下调PHLDB3对胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR药物敏感性的影响

目的:探讨下调PHLDB3对胃癌耐药细胞系 SGC7901/ADR 药物敏感性的影响。方法:采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹技术（Western blot）的方法检测胃癌及癌旁正常组织中PHLDB3的表达（分别是20对和10对）;qRT-PCR和Western blot检测PHLDB3在胃癌细胞系 SGC7901以及胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中的表达;MTT法检测SGC7901、SGC7901/ADR及转染PHLDB3 siRNA后 SGC7901/ADR的半数抑制浓度（IC50）值;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:qRT-PCR和Western blot结果显示:PHLDB3在胃癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织（P<0.000 1）;PHLDB3在耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中的表达明显高于其亲本细胞系SGC7901（P<0.000 1和P<0.05）。Western blot结果显示:相对于转染 PHLDB3 negative control（NC）组,转染 PHLDB3 siRNA组的SGC7901/ADR细胞中PHLDB3的表达降低（P<0.005）。MTT结果显示:SGC7901与 SGC7901/ADR的IC50值分别为（1.5±0.1） μg/ml与（5.5±0.2） μg/ml（P<0.000 1）;SGC7901/ADR 转染 PHLDB3 siRNA 后对顺铂的IC50值明显下降（P<0.05）。流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测凋亡,结果显示:下调PHLDB3的表达后,SGC7901/ADR细胞的凋亡率明显增加（P<0.05）。结论:PHLDB3能够促进胃癌细胞系 SGC7901/ADR产生多药耐药。     

锌带基因ZNRD1在胃癌耐药细胞中的表达和功能

目的 探讨锌带基因ZNRD1在多药耐药胃癌细胞中的表达和作用。方法 应用Northern blot和半定量RT—PCR,观察锌带基因ZNRD1在胃癌细胞SGC7901及其长春新碱(VCR)诱导的耐药细胞SGC7901／VCR中的表达;将反义核酸转染SGC7901／VCR细胞,通过免疫组化检测转导细胞与非转导细胞ZNRD1蛋白的表达;以流式细胞仪检测细胞周期的变化,以MTT实验检测细胞生长曲线和对VCR、阿霉素(ADM)的药敏性。结果 胃癌耐药细胞SGC7901／VCR与非耐药细胞相比,ZNBDl基因的表达明显增高。转导株antiZNRDl—SGC7901／VCR细胞的ZNRD1蛋白水平明显低于非转导株,C1期细胞比例增加而S期比例减少,生长受到抑制,且对VCR、ADM的敏感性明显增高。结论 胃癌耐药细胞与非耐药细胞相比,ZNRDl基因处于高表达状态。反义核酸转染可有效阻断ZNRDl蛋白的表达,在一定程度上逆转人胃癌耐药细胞SGC7901／VCR的多药耐药性。     

人核糖体蛋白S13(RPS13)编码基因的克隆及其正反义核酸转染胃癌细胞的初步研究

目的：扩增人核糖体蛋白S13（RPS13）编码基因序列，构建其正，反义真核表达载体，分别转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR，以进一步研究RPS13基因与胃癌多药耐药的关系。方法：采用RT-PCR法扩增RPS13cDNA片段编码区全长序列，利用DNA重组技术的建正，反义真核表达载体，经脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR，筛选正，反义基因稳定转染细胞，RNA斑点杂交法检测正，反义稳定转染细胞mRNA水平的变化。结果：从高表达RPS13的SGC7901/VCR耐药细胞中提取细胞总RNA，RT-PCR法成功扩增了RPS13cDNA片段编码区全长序列，并经测序证实；目的基因因按正，反两个方向亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),并经酶切鉴定证实；经脂质体介导将正义真核表达载体转染SGC7901细胞，反义真核表达载体转染SGC7901/VCR细胞，G418筛选获得稳定转染细胞；RNA斑点杂交试验证实；正义稳定转染细胞RPS13mRNA水平上调，反义稳定转染细胞RPS13mRNA水平下调。结论：成功克隆了人RPS13编码基因序列，并构建了其正，反义真核表达载体，在胃癌细胞系SGC7901及长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR中得到稳定转染细胞，正义转染细胞中RPS13mRNA表达明显增加，反义转染细胞中表达明显受抑。     

