高转移胃癌细胞株的建立及其肿瘤干细胞的生物学特征

目的:建立高转移胃癌细胞株并研究其肿瘤干细胞生物学特征.方法:将胃癌细胞株SNU-5接种至裸鼠皮下成瘤后,取肺部转移灶,通过机械分离法并反复接种裸鼠,获取细胞株SNU-5-V12,采用无血清悬浮培养及PKH26染色确定SNU-5-V12细胞中存在肿瘤干细胞.流式细胞术分析SNU-5和SNU-5-V12细胞中CD44肿瘤干细胞标志物表达情况,分选SNU-5和SNU-5-V12细胞中CD44+细胞并进行体外生物学特征研究及裸鼠致瘤实验.结果:建立高转移SNU-5-V12细胞株,SNU-5-V12细胞无血清悬浮培养11d后形成的细胞球体中存在单个PKH26阳性细胞.流式分析显示高转移SNU-5-V12细胞中干细胞标志物CD44比例显著高于SNU-5细胞[(72.9±1.5)％ vs (8.96±1.2)％],且SNU-5-V12的CD44+细胞比SNU-5的CD44+细胞具有更强的自我更新能力[成球率(27.8±1.7)％ vs (20.4±1.0)％,P＜0.01],转移细胞数增加1.64倍[(329.5±7.5) vs (200±2.0)个,P＜0.01],耐药能力也显著增强[IC50:(0.286 vs 0.196)μ∥ml,P＜0.01],裸鼠皮下接种2×102个CD44+ SNU-5-V12细胞2个月2/6裸鼠可致瘤,而CD44+ SNU-5细胞需要接种2×104个细胞2个月时仅1/6裸鼠致瘤.结论:获得高转移胃癌细胞株SNU-5-V12,其CD44+细胞体内外功能显著增强,为胃癌干细胞的靶向治疗提供有价值的细胞模型.     

肿瘤干细胞的生物学特性与靶向治疗

 肿瘤干细胞（CSC）在肿瘤的发生、复发、转移和耐药中起着十分重要的作用。常规的化疗药物能杀死大部分恶性细胞，但对数量极少的CSC却作用甚微，残存的CSC足以使肿瘤复发和转移。采用针对CSC的靶向治疗，才有可能从根本上治愈肿瘤。深入了解CSC不同于肿瘤组织中其他细胞类型的生物学特性，有助于进一步研究和开展特异性针对CSC的靶向治疗。     

人肝癌组织中肿瘤干细胞样细胞的分离培养及鉴定

目的：从人肝癌组织中分离培养肝癌干细胞样细胞,为进一步研究肝癌干细胞靶向治疗奠定基础。方法：采用酶消化法和以原代培养结合短暂传代培养的方法从人肝癌组织中分离出含人肝癌干细胞样细胞（human liver cancer stemlike cells, hLCSLCs) 的连续传代细胞,分别加入肝素、白蛋白、氢化可的松以筛选适用于hLCSLCs的无血清悬浮成球培养基。以流式细胞术检测hLCSLCs和由无血清悬浮成球培养所获得的成球细胞中旁群（side population, SP）细胞、CD133及CD90等的表达,裸鼠成瘤实验检测这两种细胞的致瘤能力。结果：成功地从人肝癌组织分离获得hLCSLCs,其SP、CD133+和CD90+细胞含量分别为0.9%、0.8%和12.7%,裸鼠皮下接种2 000个SP细胞的成瘤率为100%。含有肝素的无血清培养基更适于hLCSLCs的成球培养,所获成球细胞中SP、CD133+和CD90+细胞含量分别为4.6%、9.7%和48%,接种10 000个成球细胞即可全部成瘤。结论：成功建立了从人肝癌组织中分离肿瘤干细胞样细胞的方法,添加肝素的无血清悬浮成球培养法可有效富集肝癌干细胞样细胞。     

