SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测宫颈癌血清中miR-21的表达

摘要：目的：建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测宫颈疾病患者血清中miR-21的表达水平,探讨miR-21在宫颈癌临床监测中的意义。 方法：设计miR-21、U6茎环逆转录引物和PCR扩增引物,以U6为内参,用实时荧光定量PCR检测32例不同宫颈疾病患者血清中miR-21表达水平。 结果：建立的实时荧光定量PCR法能特异地检测血清中的miR-21扩增信号,熔解曲线单一,产物特异。宫颈癌患者血清中miR-21水平明显高于子宫肌瘤、宫颈炎等其他良性宫颈疾病（P<0.05）,而宫颈癌患者手术切除后血清中miR-21水平明显下降（P<0.05）。 结论：SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR是一种快速简便、敏感性高、特异性好的检测方法,对宫颈癌早期诊断、分子分期和预后判断有很好的应用前景。     

poly(A)加尾的实时荧光定量PCR检测血清miR-124a表达及临床初步应用

目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测血清微小RNA(miR)-124a,并作临床初步应用。方法用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-124aploy(A)聚合酶加尾逆转录获得cDNA,进行SYBR Green I实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线,定量血清中miR-124a的表达水平。结果该方法能定量检测血清miR-124a表达水平,熔解曲线呈单峰,PCR扩增产物特异,在103~106 copies/uL范围内有良好的线性关系(r2=0.999),并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-124a表达水平明显高于健康体检者(P0.05)。结论所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR Green I实时荧光定量PCR方法能敏感、特异地检测血清中miR-124a的表达水平,为下一步临床应用的研究奠定了方法学基础。     

茎环引物的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测miR-155表达及其临床初步应用

目的建立茎环状逆转录引物（简称茎环引物）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）,并作初步应用。方法应用SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR检测CD4＋T细胞株的miR-155,初步验证方法的可行性。用所建立的方法对60份临床宫颈刮取物标本进行检测,分析miR-155与宫颈癌及感染的高危型人类乳头状瘤病毒（HPV）基因型别的关系,其聚合酶链反应（PCR）反应产物通过电泳验证产物特异性。结果所建方法能特异的检测到miR-155的扩增信号,最低检出限为10^-7nmol/L,在10^-1-10^-6nmol/L之间有良好的线性关系,相关系数（r）为0.99,扩增后惟一的熔解曲线特异峰显示很好的特异性。CD4^＋T细胞株及60例临床宫颈刮取物标本miR-155均显示阳性,PCR反应产物电泳可获得单一条带。宫颈刮取物miR-155与宫颈癌有关（P〈0.05）,但与本研究涉及的HPV基因型别无关（P〉0.05）。结论所建立的茎环引物的SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR能快速、敏感、特异地检测细胞株和临床宫颈刮取物miR-155的表达水平,为进一步研究miR-155及其临床应用奠定了基础。     

茎环引物的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测miR-155表达及其临床初步应用

目的建立茎环状逆转录引物(简称茎环引物)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR),并作初步应用。方法应用SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR检测CD4+T细胞株的miR-155,初步验证方法的可行性。用所建立的方法对60份临床宫颈刮取物标本进行检测,分析miR-155与宫颈癌及感染的高危型人类乳头状瘤病毒(HPV)基因型别的关系,其聚合酶链反应(PCR)反应产物通过电泳验证产物特异性。结果所建方法能特异的检测到miR-155的扩增信号,最低检出限为10-7nmol/L,在10-1~10-6nmol/L之间有良好的线性关系,相关系数(r)为0.99,扩增后惟一的熔解曲线特异峰显示很好的特异性。CD4+T细胞株及60例临床宫颈刮取物标本miR-155均显示阳性,PCR反应产物电泳可获得单一条带。宫颈刮取物miR-155与宫颈癌有关(P<0.05),但与本研究涉及的HPV基因型别无关(P>0.05)。结论所建立的茎环引物的SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR能快速、敏感、特异地检测细胞株和临床宫颈刮取物miR-155的表达水平,为进一步研究miR-155及其临床应用奠定了基础。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测食管癌患者血清miR-100表达的意义