P-糖蛋白、谷胱甘肽-s转移酶的表达与胃癌细胞耐药的关系研究

目的初步探索胃癌多药耐药细胞系SGC7901／VCR的耐药机制。方法间歇诱导法,胃癌细胞系SGC7901经长春新碱（VCR）短时间诱导后,对长春新碱产生耐药。MTT法检测对VCR、5-氟尿嘧啶、表阿霉索的耐药性。Western blot检测P-糖蛋白（P—glucoprotein,P—gp）、谷胱甘肽-s转移酶（ghtathione—s transferring enzyme,GST—s）的表达。结果耐药细胞SGC7901／VCR对长春新碱耐药提高16．56倍,此耐药株同时对5-氟尿嘧啶、表阿霉素呈交叉耐药,耐药指数分别达6．9、13．05。SGC7901／VCR的P—gP、GST—s出现表达增强。结论长春新碱短时间诱导后,SGC7901产生多药耐药性（multi—drug resistance,MDR）,且P—gp、GST—s表达增强。反之,抑制P—gP、GsT—s蛋白的表达,则有可能降低细胞耐药从而逆转胃癌MDR。     

Af116609基因对胃癌细胞系SGC7901/VCR耐药性的影响

目的 研究Af116609基因转染胃癌耐药细胞系SGC7901／VCR后,对胃癌细胞耐药性的影响。方法 采用RT-PCR法克隆Af116609基因,用Northern blot检测其差异表达,以基因转染技术调节其表达,通过体外药敏实验观察其对胃癌耐药表型的影响。结果 从胃癌耐药细胞SGC7901／VCR中克隆到Af116609基因的CDS序列327bp,该序列与GenBank登录的一致。Northern blot结果显示,该基因在耐药细胞高表达。体外药敏实验发现,转染正义真核表达载体的药敏细胞中该基因上调,对长春新碱、5-氟脲嘧啶和阿糖胞苷的耐药性增加,而对阿霉素的抗性有损害,对氨甲喋呤的抗性无明显影响;转染反义真核表达载体的耐药细胞中该基因下调,对上述5种药物的抗性均减弱。结论 Af116609基因与胃癌MDR表型相关,可作为逆转胃癌MDR的候选靶分子。     

lncRNA-uc003uxs在缺氧诱导胃癌侵袭转移中的作用

目的:探讨长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）-uc003uxs在缺氧诱导胃癌侵袭和转移中的作用。方法:三个胃癌细胞系SGC7901、MKN45、MKN28分别经常氧和缺氧孵育 24 h ,提取3例配对的胃癌细胞总RNA,利用高通量lncRNA芯片比较它们之间的表达谱差异,初步筛选与缺氧诱导胃癌侵袭转移相关的关键分子。RT-PCR法检测 lncRNA-uc003uxs在缺氧诱导的胃癌细胞（相对于常氧诱导的胃癌细胞）以及20对胃癌组织（相对于癌旁组织）中的表达水平。通过慢病毒转染,稳定下调SGC7901和MKN28细胞中lncRNA-uc003uxs的表达。通过Transwell迁移和侵袭实验以及裸鼠尾静脉注射内脏转移实验检测lncRNA-uc003uxs下调后对胃癌细胞侵袭和转移能力的影响。结果:高通量芯片分析结果显示:与常氧诱导的胃癌细胞相比,缺氧诱导的胃癌细胞 SGC7901、MKN45和MKN28中有84个共同上调的lncRNA分子以及70个共同下调的lncRNA分子,而多重筛选策略则提示:lncRNA-uc003uxs可能是缺氧诱导胃癌侵袭转移的关键lncRNA分子之一。RT-PCR结果表明:lncRNA-uc003uxs在缺氧诱导的胃癌细胞SGC7901、MKN45和MKN28中显著上调,其在胃癌组织中的表达水平也显著高于癌旁组织。Transwell实验结果显示:缺氧能够显著增加SGC7901和MKN28细胞的迁移和侵袭能力,而下调lncRNA-uc003uxs的表达后,两种细胞的迁移和侵袭能力明显下降。此外,裸鼠尾静脉内脏转移实验也证实lncRNA-uc003uxs的下调抑制了胃癌细胞SGC7901的体内肝肺转移能力。结论:利用高通量芯片筛选,在胃癌细胞中发现了一系列缺氧相关的lncRNA分子。临床标本分析及功能缺失试验证实:lncRNA-uc003uxs是一个缺氧诱导胃癌侵袭转移的关键lncRNA分子。     