抗肝癌干细胞功能性单克隆抗体的研制

摘 要? 目的：研制抗肝癌干细胞的功能性单克隆抗体,为肝癌干细胞的靶向治疗提供候选抗体药物。方法：从人肝癌组织中分离人肝癌干细胞样细胞（human liver cancer stem-like cells, hLCSLCs）,免疫BALB/c裸鼠,采用脾细胞融合法制备大容量单抗库。应用细胞免疫荧光、无血清成球培养、裸鼠皮下成瘤等方法筛选、鉴定特异识别肝癌干细胞的单克隆抗体。流式细胞仪分选hLCSLCs侧群细胞（hLCSLCs side population cells, hLCSLCs-SP）,无血清悬浮培养法和CCK-8法检测杂交瘤单抗对hLCSLC-SP自我更新和增殖能力的影响。结果：细胞融合后获得2 964株杂交瘤克隆,在能与hLCSLCs反应的237株克隆中,有116株单抗能与hLCSLCs的细胞膜结合,其中的33株杂交瘤单抗只与hLCSLC-SP反应（阳性率为2%~5%）、不与非hLCSLC-SP反应。该33株单抗中有6株能与CD133阳性细胞有不同比例的共染,并且与无血清悬浮培养的成球细胞呈阳性反应(阳性率为3%~26%),明显高于hLCSLCs-SP。裸鼠皮下接种1×104个15D2单抗阳性的hLCSLCs,成瘤率为100%。功能性筛选实验发现,6株单抗中的4株能显著抑制hLCSLC-SP的增殖和成球生长,其抑制率分别为24%~42%和13%~50%。结论：采用自建的大容量单克隆抗体库技术,筛选获得了4株特异性识别hLCSLC-SP的功能性单抗,为肝癌干细胞的抗体靶向治疗奠定了基础。     

肝癌干细胞研究进展

近几年,肿瘤起源于干细胞的假说正在人类各种肿瘤中得到证实,包括肝癌。目前认为肿瘤干细胞对肿瘤发生、转移和预后起了关键作用,因此如何分离和鉴定肝癌干细胞对于改善预防方法、促进早期检测以及研发新的治疗方法都是一个非常紧迫的课题。本文就有关肝癌干细胞存在的依据、来源、表面标志物分选等研究进展作一综述。     

肝癌干细胞研究进展

近几年,肿瘤起源于干细胞的假说正在人类各种肿瘤中得到证实,包括肝癌。目前认为肿瘤干细胞对肿瘤发生、转移和预后起了关键作用,因此如何分离和鉴定肝癌干细胞对于改善预防方法、促进早期检测以及研发新的治疗方法都是一个非常紧迫的课题。本文就有关肝癌干细胞存在的依据、来源、表面标志物分选等研究进展作一综述。     

肝癌干细胞抗体靶向治疗的实验

目的研究抗人肝癌干细胞鼠单抗15B7的生物学特征、体内外功能,探讨靶向肝癌干细胞是否能够有效抑制肝癌移植瘤复发、自发性肺转移以及延长荷瘤小鼠的生存期。方法采用双色免疫荧光、双色流式细胞技术、皮下成瘤实验,检测、鉴定15B7单克隆抗体能够识别肝癌干细胞(hepatocellular carcinomacancer stem cells, HCC-CSC)。从人肝癌细胞系BEL7402中以流式细胞仪分选具有CD133+或ESA+表型的细胞。在此基础上采用CCK-8细胞增殖实验、侵袭实验、迁移实验等检测分析15B7单抗对CD133+表型的细胞增殖、侵袭、迁移的作用以及对细胞周期的影响。裸鼠体内治疗实验研究15B7单抗对BEL7402移植瘤生长的抑制作用。以Western blot方法鉴定该功能性单抗的抗原。结果双色免疫荧光和双色流式检测显示15B7单抗能与HCC-CSC的标志物ESA、CD133共染;流式分选15B7+或ESA+或CD133+的细胞在体外无血清培养条件下有良好的成球生长能力;流式分选的15B7+细胞裸鼠皮下接种1×104个/只,2月可形成肿瘤,以上实验证明15B7单抗是抗肝癌干细胞的单抗。体外功能实验结果显示15B7单抗能够抑制CD133+细胞的增殖、迁移、侵袭,抑制率分别达13.8%、157%和30.9%,同时还能诱导CD133+细胞发生G1期阻滞。体内治疗实验研究结果表明15B7单抗能明显抑制裸鼠肝癌移植瘤生长,抑制率可达60.5%。Western blot显示15B7单抗识别HCC-CSC表达的抗原蛋白相对分子质量约50 kD。结论15B7单抗能明显抑制裸鼠体内人肝移植瘤的生长,为肝癌干细胞的靶向治疗提供有重要应用价值的候选抗体药物。     

