重组人纤维蛋白片段对CIK 细胞增殖的影响及其可能机制研究*

目的:探讨重组人纤维蛋白片段（RetroNectin）对CIK 细胞的增殖作用及其可能机制。方法:提取患者外周血单个核细胞,Ⅰ组细胞培养于前一天用RetroNectin 和CD3mAb 包被好的培养瓶中,Ⅱ组培养于普通培养瓶中。第2 天起按照常规CIK 细胞培养方法分别培养,第14天收获。细胞计数法测定CIK 细胞增殖;LDH 法测定细胞杀伤活性;流式细胞术分析细胞表型并检测细胞周期;Annexin V/PI法检测细胞凋亡;封闭CD49d+及CD49e+后细胞计数法测定CIK 细胞增殖;流式细胞术分析细胞表型;Western blot检测Vav1 蛋白表达水平。结果:RetroNectin 对CIK 细胞增殖有明显促进作用（P<0.05）,经RetroNectin 包被后可以增加CIK 细胞中CD25+T 细胞比例（P<0.05）,对于结肠癌细胞系HCT-8 RN-CIK较CIK 显示出了更强的杀伤活性（P<0.05）,而对于白血病细胞系K562 两组细胞杀伤活性无显著性差异（P>0.05）。 RetroNectin 可以将CIK 细胞阻滞于G1 期而促进增殖,同时抵抗高活化细胞的凋亡。RetroNectin 对CIK 细胞中的CD49d+CD49e+T 细胞亚群有明显上调作用（P<0.05）。 拮抗CD49d/CD49e 后RetroNectin对CIK 细胞增殖作用消失（P>0.05）,对CD25+T 细胞的上调作用也消失。Western blot结果显示Vav1 蛋白表达与CD25+T 细胞变化相一致。结论:重组人纤维蛋白片段（RetroNectin）能够通过调控细胞周期,抵抗凋亡而促进CIK 细胞增殖,其机制可能为RetroNectin 与CIK 细胞上VLA-4 及VLA-5 两个位点结合进而通过Vav1 蛋白作为第二信号活化T 细胞。      

当归多糖对CIK细胞生物学特性及其杀伤活性的影响

目的:探讨当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide,ASP)体外对人外周血来源的细胞因子诱导的杀伤(cytokine induced killer,CIK)细胞的增殖、免疫表型及其对白血病K562细胞杀伤活性的影响。方法:分离健康志愿者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),第0天加入IFN-γ(1 000 IU/ml),24 h后再加入IL-2(1 000 IU/ml)、抗CD3单抗(50 ng/ml)继续培养,此后每隔3 d根据添加不同浓度的ASP分为5组:A组(不加ASP)、B~E组(分别加ASP 12.5、25、50、100μg/ml)。全自动血细胞计数仪计数各组CIK细胞的增值情况,流式细胞术检测各组CIK细胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞的百分比,酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组CIK细胞上清液中IFN-γ及TNF-α的分泌水平,CCK-8法检测各组CIK细胞对K562细胞的杀伤活性。结果:联合ASP诱导培养CIK细胞至第16天时,与A组相比,E组CIK细胞的增殖能力明显增加[(56.98±3.00)×106vs(43.81±2.14)×106,P<0.05)],各组细胞活率都保持在90%以上;各组CIK细胞CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞比例无明显差异,而D组、E组CD3+CD56+细胞比例与A组相比存在差异[(26.65±3.71)%、(28.36±4.28)%vs(20.75±3.56)%,P<0.05)];E组CIK细胞在效靶比为40∶1、20∶1、10∶1时对K562细胞的杀伤活性比A组更强[(84.19±5.88)%vs(68.05±5.95)%、(76.69±6.54)%vs(64.55±9.44)%、(72.32±9.22)%vs(61.45±8.22)%,均P<0.05〗。结论:随着培养时间的延长,高浓度的ASP体外对CIK细胞的增殖及杀伤活性有一定的促进作用。     

DC与CIK共培养后对白血病细胞杀伤活性的研究

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与同源树突状细胞(DC)共培养后CIK细胞的增殖活性、表型的变化,及其对K562、HL-60白血病细胞细胞毒作用的影响。方法采集健康供者的外周血单个核细胞(MNC),置于37℃,5%CO2培养箱培养2 h,收集非贴壁细胞用于诱导培养CIK细胞,贴壁细胞诱导分化出成熟DC,将成熟DC和CIK细胞按1 5的比例混合培养3天,用MTT法检测DC-CIK共培养细胞杀伤K562和HL-60白血病细胞株的活性。结果DC-CIK共培养后增殖速度明显快于单纯CIK细胞组(P<0.05);培养第14天,CIK中CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞的比率分别为58.6%±7.3和26.5%±6.2,DC-CIK的CD3+CD8+、CD3+CD56+的比率分别为72.5%±4.2和38.4%±6.1,表达差异显著(P<0.05);在2.5∶1~20∶1的效靶比范围内,DC-CIK对K562、HL-60细胞的杀伤活性较单纯CIK细胞组的杀伤活性要高(P<0.05)。结论DC与CIK共培养细胞是增殖活性和细胞毒活性均高于CIK细胞的免疫活性细胞。     

