腺相关病毒及其在肿瘤基因治疗中的研究进展

重组腺相关病毒是一种用于基因治疗的安全而有效的病毒载体,近年来在其基础及应用方面的研究均取得了较大的进展,已成为肿瘤治疗领域中很有希望的方法,目前已用于抗肿瘤免疫基因治疗、抗肿瘤血管新生治疗、分子化疗等方面.腺相关病毒自身具有抗肿瘤活性,重组AAV作为基因治疗载体联合放疗、化疗可起到协同的抑制肿瘤作用相比,重组腺病毒载体在肿瘤基因治疗中有着很大的优势.     

腺病毒及腺相关病毒介导的自杀基因疗法对肿瘤的杀伤作用

用病毒治疗肿瘤是一种日益引起人们重视的肿瘤治疗手段 [1 ] 。早在 2 0世纪5 0年代 ,人们就开始利用腺病毒 (aden-ovirus,Ad)的细胞毒性进行治疗宫颈癌的试验。自杀基因疗法的原理是将“自杀”基因转移入宿主细胞的基因组中 ,这种基因编码的酶能使非活性的前药转化为细胞毒性的代谢物 ,诱导靶细胞产生“自杀”效应 ,从而达到清除肿瘤细胞的目的。Ad及 AAV介导的基因转移系统因其独特的生物学特性得到广泛的应用。1　腺病毒及腺相关病毒腺病毒基因组为线性双链 DNA ,长36 kb,10 0 m u(m apunit)。Ad基因组由非结构性早期基因 (E1 ～ E4…     

线粒体基因表达的影响因素及其在肿瘤细胞中的表达

线粒体是细胞的能量工厂,而线粒体基因表达受多种内外因素的影响,包括核基因的表达、激素、缺氧、氧化应激、辐射、ATP浓度及一些化学因素等。在肿瘤细胞中,线粒体基因表达总体上是上调的,这可能是线粒体对肿瘤细胞高能量需求的一种代偿,亦可能是通过抑制细胞凋亡使肿瘤细胞过度增殖。     

重组腺相关病毒介导人内皮抑素抑瘤作用的实验研究

背景与目的：研究表明,内皮抑素能抑制肿瘤血管的生成,进而抑制肿瘤的生长和转移,然而有关内皮抑素治疗的研究报道却很少。本研究初步探讨了重组腺相关病毒介导内皮抑素对肿瘤生长和转移的作用。方法：用RT-PCR方法获得人内皮抑素基因,构建内皮抑素可分泌表达的通用型重组腺相关病毒（rAAV）载体,包装获得重组腺相关病毒rAAV-SS-Endostain。以动物实验分析其抗肿瘤作用。结果：C57BL/6小鼠肌肉注射10^11TUrAAC-SS-Endostatin一次,该重组病毒对小鼠黑色瘤B16F10移植瘤生长的抑制率为57.1％,在实验肺转移模型中,对转移灶的抑制率为70.7％。结论：重组腺相关病毒介导的内皮抑素能有效抑制肿瘤的生长和转移。     

EB病毒潜伏膜蛋白2重组腺腺病毒的构建及其免疫效果的研究

为了进一步研究以EB病毒潜伏膜蛋白2穴LMP2)为靶抗原制备EB病毒相关肿瘤的治疗性疫苗,利用AdEasy系统构建了EBV鄄LMP2的重组腺病毒。PCR鉴定结果证实病毒DNA中含有目的基因的特异性片段;RT鄄PCR证明了外源基因在真核细胞中得以转录;免疫酶和Westernblot的结果也显示LMP2蛋白在真核细胞得到表达。将扩增后的病毒感染Hela细胞测定病毒滴度为1.5×109pfu/ml。将重组病毒以灌胃、肌肉注射和滴鼻的方式感染小鼠,经免疫荧光检测其特异性抗体,LDH法检测特异性CTL的杀伤作用,结果发现三种给药途径均可诱发小鼠针对LMP2的特异性体液免疫和细胞免疫,而用Ad5作为对照组的小鼠则没有引起相应的免疫反应。该研究将有益于进一步探索抗肿瘤特异性主动免疫作用在阻止肿瘤的生长、扩散或复发中的作用。对诱导机体产生特异性抗瘤活性有重要意义。     