肿瘤治疗新目标——肿瘤干细胞

肿瘤干细胞是肿瘤细胞的祖细胞,是肿瘤的真正种子,它们虽然仅占肿瘤细胞中极少的一部分,但具有自我更新能力和不定分化潜能,是形成不同分化程度肿瘤和肿瘤不断生长的根源,是肿瘤发生、扩散、复发等过程中的“起始细胞”或“动力细胞”。传统的化疗药物不能有效靶向作用肿瘤干细胞,开发针对肿瘤干细胞的靶向治疗,能给肿瘤治疗模式带来全新的改变,有望彻底改善患者的预后。     

肝癌耐药细胞株的建立及癌干细胞的特性

目的建立肝癌耐药细胞株,并观察耐药细胞株癌干细胞的相关生物学特性。方法采用阿霉素（ADM）浓度梯度递增法诱导建立耐药BEL-7404人肝癌细胞株,并对亲代与耐药肝癌细胞株进行癌细胞基本特性、癌于细胞相关细胞学特性进行检测,用计数法检测癌细胞生长曲线、倍增时间与MTT法测耐药倍数;单个细胞成株培养、平板克隆形成实验、“球囊”细胞培养实验。结果耐药BEL-7404人肝癌细胞与亲本细胞相似,呈上皮样生长方式,但其中梭状细胞略多,耐药倍数为292倍;生长曲线表明其增殖速度明显低于亲本BEL-7404人肝癌细胞,且倍增时间增加;耐药BEL-7404肝癌细胞克隆形成率、“球囊”细胞形成率均明显低于其亲本BEL-7404人肝癌细胞。结论低浓度阿霉素持续增量法可诱导形成耐药肝癌细胞株,但耐药肝癌细胞株的癌干细胞特征并不明显。     

肿瘤干细胞研究现状

复发和转移是限制肿瘤临床治疗疗效的瓶颈。近些年,产生和发展了肿瘤干细胞理论,试图解释这种现象。本文就肿瘤干细胞研究的理论基础、现状及前景做一综述。     

Establishment and characterization of a novel neuroendocrine carcinoma cell line derived from a human ascending colon tumor

The incidence of rare neuroendocrine tumors (NET) is rapidly increasing. Neuroendocrine carcinoma (NEC) is a NET with poorly differentiated histological features, high proliferative properties and associated poor prognoses. As these carcinomas are so rare and, thus, affect only a small number of patients allowing for few cell lines to be derived from patient biopsies, the histological, immunohistochemical, and clinical characteristics associated with colorectal NEC and NEC in other organs have yet to be clearly defined. Herein, we describe the establishment of a novel NEC cell line (SS‐2) derived from a tumor resection of the ascending colon from a 59‐year‐old Japanese woman. The histological, electron microscopic and immunohistochemical features of chromogranin A (CgA) as well as confirmation of synaptophysin positivity in this tumor were typical of those commonly observed in surgically resected colorectal NEC. Further, the Ki‐67 labeling index of the resected tumor was >20% and, thus, the tumor was diagnosed as an NEC of the ascending colon. The SS‐2 cell line maintained characteristic features to those of the resected tumor, which were further retained following implantation into subcutaneous tissues of nude mice. Additionally, when SS‐2 cells were seeded into ultra‐low attachment plates, they formed spheres that expressed higher levels of the cancer stem cell (CSC) marker CD133 compared to SS‐2 cells cultured under adherent conditions. SS‐2 cells may, therefore, contribute to the current knowledge on midgut NEC biological function while providing a novel platform for examining the effects of colorectal NEC drugs, including CSC.     

