与卡铂、顺铂、表柔比星、甲氨蝶呤、阿霉素等多种化疗药物存在不同程度的交叉耐药性;罗丹明123排出实验显示MG-63/PTX内罗丹明含量明显低于亲本细胞;RT-PCR结果显示在MG-63/PTX细胞系中存在MDR1、MRP1、LRP、ABCG2基因的表达,而在MG-63细胞系中无MDR1基因的表达.免疫细胞化学、流式细胞仪及Western blotting实验均显示在MG-63/PTX中存在P-gp的表达.结论 MDR1/ P-gp在多药耐药的特性上起着至关重要的作用,而且骨肉瘤多药耐药细胞亚系为进一步研究骨肉瘤耐药特征及逆转方法打下基础.     

Pharmacogénétique des fluoropyrimidines. La méthylènetétrahydrofolate réductase

Résumé: Lefficacité optimale des fluoropyrimidines nécessite des concentrations élevées en 5-10 méthylènetétrahydrofolate (CH₂FH₄), contrôlées par la méthylènetétrahydrofolate réductase (MTHFR) qui convertit irréversiblement le CH₂FH₄ en 5-méthyltétrahydrofolate (CH₃FH₄). Les polymorphismes 677CT et 1298AC du gène MTHFR sont associés à une baisse dactivité de lenzyme. Les tumeurs «MTHFR mutées» devraient donc être plus sensibles aux fluoropyrimidines que les tumeurs «MTHFR sauvages». Les études expérimentales et cliniques publiées à ce jour tendent à montrer une plus grande sensibilité au 5-FU (associé ou non à lacide folinique) dans les tumeurs MTHFR mutées par rapport aux tumeurs sauvages. Ces résultats montrent la nécessité de poursuivre ces recherches afin de confirmer limpact de ces polymorphismes sur lefficacité des fluoropyrimidines.     

Oncogénétique et psycho-oncologie, une collaboration recommandée...

Résumé: La possibilité depuis 1994, de connaître la probabilité individuelle de développer certains cancers a permis de proposer de nouvelles modalités de prévention, de traitements et contribué au développement actuel de loncogénétique. Une meilleure connaissance des répercussions psychologiques tant pour les patients que pour les apparentés est désormais possible et limplication des psycho-oncologues dans ce cadre de la réalisation des tests prédictifs, recommandée. La mission de «messager» qui incombe au «cas-index» doit faire lobjet dune attention particulière. La complexité de linformation et la dimension paradoxale que peut avoir parfois la communication à propos des choix, rend difficile lévaluation de la qualité du consentement. La situation particulièrement délicate dune aide à la décision à légard de la chirurgie prophylactique, exige une collaboration étroite des généticiens et des psycho-oncologues.Les soins de support en oncologie     

The role of papillomaviruses in human cancers

This review comprehensively evaluates the influence of gene-gene, gene-environment and multiple interactions on the risk of colorectal cancer (CRC). Methods of studying these interactions and their limitations have been discussed herein. There is a need to develop biomarkers of exposure and of risk that are sensitive, specific, present in the pathway of the disease, and that have been clinically tested for routine use. The influence of inherited variation (polymorphism) in several genes has been discussed in this review; however, due to study limitations and confounders, it is difficult to conclude which ones are associated with the highest risk (either individually or in combination with environmental factors) to CRC. The majority of the sporadic cancer is believed to be due to modification of mutation risk by other genetic and/or environmental factors. Micronutrient deficiency may explain the association between low consumption of fruit/vegetables and CRC in human studies. Mitochondrial modulation by dietary factors influences the balance between cell renewal and death critical in colon mucosal homeostasis. Both genetic and epigenetic interactions are intricately dependent on each other, and collectively influence the process of colorectal tumorigenesis. The genetic and environmental interactions present a good prospect and a challenge for prevention strategies for CRC because they support the view that this highly prevalent cancer is preventable.     

Antifungal combination therapy in localized candidosis

A mouse model of localized candidosis in air-filled subcutaneous cysts imitating thrush has been developed. We have now tested various antifungal combinations in this animal model. Flucytosine (5-FC) + amphotericin B (Amph B) showed the highest efficacy, a clear additive or even synergistic effect was seen. The combination of 5-FC + imidazole or triazole derivative was less efficacious, an additive effect was rare. The combination of 5-FC + Amph B was also tested against Candida albicans strains showing various degrees of 5-FC-resistance. A significant reduction in 5-FC-resistant mutants was seen after the treatment with the combination.     