不同冻存时间对CIK细胞免疫表型及杀伤活性的影响

目的:探讨不同冻存时间对外周血来源的CIK细胞免疫表型及其杀伤活性的影响。方法:采集6名健康患者外周血,分离外周血单个核细胞培养,第0h加入IFN-γ,24h后加入IL-2、抗CD3单抗,每隔3天补充含CD3单抗、IL-2的新鲜培养液,培养15天进行冻存。复苏冻存1、2、3、4、5月的CIK细胞为实验组,以常规培养至15天的CIK细胞为对照组。利用流式细胞仪检测各组CIK细胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞的百分比,CCK8法检测各组CIK细胞对K562细胞的杀伤活性。结果:冻存1、2、3月的CIK细胞与对照相比CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞比例无明显差异（P＞0.05）,冻存4、5月的CIK细胞中CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞比例较对照组明显下降［（70.62±6.35）%、（14.36±4.28）%、（67.87±5.63）%、（12.61±6.21）% vs （84.23±5.20）%、（22.75±3.46）%］,P＜0.05。对靶细胞的杀伤能力在1、2、3月时与对照相比未见明显减弱（P＞0.05）,冻存4月、5月后的CIK细胞在各效靶比对K562细胞的杀伤活性与对照相比明显减弱（P＜0.05）。结论:冻存时间的长短对CIK细胞的免疫表型及杀伤活性均有一定的影响,且随着冻存时间的延长,CIK细胞的杀伤活性减弱。建议冻存CIK细胞的最佳时间为1、2和3月。     

来源于未缓解白血病患者的DC-CIK细胞对白血病细胞的杀伤活性

目的：体外诱导培养缓解期及未缓解期急性白血病患者来源的树突状细胞（dendritic cell, DC)联合细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer, CIK)细胞,比较两者的增殖能力、免疫表型及对白血病细胞的杀伤活性。方法: 提取2013年4月25日至2014年1月17日河北医科大学第二医院血液科收治的复发难治未缓解期白血病患者（7例）和缓解期患者（7例）的外周血单个核细胞,分别按常规方法诱导产生DC-CIK细胞,在培养过程中检测细胞增殖倍数,流式细胞术检测CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞比例,细胞涂片法和流式细胞术检测培养前后CD34+白血病细胞比例,CCK-8法检测两组DC-CIK细胞对K562细胞及患者单个核细胞的杀伤活性。结果: 缓解组和未缓解组来源的DC-CIK细胞均以相似的速度快速增殖,CD3+CD8+和CD3+CD56+细胞比例均随培养时间延长显著升高（ P <0.05）,但两组间差异没有统计学意义（ P >0.05）。培养第15天时,非缓解组DC-CIK细胞涂片检测未见CD34+原始白血病细胞,流式细胞术检测显示CD34+细胞比例较培养前显著降低\[（0.1±0.05）% vs (8.3±3.1)%, P <0.05\]。效靶比在5 ∶1~20 ∶1范围内时,缓解组与未缓解组DC-CIK细胞对K562细胞的杀伤率差异没有统计学意义（ P >0.05）,但未缓解组DC-CIK对患者单个核细胞的杀伤率显著高于缓解组（ P <0.05）,并且显著高于未缓解组对K562细胞的杀伤率（ P <0.05）。结论:未缓解期白血病患者来源的DC-CIK细胞在增殖活性、CD3+CD8+和CD3+CD56+表达水平和对K562细胞的非特异性杀伤活性方面与缓解期患者来源的DC-CIK细胞均相似,但对患者单个核细胞的杀伤具有更强的特异性。     

CEA-rV负荷DC诱导CIK对CEA+肿瘤细胞的杀伤研究

  目的 用CEA-rV负荷脐血来源树突状细胞（DC）后，再诱导CEA抗原特异的细胞因子诱导的杀伤细胞，研究其对CEA阳性肿瘤细胞株杀伤活性的作用。方法 用淋巴细胞分离液分离脐带血单核细胞，分别诱导DC、CIK细胞及CEA-rV负载DC后，再与CIK细胞混合培养诱导CEA特异的细胞毒性T淋巴细胞。分别用以上不同类型细胞杀伤CEA+和CEA-的肿瘤细胞株。结果 CEA-rV诱导的特异性CIK对CEA阳性肿瘤细胞的杀伤活性，Lovo为58.2 %、A549为62.4 %，较之DC-CIK组对CEA阳性肿瘤细胞Lovo为44.8 % 、A549为50.2 %，具有更高的杀伤活性，差异有统计学意义（P＜0.05）。CEA-rV诱导的特异性CIK对CEA阴性肿瘤细胞的杀伤活性K562为79.7 %、Bel7402为70.1 %，DC-CIK组对CEA阴性肿瘤细胞K562为78.7 %、Bel7402为67.8 % ，两组间无明显区别，差异无统计学意义（P＞0.05）。用CEA-rV诱导的特异性CIK对CEA阳性肿瘤细胞Lovo杀伤提高了89.4 %，A549提高了83.1 %；而对于CEA阴性肿瘤细胞K562杀伤提高了32.5 %，Bel7402提高了21.7 %，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 负载CEA-rV基因重组痘苗的DCs（CEA-rV-DCs）诱导的细胞毒性T淋巴细胞（CEA-rV-DCs-CIK）对CEA阳性肿瘤细胞有特异性杀伤能力。     