舌癌耐药细胞株的建立及癌干细胞特性的实验观察

目的建立舌癌耐药细胞株,并观察耐药细胞株癌干细胞的相关生物学特性。方法以低浓度阿霉素持续增量诱导法建立TCA-8113舌癌耐药细胞株,并对亲代与舌癌耐药细胞株进行癌细胞基本特性、癌干细胞相关细胞学特性的检测,分别以计数法检测癌细胞生长曲线、倍增时间以及用MTT法测定耐药倍数,并进行单个细胞成克隆实验、平板克隆形成实验和悬浮球形成实验。结果TCA-8113舌癌耐药细胞为“铺路石”状上皮样生长方式,但其中异形细胞略多,耐药倍数为22倍;生长曲线提示其增殖速度明显低于亲本TCA-8113舌癌细胞,且倍增时间增加,但在细胞周期中各期细胞比例未见明显改变;TCA-8113舌癌耐药细胞克隆形成率、单个细胞培养成株率均明显低于其亲本TCA-8113舌癌细胞（P〈0．05）。结论低浓度阿霉素持续增量法可诱导形成舌癌耐药细胞株,但舌癌耐药细胞株的癌干细胞特征并不明显。     

大细胞肺癌干细胞样细胞的分离及鉴定

目的：从大细胞肺癌组织中分离、鉴定肺癌干细胞样细胞,为进一步研究靶向肺癌干细胞的免疫治疗奠定基础。方法：利用无血清培养基从大细胞肺癌组织中分离、培养肿瘤细胞并建立大细胞肺癌细胞系。流式细胞仪分选表达CD44和（或）CD90的不同肺癌细胞亚群,通过单细胞克隆形成实验、平板集落形成实验、细胞球形成实验及X射线敏感实验研究不同肺癌细胞亚群的生物学特性。结果：应用原代细胞培养技术成功地从大细胞肺癌组织中培养出高纯度的原代肿瘤细胞,命名为LC006细胞,其传代次数可达30代以上。流式细胞仪分析显示, LC006细胞中有1.0%的细胞CD44呈强阳性表达（CD44++）。相比于主群的CD44弱阳性（CD44＋）细胞,CD44++ LC006细胞具有较强的平板集落形成能力,可形成holoclone克隆和细胞球;而CD44＋LC006细胞不能形成holoclone克隆和细胞球。应用CD44和CD90抗体可将LC006细胞分为4个亚群,分别是 CD44＋CD90+（12.8%）、CD44＋CD90-(86.3%)、CD44++CD90+(0.4%)和CD44++CD90-(0.5%)细胞;相比于其他细胞亚群,CD44++CD90+LC006细胞形成细胞球的能力最强,对X射线的抵抗力也最强。结论：成功分离和鉴定的CD44++CD90+LC006细胞是大细胞肺癌的肿瘤干细胞样细胞。     

胃癌细胞中CD44阳性细胞具有肿瘤干细胞特征

目的:在原位移植瘤模型上验证CD44+胃癌细胞的肿瘤干细胞特性.方法:选取MKN-45胃癌细胞株,通过流式细胞仪分选为CD44+和CD44-两组,以未分选的MKN-45胃癌细胞为对照.体外部分,通过MTT法和克隆形成实验验证CD44+胃癌细胞体外增殖能力,通过Transwell实验验证其侵袭力.体内部分,将上述细胞通过原位移植法接种至裸鼠,同等条件下饲养8周后处死裸鼠,检验其成瘤率;分离肝脏,检测肝转移瘤数目;H-E染色观察胃肿瘤和肝转移瘤形态;通过免疫荧光法检测两处肿瘤CD44+细胞数量.结果:CD44+胃癌细胞相比CD44‘胃癌细胞具有明显增强的细胞增殖力(P＜0.01)和侵袭力(P＜0.01),更容易成瘤且更容易发生转移(P＜0.05),但和MKN-45未分选组相比差异无统计学意义(P＞0.05).不论是在原发肿瘤还是转移瘤中,CD44+胃癌细胞均能产生CD44‘细胞,但后者不能产生CD44+细胞.结论:CD44+ MKN-45胃癌细胞相比CD44-胃癌细胞具备更强的增殖力和侵袭力、更容易成瘤和发生转移,符合肿瘤干细胞部分特征,值得进一步研究.     