PSA-Test zur Früherkennung des Prostatakarzinoms

Zusammenfassung Prostatakrebs ist hierzulande seit einigen Jahren die häufigste Krebserkrankung bei Männern. Da über die Ätiologie wenig gesichertes Wissen vorliegt und daher kaum Möglichkeiten zur primären Prävention bestehen, konzentrieren sich die Anstrengungen auf die Suche nach wirksamen Verfahren zur sekundären Prävention. Hierbei gilt die Verwendung des PSA-Tests zur Früherkennung des Prostatakarzinoms als derzeit aussichtsreichstes Verfahren. Bevor ein neues Früherkennungsverfahren zur breiten Anwendung empfohlen oder in das gesetzliche Früherkennungsprogramm aufgenommen wird, muss jedoch seine Wirksamkeit in hierfür geeigneten wissenschaftlichen Untersuchungen nachgewiesen werden. Bis jetzt gibt es bereits eine ganze Reihe epidemiologischer Studien zur Effektivität des PSA-Screenings, doch konnte ein Wirksamkeitsnachweis bisher nicht erbracht werden. Zwei große randomisierte Studien in Europa und den USA lassen für die Jahre 2005–08 erste Ergebnisse erwarten. Da epidemiologische Arbeiten belegen, dass durch PSA-Screening eine nicht unerhebliche Überdiagnostik und Übertherapie eintritt, d. h. Schaden angerichtet werden kann, ist das Ergebnis der genannten randomisierten Studien vor weitergehenden Entscheidungen unbedingt abzuwarten. Bis dahin sollte von der Anwendung des PSA-Tests zur Prostatakrebsfrüherkennung unmissverständlich abgeraten werden. Da für den Test bereits ausgiebig Werbung betrieben wurde, kommt einer gründlichen ärztlichen Aufklärung von an dem Test interessierten Personen eine Schlüsselrolle zu.     

Les génériques en cancérologie: à molécule identique, médicaments identiques? Les biosimilaires, des super-génériques?

Résumé: Les biosimilaires vont bientôt voir leur apparition en Europe. Comment un laboratoire peut-il aborder le développement de son dossier dAMM? Quelles sont les bases légales et les recommandations officielles? Comment la similarité et/ou le caractère générique peuvent-ils être démontrés? Les règles sont-elles identiques à celles des produits chimiques conventionnels pour lesquels, notamment en cancérologie, il existe des médicaments génériques? Comment faire pour que la sécurité et lefficacité des médicaments biosimilaires soient assurées pour les patients?     

Cancer immunotherapy

Unprecedented progress has seen made in the last decade in the field of cancer immunotherapy. The recent approval of nivolumab （Opdivo）, the first anti-programmed cell death-1 （PD-1） antibody, for metastatic melanoma in Japan, marked a milestone in the rapidly advancing field of cancer immunotherapy. Nivolumab together with ipilimumab （Yervoy）, the anti-cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 （CTLA-4） antibody, are the first 2 drugs in the class of ＂immune checkpoint inhibitors＂ that have delivered impressive responses in patients with metastatic melanoma and renal cell cancer （RCC） as well as a variety of solid tumors.     

异基因造血干细胞移植后患者肝损害病因与临床特征分析

 【摘要】　目的　总结异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后患者肝损害的发生率、发生原因、诊断方法与治疗选择。方法　回顾性分析郑州大学附属肿瘤医院2006～2010年接受allo-HSCT的83例良、恶性血液病患者中Ⅱ～Ⅳ级肝损害的发生率、各种病因的构成比、临床表现以及诊断方法,分析移植后不同时期肝损害病因的差异、治疗方法、疗效。结果　83例allo-HSCT患者中,发生Ⅱ～Ⅳ级肝损害45例（54.2 %）。按肝损害致病病因分类,预处理化疗所致7例,环孢素所致9例,肝静脉闭塞病（HVOD）所致2例,肝脏移植物抗宿主病（GVHD）所致24例,乙型肝炎病毒再激活所致2例,多器官衰竭所致1例。发生于移植后1个月内者20例（44.4 %）,以药物性肝损害为主,1个月～100 d者13例（28.9 %）,101 d～1年者12例（26.7 %）,均以肝脏GVHD为主。经减停肝损害药物、抗排异、保肝等治疗后,27例治愈,10例好转,2例未愈,6例死于原发病复发或移植相关并发症。结论　肝损害是allo-HSCT后常见的并发症,药物及肝脏GVHD是其最主要的致病原因,肝损害与其发生时间的相关性可作为肝损害病因学诊断的参考依据。根据肝损害的病因选择针对性的治疗方法,可取得较好的疗效。     

Pharmacokinetics and dosage of fluconazole in continuous hemofiltration (CAVH, CVVH) and hemodialysis (CAVHD, CVVHD)

Continuous haemofiltration (CAVH, CVVH) and haemodialysis (CAVHD, CVVHD) are increasingly used in patients with acute renal failure (ARF). The elimination rates of fluconazole vary considerably among the different procedures. In CVVHD, the elimination rate is, depending on the combined dialysate/ultrafiltrate flow rate, the most marked compared to CVVH and intermittent dialysis with a fluconazole clearance exceeding the values of healthy persons in CVVHD 2 L/h. To achieve therapeutic plasma levels during continuous renal replacement therapy, the same loading dose as in patients without renal failure should be applied, followed by the adjusted maintenance dose for anuric patients multiplied by a factor taking the extracorporeal elimination of the absorbed dose into account (CAVH, CVVH: x 2.2, ultrafiltrate flow 0.5 L/h; CAVHD, CVVHD: x 3.8, combined dialysate/ultrafiltrate flow 1.5 L/h). Despite the broad therapeutic margin of fluconazole, drug monitoring is recommended with respect to the very limited number of investigations with relatively low dosages up to 200 mg/day and--which is of paramount importance--to achieve therapeutic drug levels in vital indications.