LncRNA-AK058003在缺氧诱导胃癌侵袭转移中的作用

目的:探讨lncRNA-AK058003在缺氧诱导胃癌侵袭和转移中的作用。方法:SGC7901、MKN45、MKN28三个胃癌细胞系,分别经常氧/缺氧孵育24h后,Trizol法提取3例配对的胃癌细胞总RNA,利用高通量lncRNA芯片比较它们之间的表达谱差异。通过差异倍数、邻近编码基因信息分析、长度特征分析等策略初步筛选与缺氧诱导胃癌侵袭转移相关的关键分子。RT-PCR法检测lncRNA-AK058003在缺氧诱导的胃癌细胞中相对于常氧条件下的表达水平,进一步检测其在20例胃癌临床标本中相对于癌旁组织的表达水平。构建小干扰RNA慢病毒,稳定下调AK058003在SGC7901及MKN45中的表达。Transwell、划痕实验、裸鼠尾静脉注入不同胃癌细胞等体外和体内实验检测抑制AK058003后对常氧和缺氧条件下胃癌侵袭转移的影响。结果:高通量lncRNA 芯片比较发现:缺氧诱导的胃癌细胞SGC7901、MKN45和MKN28与常氧条件下的细胞相比,有84个分子的表达在缺氧诱导的胃癌细胞中显著上调(P<0.05),其中差异倍数在3倍以上的共有5个。多重筛选策略提示AK058003可能是缺氧诱导胃癌侵袭转移的关键lncRNA分子之一。RT-PCR结果显示: AK058003在缺氧诱导的胃癌细胞中显著上调,其分别在SGC7901缺氧16h,MKN45缺氧24h,MKN28缺氧48h时达到峰值。进一步RT-PCR结果发现,AK058003在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。缺氧条件下的Transwell实验结果显示缺氧能够显著增加SGC7901和MKN45的侵袭转移力,而抑制AK058003的表达后,胃癌细胞侵袭转移力明显下降。结论:通过高通量 lncRNA芯片比较,首次发现了一系列胃癌细胞中缺氧相关的lncRNAs 分子。通过临床标本验证以及功能缺失试验证实lnc-AK058003是系列分子中影响缺氧诱导胃癌侵袭转移的关键lncRNAs分子之一。     

siRNA下调KLF8对胃癌细胞SGC7901增殖能力的影响

目的:探讨KLF8基因特异性siRNA对胃癌细胞株SGC7901增殖能力的影响.方法:通过免疫组织化学、Western blot法、RT-PCR检测胃癌组织标本和胃癌细胞株KLF8的表达;通过基因重组方法构建KLF8的siRNA慢病毒载体,并感染人SGC7901细胞,通过Western blot验证siRNA干扰效率.通过MTT、平板克隆、流式细胞仪检测细胞增殖、细胞周期和凋亡,观察其对胃癌细胞SGC7901增殖能力的影响.结果:KLF8在胃癌组织和细胞株中的表达高于癌旁组织和正常胃上皮细胞,下调KLF8能能够明显抑制SGC7901细胞的增殖,促进细胞G0/G1期阻滞和诱导细胞凋亡.结论:KLF8在促进胃癌细胞SGC7901增殖中发挥重要作用,为胃癌靶向治疗提供理论依据.     