腺相关病毒载体及其介导的自杀基因疗法

自杀基因疗法是肿瘤治疗的方法之一。腺相关病毒（AAV）载体介导的自杀基因疗法尤其备受关注。通过对AAV载体的选择改建，调控外源基因的有效表达，提高基因转染的效率，充分发挥自杀基因的杀伤作用及旁观者效应来达到治疗肿瘤的目的。本文就AAV载体及其介导的自杀基因疗法方面的进展作一综述。     

腺相关病毒载体及其介导的自杀基因疗法

自杀基因疗法是肿瘤治疗的方法之一.腺相关病毒(AAV)载体介导的自杀基因疗法尤其备受关注.通过对AAV栽体的选择改建,调控外源基因的有效表达,提高基因转染的效率,充分发挥自杀基因的杀伤作用及旁观者效应来达到治疗肿瘤的目的.本文就AAV栽体及其介导的自杀基因疗法方面的进展作一综述.     

不同血清型腺相关病毒载体组织表达差异的研究进展

重组腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）具有弱免疫源性、可介导治疗基因长期稳定表达等优势,使其被公认为基因治疗的理想载体之一。目前临床研究广泛采用的AAV-2血清型载体对部分靶器官和组织的转导效率不十分理想,同时AAV-2中和抗体会干扰此型载体介导的基因转移效率。为了克服上述不足,众多学者将开展了针对其他7种天然血清型AAV（AAV-1,AAV-3至AAV-8）的研究。研究表明这些新型载体的组织亲嗜性和针对同一靶器官的转导效率与AAV-2不同,并且规避了AAV-2免疫应答对载体介导基因转移效率的影响。在视网膜中AAV-1、AAV-5的表达检出较早,表达水平高于AAV-2;AAV-5在胰腺的表达水平也明显高于AAV-2;AAV-4,AAV-5在中枢神经系统的转导效率和表达水平均显著高于AAV-2,并且表达不仅局限于注射部位;AAV-1,3,4,5,7型载体在肌肉的表达水平均超过AAV-2,其中又以AAV-1最为显著;肺组织中AAV-1,5,6型的表达较高,其中AAV-5表达量又高于AAV-1和AAV-6;而肝脏表达水平由高到低的先后顺序为AAV-1〉AAV-5〉AAV-3〉AAV-2。这些研究均提示了新型AAV载体在基因治疗研究和应用领域的巨大潜力。     

携带DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒包装质粒pSANV2.0的构建

[目的]构建携带DREAM基因小分子干扰RNA（siRNA）的腺相关病毒载体包装质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,为进一步研究DREAM基因在癌痛基因治疗中的作用奠定基础。[方法]设计并合成包含DREAM短发夹序列（shRNA）两条互补的寡核苷酸链,退火后插入到经过EcoRⅠ和SalⅠ双酶切的pDC316-EGFP-U6质粒的EcoRⅠ和SalⅠ位点,得到重组质粒pDC316-EGFP-DREAMshRNA-U6,然后以其为模板,通过PCR扩增DREAMshRNA-EGFP片段,并引入EcoRⅠ和SalⅠ位点,PCR产物与pSANV2.0经EcoRⅠ和SalⅠ酶切后连接得到重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,转化入感受态大肠杆菌DH-5α,获得阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定。[结果]PCR、酶切鉴定以及测序结果证实,插入的片段序列和位点完全正确,重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP的构建成功。[结论]成功构建携带DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒包装质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP。     

Ⅱ型腺相关病毒对人类单核细胞来源的树突状细胞转染的研究

DC是诱导初始型T细胞免疫作用的有效抗原提呈细胞。在现代免疫疗法中,用病毒或非病毒为载体冲击DC,这种DC的基因修饰可表达抗原和免疫调节分子,临床用法可诱导特异性免疫应答,以治疗恶性肿瘤感染,免疫抑制等疾病。RAAV具有以下特点:(1)rAAV可转染分裂的未分裂的细胞,即可在激活阶段,也可在成熟阶段进行DC的转染;(2)rAAV缺乏病毒编码序列,即rAAV转染的DC不能合成任何病毒蛋白;(3)rAAV还具有维持转基因表达的能力,转基因表达可维持转染细胞的存活力,因此,实验中应用rAAV     