目的检测食管癌患者与健康人血清中miR-100的表达量差异,并探讨其作为食管癌分子诊断指标的可能性。方法采用实时荧光定量PCR方法,检测40例食管癌患者(研究组)和50例体检健康者(对照组)血清中miR-100的表达量,并进行统计学分析。结果研究组及对照组血清中miR-100的表达量分别为6.399±3.541、2.625±1.515,研究组明显高于对照组,差异有统计学意义(t=9.07,P0.05)。用于食管癌患者诊断的miR-100的ROC曲线下面积为0.832(95%置信区间为0.731~0.934),当Cut off值为5.285时,miR-100诊断食管癌的灵敏度和特异度分别为65%和95%。结论食管癌患者血清中miR-100表达较健康人高,有望成为该疾病辅助诊断的新分子标志物。     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测类风湿关节炎患者血清miR-146a的表达及意义

目的用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测类风湿关节炎(RA)患者血清miR-146a的表达水平,探讨其在RA诊断中的意义。方法以U6为内参照,用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测RA患者48例(活动期30例、缓解期18例)、骨性关节炎(OA)患者22例和体检健康者25例血清miR-146a的表达水平,并进行ROC曲线分析;对各组进行红细胞沉降率(ESR)检测。结果 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测结果表明,活动期RA患者血清miR-146a水平为(2.42±0.75),显著高于缓解期RA患者(1.66±0.29)、OA患者(1.12±0.43)和体检健康者(1.01±0.34),差异均有统计学意义(P均0.05);miR-146a诊断活动期RA的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.914(95%CI:0.872~0.926);以1.96为cut off值,敏感性为95.0%、特异性为87.5%、准确性为91.9%。活动期RA组ESR为(37.5±5.2)mm/h,缓解期RA组为(14.4±4.7)mm/h,OA组为(11.6±5.1)mm/h,健康对照组为(9.6±3.9)mm/h,各组间差异有统计学意义(F=177.01,P0.01)。结论建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR可用于RA患者血清miR-146a的检测。miR-146a可用于诊断活动期RA。     

乙型肝炎病毒SYBR Green I 实时荧光定量PCR方法的建立及临床应用

目的 建立SYBR Green I实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的快速方法,并探讨其临床应用价值。方法 根据GenBank公布的Hepatitis B virus gp1基因序列设计引物,建立SYBR Green I实时荧光定量PCR,并对反应体系和扩增程序进行优化。定量标准品通过基因克隆方法获得,同时以浙江省夸克公司HBV DNA定量检测试剂盒作对照,应用于随机选取的100份乙型肝炎患者血清检测。结果 SYBR Green I实时荧光定量PCR检出限范围为5×10²copies/ml～5×10⁸copies/ml,HBV DNA浓度与CT值有良好线性关系,无交叉反应,整个过程仅需2.5 h。在随机抽取的100份临床标本应用中,与浙江省夸克公司的HBV荧光定量PCR检测试剂相比,建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR体系灵敏度100%,特异度92.5%。结论SYBR Green实时荧光定量PCR快速、简便、灵敏度高、特异度强,可用于乙型肝炎患者病情监测,有效指导临床用药,准确评价HBV感染者的病情。     