RPL6/Taxreb107在胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR中的差异表达及其与MDR相关性的初步研究

目的 探讨BPL6／Taxreb107在胃癌耐药细胞系SGC7901／ADR与胃癌细胞系SGC7901的差异表达,以及与胃癌多药耐药(MDR)的相关性。方法 提取SGC7901和SGC7901/ADR细胞系总RNA;采用内对照RT-PCR检测RPL6基因和Northem杂交、基因克隆与表达、真核表达载体的构建;以电穿孔法基因转染;以流式细胞仪检测瞬时转染细胞的阿霉素蓄积和潴留。结果 内对照RT-PCR和Northern杂交证实RPL6/Taxreb 107在SGC7901/ADR中高表达。将PCR产物克隆人pUCm-T载体并经测序证实。构建正义和反义真核表达载体(pcDNA3．1)并经酶切鉴定证实后,以电穿孔法将正义真核表达载体转入SGC7901,反义真核表达载体转入SGC7901／ADR。转染48h后检测转染细胞的阿霉素蓄积和潴留,结果提示RPI6／Taxreb107转入细胞后对细胞的耐药性有影响。结论 BPI6／Taxreb107在耐药胃癌细胞中高表达,对胃癌的MDR有影响。     

缺氧对胃癌细胞 BMPR -1A 表达及其侵袭和迁移能力的影响

目的：检测胃癌细胞中BMPR-1A在常氧和缺氧条件下的表达;探讨两种不同条件下BMPR-1A的不同表达对胃癌细胞侵袭和迁移的影响.方法：常氧条件下（氧气浓度20%）常规培养胃癌细胞SGC7901和MKN28;缺氧条件下（氧气浓度1%）用二氧化碳/氧气/氮气三气培养箱培养胃癌细胞SGC7901和MKN28 24小时.分别用蛋白质免疫印迹（Western blot）和实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）的方法在蛋白水平和mRNA水平测定BMPR-1A的表达,以明确BMPR-1A在常氧与缺氧两种不同条件下的差异性表达;同时以Transwell实验检测在常氧和缺氧条件下由于BMPR-1A的差异性表达对胃癌细胞SGC7901和MKN28侵袭和迁移的影响.结果：缺氧条件下刺激胃癌细胞24h后,无论是在蛋白水平还是mRNA水平,BMPR-1A表达明显下降;Transwell实验结果也显示胃癌细胞接受缺氧刺激后其侵袭和迁移能力显著增强.结论：缺氧有增加胃癌细胞侵袭和迁移的能力,该作用机制可能与缺氧导致BMPR-1A的表达下降有关.     

LncRNA-MALAT1在缺氧诱导胃癌侵袭转移中的作用

目的:探讨LncRNA-MALAT1对缺氧诱导胃癌侵袭转移的影响。方法:RT-PCR检测胃癌组织标本和胃癌细胞株中MALAT1的表达;通过基因重组方法构建MALAT1的siRNA载体,并感染人SGC7901及MKN45胃癌细胞,RT-PCR验证siRNA干扰有效;Transwell实验研究其对胃癌细胞SGC7901及MKN45侵袭转移能力的影响。结果:MALAT1在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达高于癌旁组织和胃正常上皮细胞;缺氧能够促进SGC7901及MKN45细胞的侵袭转移能力,而下调MALAT1能够明显抑制缺氧条件下SGC7901及MKN45细胞的侵袭转移能力。结论:MALAT1在促进胃癌细胞的侵袭转移中发挥重要作用,为胃癌靶向治疗提供理论依据。     