人卵巢癌细胞系干/祖细胞分离及其鉴定

目的:自人卵巢癌细胞系SK-OV-3中分离干/祖细胞并进行鉴定。方法:采用无血清球形体形成法从SKOV-3中分离培养卵巢癌干/祖细胞;采用实时定量PCR和蛋折质印迹法测定球形体细胞干/祖细胞相关标志ABCG2、Oct-4、Nanog基因和蛋白的表达;流式细胞仪检测其耐药性;双层软琼脂检测其克隆形成能力;NOD/SCID小鼠检测其体内致瘤性。结果:球形体细胞表达干/祖细胞相关标志Oct-4、ABCG2、Nanog;对顺铂高耐药;在双层软琼脂上克隆形成率达(13.67±1.48)%;1 000个球形体形成细胞就能在NOD/SCID鼠中成瘤。结论:采用无血清培养基中球形体形成法从SKOV-3细胞系中可以分离出具有干/祖特性的卵巢癌细胞,可为今后研究卵巢癌的发生、发展、复发及其化疗药物筛选提供简便实用的体外模型。     

组蛋白去乙酰化酶4在人肝癌细胞Bel7402中的表达及其意义

目的：研究组蛋白去乙酰化酶4（histone deacetyase4，HDAC4）在人肝癌细胞株Bel-7402中的表达，及其对Bel-7402细胞增殖和分化的调控作用。方法：培养Bel-7402细胞，以组蛋白去乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠（sodium phenylbutyrate，SPB）作用于Bel-7402，RT—PCR检测用药前后HDAC4 mRNA的表达水平，倒置相差显微镜观察细胞形态改变，MTT比色法观察SPB对Bel-7402生长的抑制作用，流式细胞术分析细胞周期，免疫组化法观察Bel-7402细胞P27蛋白的表达水平。结果：SPB处理后Bel-7402中HDAC4mRNA的表达水平降低（0．88±0．13，0．12±0．04，P〈0．05）；SPB处理后Bel-7402细胞生长受到明显抑制，且与SPB剂量和作用时间相关；同时细胞形态出现成纤维细胞样改变；细胞周期阻滞于G。期[（50．6±4．0）％，（78．8±3．6）％，P〈0．05）]；P27蛋白表达水平增强（23±11，61±7，P〈0．05）。结论：SPB降低HDAC4在人肝癌细胞中的表达，从而诱导部分人肝癌细胞分化，该作用与P27蛋白水平变化有关。     

Therapeutic strategies targeting cancer stem cells

Increasing studies have demonstrated a small proportion of cancer stem cells (CSCs) exist in the cancer cell population. CSCs have powerful self-renewal capacity and tumor-initiating ability and are resistant to chemotherapy and radiation. Conventional anticancer therapies kill the rapidly proliferating bulk cancer cells but spare the relatively quiescent CSCs, which cause cancer recurrence. So it is necessary to develop therapeutic strategies acting specifically on CSCs. In recent years, studies have shown that therapeutic agents such as metformin, salinomycin, DECA-14, rapamycin, oncostatin M (OSM), some natural compounds, oncolytic viruses, microRNAs, cell signaling pathway inhibitors, TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL), interferon (IFN), telomerase inhibitors, all-trans retinoic acid (ATRA) and monoclonal antibodies can suppress the self-renewal of CSCs in vitro and in vivo. A combination of these agents and conventional chemotherapy drugs can significantly inhibit tumor growth, metastasis and recurrence. These strategies targeting CSCs may bring new hopes to cancer therapy.