实时荧光定量PCR检测急性髓系白血病miR-125b的表达及临床应用

目的 采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)法检测急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中微小RNA-125b(microRNA-125b,miR-125b)转录本含量,初步评价其在AML临床诊断中的意义. 方法 建立扩增miR-125b转录本的SYBR Green I染料法qPCR,对miR-125b转录本克隆质粒进行扩增,评价其在AML诊断中的特异性、重复性和灵敏性.并对69例AML患者的骨髓单个核细胞标本进行初步检测并评价其临床相关性. 结果 该方法能定量检测骨髓标本中miR-125b的表达水平,熔解曲线呈单峰,在108～ 103 copies/μL范围内有良好的线性关系(R2=0.999)并且检测重复性良好.结果显示69例AML患者中miR-125b表达水平明显高于25例对照组,差异有显著统计学意义(P=0.001).在初发AML的不同亚型中,M3型的miR-125b表达水平高于其他亚型,差异有统计学意义(P＜0.05).miR-125b表达水平与非M3型AML患者的年龄、性别、外周血白细胞计数、血小板计数、血红蛋白含量、FAB分型、核型分组之间均无相关性(P＞0.05).4例初诊AML患者在获得完全缓解后miR-125b表达水平均较治疗前有所降低. 结论 所建立的实时荧光定量PCR方法能敏感、特异地检测骨髓单个核细胞标本中miR-125b的表达水平,为进一步临床应用研究奠定了方法学基础.miR-125b异常高表达是AML中的一个常见分子事件,检测其表达可能有助于AML患者的辅助诊断和疾病状态监测.     

GeneXpert实时荧光定量PCR快速检测艰难梭菌的临床评估

目的对GeneXpert实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)在快速检测临床粪便标本中艰难梭菌的应用进行评估。方法采用双拭子蘸取临床未成形粪便标本,一支拭子用于GeneXpert实时荧光定量PCR检测艰难梭菌毒素基因tcdB,另一支用于常规厌氧菌培养检测;对GeneXpert实时荧光定量PCR检测结果与常规厌氧菌培养结果的一致性进行统计学分析,并计算GeneXpert实时荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值等参数。结果临床收集到141例未成形粪便标本,GeneXpert实时荧光定量PCR检出艰难梭菌毒素基因tcdB阳性42例,其中常规厌氧菌培养阳性34例,两者一致性较好(Kappa=0.775 0,P0.01),GeneXpert实时荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为87.2%、92.2%、81.0%和94.9%。结论 GeneXpert实时荧光定量PCR直接检测粪便标本中的艰难梭菌具有检测快速、操作简便等优点,有重要的临床应用价值。     

实时荧光定量PCR检测抑癌基因PHBI在胃肠肿瘤中的表达

目的检测抑癌基因PHBI在胃肠肿瘤中的表达情况,探讨PHBI在胃肠肿瘤的发生和发展过程中所起的作用。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术进行检测。结果抑癌基因PHBI在胃肠肿瘤组织的表达比在癌旁组织中有显著增高,差异有统计学意义(P0.01);另外对照胃肠肿瘤组织病理切片,发现低分化胃癌组织中PHBI的表达比中分化胃癌组织高,差异有统计学意义(0.01P0.05)。结论抑癌基因PHBI在胃肠癌组织中显著高表达,检测胃肠癌组织中PHB的表达以及组织分化程度,为胃肠肿瘤的治疗和预后提供依据。     

实时荧光定量聚合酶链反应在肺结核诊断中的应用

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)在肺结核诊断中的应用价值。方法应用FQ-PCR对临床诊断肺结核及其他肺部疾病患者的临床标本进行结核分枝杆菌DNA定量检测,同时与涂片抗酸染色、BACTEC 960培养法作比对。结果 189例临床诊断肺结核患者FQ-PCR检测123例阳性,提示敏感度为65.1%(123/189),而涂片抗酸染色、BACTEC 960培养法分别为40.2%(76/189)、63.5%(120/189)。94例其他肺部疾病患者及20例健康对照者FQ-PCR检测均为阴性,特异度为100.0%。结论 FQ-PCR敏感度和特异度均高,检测过程简单、易标准化、全过程仅需4～5h,可用于结核病的快速诊断。     

SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线鉴定鸟分枝杆菌方法的建立及初步应用

目的基于SYBR GreenⅠ荧光染料建立鉴定鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium,MA)的荧光PCR熔解曲线法,为临床鉴定MA提供简单、准确性高的分子生物学检测方法。方法以MA的特异性插入序列IS1311为检测靶标设计引物,在60℃的退火温度下,建立鉴定MA的SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线方法,并对MA等21种分枝杆菌标准株和金黄色葡萄球菌等5种常见致病菌进行检测,评价方法的特异性、检测限;以hsp65、16S rDNA普通PCR扩增产物测序分析为“金标准”,鉴定200株分枝杆菌临床分离株,评估建立方法鉴定MA的准确性。结果SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线方法在30个循环内能准确鉴定出21种分枝杆菌标准株和5种致病菌中的MA,检测限为5.6×10-2 ng/μL。200株分枝杆菌临床分离株中,以PCR测序鉴定出16株MA和184株其他分枝杆菌,以SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线方法鉴定出15株MA和185株非MA;本研究建立的方法和测序方法对MA的鉴定率差异无统计学意义(P>0.05);两法符合率为99.5%(199/200),一致性较高(Kappa值>0.75,P<0.01);建立方法的敏感性为93.8%(15/16),特异性为100.0%(184/184),阳性预测值为100.0%(15/15),阴性预测值为99.5%(184/185)。结论以MA特异性重复序列IS1311为基础建立的SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线方法,具有较高的灵敏度和特异性,为MA的临床检测提供新的途径。     

实时定量PCR检测胃癌组织miR-20a及初步应用

目的建立检测人胃癌组织中miR-20a的实时荧光定量PCR方法。方法建立miR-20a标准曲线,评价该法检测的线性范围及灵敏度;对标准质粒扩增产物进行熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳检测以分析该法的特异性。取高、中、低3份不同浓度的标准质粒进行批内和日间变异系数(CV)的检测,分析该法的重复性。收集70例胃癌患者手术切除的癌组织和对应的癌旁组织,定量检测组织中miR-20a的表达水平。结果构建的实时荧光定量PCR法的灵敏度为101copies/μL,扩增的线性范围为101～109copies/μL;扩增产物的熔解曲线峰和电泳片段特异;3份不同浓度标准质粒定量检测的批内CV分别为6.33%、4.74%、5.89%,日间CV分别为9.45%、6.29%、7.48%。定量结果显示75.7%(53/70)胃癌组织中miR-20a的表达高于癌旁组织,差异有显著性(Z=-4.427,P<0.01)。结论建立的实时荧光定量PCR检测miR-20a的方法准确、快速、灵敏、特异,可用于胃癌组织中miR-20a的检测。     

实时荧光定量PCR直接检测粪便标本艰难梭菌tcdB基因

目的建立艰难梭菌实时荧光定量PCR检测方法,直接检测粪便标本艰难梭菌tcd B基因,并探讨其应用价值。方法根据艰难梭菌基因组设计tcd B基因特异性引物及探针,用ATCC 43255标准株评价其敏感性,选取艰难梭菌生物学特征相近的临床菌株验证其特异性;收集2015年10-12月临床腹泻患者稀便标本115份,提取基因组总DNA后进行tcd B基因检测,并以产毒培养法为参考方法,探讨该方法的临床诊断价值。结果荧光定量PCR法最低检测限为1×10-3ng,并且仅特异性地扩增产毒艰难梭菌;临床样本评价荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为75.0%、99.1%、85.7%和98.1%。结论实时荧光定量PCR直接检测稀便标本中的艰难梭菌tcd B基因可用于艰难梭菌相关腹泻的快速诊断。     

荧光定量RT-PCR检测沙门氏菌方法的建立

目的建立沙门氏菌实时荧光定量PCR的快速检测方法 ,探讨该方法的可行性和应用价值。方法根据沙门氏菌fimY基因序列设计引物和探针,采用基因重组技术构建用于沙门氏菌检测的定量标准品,建立实时荧光定量PCR检测沙门氏菌的方法。结果成功构建了沙门氏菌重组质粒标准品和沙门氏菌实时荧光定量PCR方法 ;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性;对模拟标本与分离培养对比,二者符合率为100%。结论沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法的建立,为食源性沙门氏菌污染的快速检测提供依据,可应用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等。     