胃癌转移相关miRNA的差异表达谱及miR-218的生物学分析

目的 探讨胃癌转移相关微小RNA（miRNA）的差异表达情况并进行miR-218的生物学分析。方法 采用实时荧光定量PCR（qPCR）及miRNA芯片法检测低转移潜能的胃癌细胞亚系（SGC7901-NM、MKN28-NM）与高转移潜能的胃癌细胞亚系（SGC7901-M、MKN28-M）间miRNA的差异表达。提取不同转移潜能胃癌细胞系和10例胃癌冰冻组织及相应的转移淋巴结中的总RNA,利用qPCR检测miR-218在不同细胞及组织中的表达情况。结果 对不同转移潜能的胃癌细胞亚系进行芯片检测发现,与SGC7901-NM细胞比较,SGC7901-M 细胞有47个分子表达下调,15个分子表达上调。与MKN28-NM细胞比较,MKN28-M细胞有41个分子表达下调,83个分子表达上调。在SGC7901-M及MKN28-M细胞中,34个分子表达均出现下降,11个分子表达均出现上升。对不同转移潜能的胃癌细胞亚系以及人永生化正常胃黏膜细胞系GES进行检测可以发现,4种不同转移潜能的胃癌细胞亚系中miR-218的表达均低于正常胃黏膜细胞系GES,差异有统计学意义（P＜0.05）,且在高转移潜能胃癌细胞亚系中miR-218的表达均低于低转移潜能胃癌细胞系,差异有统计学意义（P＜0.05）。胃癌转移淋巴结中miR-218的表达水平为0.23±0.02,低于胃癌原发灶的1.09±0.05,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 胃癌转移相关miRNA会出现差异表达情况,高转移潜能胃癌细胞中的miR-218表达水平上调可能与胃癌转移存在一定关系。     

胃癌细胞株中GnT-V表达水平的检测

目的检测正常胃黏膜细胞株GES-1和胃癌细胞株GnT-V的mRNA和蛋白质的表达水平。方法体外培养胃癌细胞株BGC823、SGC7901、MKN45和正常胃黏膜细胞株GES-1,应用RT-PCR、Real-time PCR、Westem blot等技术检测胃癌细胞株及正常胃黏膜细胞GnT-V mRNA和蛋白质表达的水平。结果检测显示3株胃癌细胞（BGC823、SGC7901、MKN45）均表达CmT-V mRNA,其中BGC823、SGC7901呈高表达,MKN45则低表达GnT-V（P〈0．05）。各细胞相对正常对照组GnT-V的相对表达倍数分别为18．25,13．36,9．25。Western blot结果显示3株胃癌细胞均不同程度的GnT-V蛋白表达,而正常对照组不表达GnT-V蛋白。结论胃癌细胞不同程度表达GnT-V,各细胞中以BGC823表达量最高,SGC7901表达量居中,MKN45呈低表达,提示GnT-V可能对于胃癌的发生发展有一定的影响。     

胃癌细胞uPA表达与腹膜种植潜能的相关性研究

目的探讨不同胃癌细胞系尿激酶型血浆纤溶酶原激活因子(uPA)的表达及其与腹膜种植能力的关系。方法采用半定量RT-PCR、Western blot和ELISA方法,比较不同胃癌细胞系(AGS、SGC7901、MKN45和MKN28)uPA表达和uPA活性的差异。将胃癌细胞直接注入裸鼠腹腔,建立腹膜种植模型,通过观察裸鼠生存时间等方法,比较不同胃癌细胞系的腹膜种植潜能。结果uPA表达以SGC7901细胞最高,uPA活性以MKN45细胞最高,AGS细胞uPA表达和活性均最低。AGS未发生腹膜种植肿瘤;SGC7901和MKN45均出现大小不等的腹膜种植肿瘤;MKN28出现伴有血性腹水且大小相似的腹膜种植肿瘤;但MKN45最早形成腹膜种植肿瘤,并且该组裸鼠的生存时间最短。结论各株胃癌细胞的uPA表达在转录和翻译水平相一致,但uPA的表达量和uPA活性大小有明显差异,并且这二者与腹膜种植能力呈正相关。