肿瘤特异单链抗体库的构建及肿瘤血管特异性结合抗体的体内筛选

目的:研究化疗药物依托泊苷对腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内表达水平的影响。方法:携带外源基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的复制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-EGFP(MOI为1或10)单独或联合终质量浓度为0.2、2、20、40、80、100和200μg/ml的依托泊苷感染体外培养的肿瘤细胞NCI-H446(人非小细胞肺癌细胞株)、A549(人肺腺癌细胞株)、SMMC-7721(人肝癌细胞株)、SGC7901(人胃癌细胞株)、SKBR-3(人乳腺癌细胞株)和BTT(小鼠膀胱移行上皮癌细胞株)后不同时间,流式细胞仪分析肿瘤细胞EGFP阳性率和平均荧光强度,Western blotting检测EGFP蛋白表达,RT-PCR和实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞内EGFP的mRNA表达量和DNA拷贝数。结果:不同剂量的依托泊苷可不同程度地提高Ad5-CMV-EGFP在7种肿瘤细胞内的表达水平,但对EGFP阳性率无明显提高。10MOI的Ad5-CMV-EGFP联合40μg/ml依托泊苷分别感染肿瘤细胞NCI-H446、NCI-H460、A549、SMMC-7721、SGC7901、SKBR-3和BTT24h后,细胞内EGFP的荧光强度分别是单独感染的3.3、3.5、3.1、6.2、7.0、5.4和3.4倍。Ad5-CMV-EGFP联合应用依托泊苷后肿瘤细胞内EGFP蛋白表达增加2~5倍,EGFP mRNA表达量提高,但DNA拷贝数未见明显改变。结论:依托泊苷可提高腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内的表达水平,该作用可能是在转录水平上发挥作用的。     

Transduction of ovarian cancer cells: a recombinant adeno-associated viral vector compared to an adenoviral vector.

Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors have emerged as vehicles for gene therapy. In addition, anti-neoplastic properties have been attributed to wild-type AAV. To take advantage of both features and to overcome technical problems associated with rAAV preparation, we developed a production method in which rAAV particles are amplified in an infectious cycle in the presence of wtAAV. This results in a 10(3)-10(4)-fold amplification of rAAV input particles. rAAV-GFP particles generated by this method were used to transduce ovarian cancer cell lines to evaluate their potential in ovarian cancer gene therapy, in comparison to a rAd-GFP vector. The transduction efficiency of NIH-OVCAR3, MDAH 2774 and SKOV3 cells with rAAV-GFP particles was low (< 1%) and did not improve by increasing the number of particles/cell. Repeated administration and continued exposure of NIH-OVCAR3 and MDAH 2774 improved transduction to over 3%. In contrast, these cell lines were more efficiently transduced by rAAV-GFP in the presence of adenovirus (approximately 15%) and by rAd-GFP (> 50%). These results indicate that in contrast to rAd vectors, rAAV particles are not suitable for therapeutic gene transfer in ovarian cancer cells unless efficient help can be provided to mediate ss to ds DNA conversion.     

Dissecting the roles of E1A and E1B in adenoviral replication and RCAd-enhanced RDAd transduction efficacy on tumor cells