实时荧光定量PCR在测定艾滋病患者肠道菌群量变化中的应用及意义

目的:应用实时荧光定量PCR观察艾滋病患者肠道菌群量的变化,研究艾滋病对肠道微生态的影响及其在发病中的作用。方法:分别设计双歧杆菌属、乳酸杆菌属、大肠杆菌、粪肠球菌及屎肠球菌的特异性引物。收集艾滋病患者粪便标本30份及正常对照标本30份,提取细菌基因组DNA,应用实时荧光定量PCR反应测定5种细菌的数量。结果:艾滋病患者组双歧杆菌属、乳酸杆菌属的数量较正常对照组明显减少;大肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌数量明显增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:艾滋病患者肠道微生态发生了明显变化,提示艾滋病患者肠道微生态紊乱。     

初诊2型糖尿病患者血清中miR-29a和miR-375表达变化及其与糖、脂标志物相关性研究

目的探讨miR-375和miR-29a在初诊2型糖尿病（DM）患者血清中的表达水平,及其表达变化与糖、脂标志物的相关性。方法排除既往已诊断DM的健康体检者,所有研究对象均行75克葡萄糖耐量（OGTT）实验,根据1999年WHO的DM诊断标准,将研究对象分为糖代谢正常组（38例）和DM组（48例）。以RNU6B作为内参基因,采用实时荧光定量PCR的方法检测血清中miR-29a和miR-375的相对表达水平。结果 DM患者血清中的miR-29a和miR-375表达量皆显著高于对照组。血清中miR-29a和miR-375的表达量与FPG、2hPG和糖化血红蛋白皆呈显著正相关（P〈0.05）,与血脂各指标无显著相关性（P〉0.05）。血清miR-29a和miR-375表达量间呈显著正相关性。结论 miR-29a和miR-375在血清中表达变化有可能作为诊断2型糖尿病的分子标志物。miR-29a和miR-375两者在2型糖尿病的发生、发展中可能具有协同调控作用。     

实时定量PCR检测乳腺癌患者内皮素-1的表达及其临床意义

目的检测内皮素-1(EDN-1)基因在乳腺癌患者外周血中的表达情况,并探讨它在乳腺癌的发生、发展中的作用。方法选取2013年1月1日至2014年5月20日在花都区人民医院接受乳腺手术且经病理学证实为乳腺癌的患者54例纳入试验组,另选取同期体检健康女性60例纳入对照组。采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测所有研究对象外周血EDN-1的表达情况,并分析其与各临床参数的关系。结果乳腺癌患者外周血EDN-1表达水平高于体检健康女性,组间比较差异有统计学意义(P0.01),其表达水平为健康女性人群的5.877倍;EDN-1的表达水平与患者的年龄和肿瘤的组织类型均无关(P0.05),与患者的肿瘤大小、区域淋巴结转移情况、是否有远处转移密切相关(P0.05)。结论 EDN-1基因与乳腺癌的发生、发展关系密切,实时定量PCR可以敏感、特异地检测乳腺癌患者外周血中EDN-1的表达,可以为乳腺癌的筛查与早期诊断提供帮助,宜在临床工作中开展。     

实时荧光定量PCR法用于人类SLC01B1和ApoE基因多态性检测的方法学评价

目的：探讨在ISO15189实验室认可体系下,实时荧光定量 PCR法检测人类SLC01B1和ApoE基因多态性的方法学评价。方法本文收集经Sanger测序确定基因型的20份DNA样本。采用实时荧光定量PCR法对其中2份样本的SLCO1B1*1b、SLCO1B1*5、ApoE2和ApoE4共4个多态性位点分别批内重复扩增检测10次,以评价方法的精密度;再使用该方法扩增所有样本的4个多态性位点,每个位点检测一次,并与Sanger测序法结果比对,以评价方法的准确性;使用实时荧光定量PCR法对其中1份经梯度稀释的DNA样本进行扩增,以评价方法的最低检测限。结果2份DNA样本扩增所得Ct值变异系数均小于2．5％（≤1％）;与Sanger测序法结果对比,实时荧光定PCR法结果准确性达100％（20／20）;DNA浓度在0．964 ng／μl时,该方法仍可正确检出其基因型。结论借助经典实时荧光定量PCR法,我们能准确、快速地检测临床样本SLC01B1和ApoE基因多态性,用于指导正确合理使用他汀类药物。