Oncolytic viruses have recently received widespread attention for their potential in innovative cancer therapy. Many telomerase promoter-regulated oncolytic adenoviral vectors retain E1A and E1B. However, the functions of E1A and E1B proteins in the oncolytic role of replication-competent adenovirus (RCAd) and RCAd enhanced transduction of replication defective adenoviruses (RDAd) have not been addressed well. In this study, we constructed viruses expressing E1A alone, E1A plus E1B-19 kDa, and E1A plus E1B-19 kDa/55 kDa. We then tested their roles in oncolysis and replication of RCAd as well as their roles in RCAd enhanced transfection rate and transgene expression of RDAd in various cancer cells in vitro and in xenografted human NCI-H460 tumors in nude mice. We demonstrated that RCAds expressing E1A alone and plus E1B-19 kDa exhibited an obvious ability in replication and oncolytic effects as well as enhanced RDAd replication and transgene expression, with the former showed more effective oncolysis, while the latter exhibited superior viral replication and transgene promotion activity. However, RCAd expressing both E1A and E1B-19 kDa/55 kDa was clearly worst in all these abilities. The effects of E1A and E1B observed through using RCAd were further validated by using plasmids expressing E1A alone, E1A plus E1B-19 kDa, and E1A plus E1B-19 kDa/55 kDa proteins. Our study provided evidence that E1A was essential for inducing replication and oncolytic effects of RCAd as well as RCAd enhanced RDAd transduction, and expression of E1B-19 kDa other than E1B-55 kDa could promote these effects. E1B-55 kDa is not necessary for the oncolytic effects of adenoviruses and somehow inhibits RCAd-mediated RDAd replication and transgene expression.     

Gene expression patterns through oral squamous cell carcinoma development: PD-L1 expression in primary tumor and circulating tumor cells

Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most common tumor of the oral cavity and has been associated with poor prognosis. Scarce prognostic markers are available for guiding treatment and/or sub-classifying patients. This study aims to identify biomarkers by searching for genes whose expression is increased or decreased during tumor progression (through T1 to T4 stages). Thirty-six samples from all tumor size stages (from T1 to T4) were analyzed using cDNA microarrays. Selected targets were analyzed by immunohistochemistry and in circulating tumor cells by immunofluorescence and Nanostring. Correlation was shown between PD-L1 and tumor size and lymph node metastasis, HOXB9 and tumor size, BLNK and perineural invasion, and between ZNF813 and perineural invasion. PD-L1 positivity was an independent prognostic factor in this cohort (p = 0.044, HH = 0.426). In CTCs from patients with locally advanced OSCC, we found a strong cytoplasmatic expression of PD-L1. PD-L1 is a ligand of PD-1 and is believed to limit T cell activity in inflammatory responses and limit autoimmune diseases. We demonstrated an important role for PD-L1 in primary tumors according to tumor size, and in disease specific survival. Therefore, we could further determine individuals with PD-L1+ CTCs, and possibly follow treatment using CTCs.     

基因芯片筛选胃癌及肿瘤球细胞差异表达基因

目的：利用基因芯片技术筛选人胃癌细胞HGC-27及其肿瘤球细胞的差异表达基因。方法：无菌条件下体外培养人胃癌细胞HGC-27及其肿瘤球细胞,Trizol试剂提取两种细胞的总RNA并纯化,按Gene-Chip IVT Express Kit说明对总RNA进行杂交,所得荧光信号用Cluster和TreeView软件进行分析和显示。结果：按差异显著性标准（差异为2倍）,以人胃癌细胞为对照,在肿瘤球细胞中有610个基因表达上调,1135个基因表达下调,涉及细胞生长、信号传导、肿瘤形成等多个方面。结论：人胃癌细胞HGC-27与其肿瘤球细胞存在基因表达的差异,肿瘤球细胞与肿瘤的形成相关。     

直肠癌循环肿瘤细胞与原发肿瘤组织基因表达谱的差异分析

目的:通过直肠癌循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)与原发肿瘤组织基因表达谱的差异分析,筛选直肠癌CTC的特异性基因.方法:选取2015年9月至2015年12月福建省肿瘤医院收治的直肠癌患者4例,取肿瘤组织和相应的癌旁组织并采集外周血20 ml.应用流式细胞术检测血液CTC,抽提癌组织和CTC的总RNA,采用人全转录组表达谱芯片检测CTC及相应肿瘤组织mRNA表达谱,经聚类分析筛选CTC特异性基因,并采用生物分子注释系统MAS软件对其进行基因功能及其相关的信号通路分析.结果:4例直肠癌患者检测到CTC数目分别是67、78、53和120个.筛选出肿瘤与癌旁组织差异基因共7 755个、CTC与白细胞差异基因共567个,肿瘤组织及CTC差异基因交集后共同上调或下调的特异性基因共36个,其中上调16个、下调20个(P＜0.05或P＜0.01).CTC特异性基因与肿瘤转移和干细胞功能有关,涉及与细胞转移、干细胞功能和免疫功能相关的22条信号通路.结论:CTC与原发肿瘤基因相比,具有独特的表达谱,是肿瘤复发和转移的重要基础.     

肿瘤细胞CAR表达水平与5型腺病毒转导效率的关系

目的: 通过体外、体内实验探讨肿瘤细胞柯萨奇腺病毒受体(coxsackie adenovirus receptor, CAR)表达水平与腺病毒转导效率的关系,为腺病毒相关的生物制剂在临床个体化应用提供实验依据.方法: 将载有绿色荧光蛋白的Ad5 型腺病毒(Ad-GFP) 以100 MOI、200 MOI分别感染人食管癌细胞系KYSE510、KYSE150、EC9706、人宫颈癌细胞系HeLa、人卵巢癌细胞系SKOV3、人肝癌细胞系HepG2和人肺癌细胞系A549,感染后48 h通过流式细胞术检测Ad-GFP对不同细胞系的转导效率.采用Western blotting方法检测这些细胞中CAR的表达水平.将HeLa、A549、SKOV3、EC9706细胞分别接种于裸鼠腋下,接种细胞数分别为3×106、3×106、3×106、2×106,建立裸鼠移植瘤模型.待肿瘤长径达5～7 mm时,在裸鼠移植瘤内注射Ad-GFP,每次1×109PFU,间隔48 h注射第2次.第2次注射后48 h处死裸鼠,剖取瘤组织,荧光显微镜观察冰冻切片中GFP的表达情况以判定腺病毒在瘤体内的转导效率,同时用免疫组化法检测瘤组织内的CAR表达水平.结果: 200 MOI Ad-GFP感染A549、HeLa、HepG2、KYSE150细胞48 h后分别有92.67%、89.31%、84.98%、74.59%的细胞表达GFP;而SKOV3、KYSE510、EC9706细胞中腺病毒的转导效率明显降低,GFP阳性率分别为30.06%、27.40%、18.93%;各种细胞的CAR蛋白表达水平与腺病毒的转导效率呈正相关.注射Ad-GFP的裸鼠移植瘤组织中可见HeLa、A549瘤组织内有明显的点状绿色荧光,而SKOV3、EC9706瘤组织内表达GFP的细胞数明显少于前两种瘤组织;HeLa、A549裸鼠移植瘤组织内大多数瘤细胞高表达CAR ( ),SKOV3、EC9706移植瘤组织内CAR表达水平较低( 或-),表明瘤体内CAR表达水平与Ad-GFP的转导效率也呈正相关.结论: 体内外实验均显示肿瘤细胞的CAR表达水平与5型腺病毒转导效率密切相关.肿瘤患者治疗前检测组织中CAR表达水平有助于规范腺病毒载体的基因治疗药物的个体化使用.     

白介素12重组腺病毒载体的构建及其抗肿瘤作用初步观察

[目的]构建携带小鼠白细胞介素12腺病毒载体(AdCMVmIL-12),并观察其对H22肿瘤的抑瘤效果。[方法]构建重组质粒pdlE1SP1BmIL-12,并用该质粒与质粒pJM17共转染293细胞后包装而成AdCMVmIL-12,并进行酶切法鉴定。同时制备肿瘤动物,通过肿瘤内局部注射AdCMVmIL-12,观察其抗肿瘤作用。[结果]酶切鉴定显示构建正确,其病毒滴度为1.3×109pfu/ml;当病毒滴度为100MOI时,mIL-12浓度达到3417ng/1×106细胞/24h。动物实验表明,注射AdCMVmIL-12的小鼠,肿瘤体积明显小于对照组(P<0.01),生存期显著延长。[结论]构建AdCMVmIL-12成功,肿瘤内局部注射可发挥抗肿瘤作用。