WAVE生物反应器应用于CIK细胞培养

目的:探讨利用波浪(WAVE)生物反应器培养扩增肿瘤患者CIK细胞的效能及其对肿瘤细胞的杀伤活性.方法:分离8例肿瘤患者外周血单个核细胞,分别采用CIK细胞传统扩增技术(CIK组)和WAVE反应器培养方案(WAVE组),应用锥虫蓝染色并进行细胞计数,利用流式细胞术比较两组CIK细胞的扩增效率、活化情况及其亚群的组成变化,并以K562细胞为靶细胞检测扩增后CIK细胞的杀伤活性.结果:WAVE组细胞增殖数较CIK组明显提高(P＜0.05或P＜0.01);在第14天,WAVE组CD3+ CD8+、CD3+ CD56+细胞亚群比例明显高于CIK组[(78.56±2.99)％vs(74.54±3.02)％,(48.33±7.01)％ vs(40.69±6.43)％,均P＜0.05],而Treg细胞比例显著降低(P＜0.05);当效靶比为10∶1、20∶1时WAVE组扩增的CIK细胞对K562的杀伤率明显高于CIK组(P＜0.05或P＜0.01),CIK细胞中CD3+ CD8+ CD107a+的比例明显升高[(29.43±4.97)％ vs(25.19±4.91)％,P＜0.05].结论:WAVE生物反应器扩增培养体系获得的CIK细胞数量多、纯度高,其中CD3+ CD8+和CD3+ CD56+ NKT细胞比例较高,其对K562肿瘤细胞的杀伤效果明显高于传统培养技术获得的CIK细胞.     

脐血和合并乙型肝炎病毒感染肝癌患者来源CIK细胞的增殖及杀伤活性

目的：观察脐血和乙型肝炎病毒感染肝癌患者外周血诱导的CIK细胞的体外增殖能力及杀伤活性的特点。方法： 分别采集解放军第105医院妇产科住院的健康产妇剖宫产胎儿的脐带血5份（A组）、感染科住院的合并乙型肝炎病毒感染的原发性肝癌患者自体外周血15份（B组）、无乙型肝炎病毒感染的原发性肝癌患者自体外周血5份（C组）,采用Ficoll两步分离法分离出单个核细胞,细胞因子诱导培养成细胞因子诱导的杀伤(ClK)细胞,流式细胞仪检测CIK细胞的免疫表型CD3＼CD8＼CD16＼CD56,MIT法测定其对白血病K562细胞的杀伤活性。结果：体外培养15 d时, C组CIK细胞体外增殖倍数与A组相似\[（577.24±202.4）vs（600.93±249.1）倍, P >0.05\],该两组均显著高于B组\[（385.16±117.3）倍, P <0.05\];A组CIK细胞杀伤活性显著高于B组和C组\[（77.3±5.1）% vs （44.1±3.4）%、（54.5±3.7）%, P <0.01\]。结论： 脐血来源的CIK细胞体外增殖快、杀伤活性强;合并有乙型肝炎病毒感染的肝癌患者CIK细胞体外增殖能力和杀伤能力明显降低,不宜接受自体CIK细胞移植。     

α-半乳糖神经酰胺负载DC促进CIK细胞对肝癌细胞的杀伤效应

目的:研究负载α-半乳糖神经酰胺(alpha-galactosylceramide,α-GalCer)的DC功能与成熟度的改变情况,探讨α-GalCer-DC与CIK共培养对CIK细胞表型、增殖活性及杀伤肝癌细胞效率的影响.方法:采用密度梯度离心法从人外周血中分离出单个核细胞,悬浮细胞诱导培养CIK细胞,贴壁细胞诱导培养DC;流式细胞仪检测α-GalCer负载DC的表型,Real-time PCR检测DC相关基因的mRNA表达改变.将α-GalCer-DC与CIK细胞共培养,流式细胞仪检测DC与CIK细胞表面标志物;锥虫蓝染色法检测CIK细胞的增殖倍数;Real-time PCR检测CIK细胞功能相关基因的表达情况;CCK-8试剂盒检测α-GalCer-DC对CIK杀伤HepG2细胞的影响.结果:经过多种细胞因子诱导,可获得CIK细胞和成熟的DC;α-GalCer负载可促进DC成熟,DC表面标志物CD80、CD86、CD83和CD11c的阳性率均升高(P＜0.05或P＜0.01),表面趋化因子受体CCR-7、IL-12、IL-10的mRNA水平升高(P＜0.05).α-GalCer-DC与CIK共培养,可显著提高CIK细胞CD3+ CD56+的表达和增殖活性(P＜0.05或P＜0.01),并显著提高INF-γ、IL-12、穿孔素和颗粒酶素B的mRNA表达水平(P＜0.05或P＜0.01);CIK、DC-CIK、α-GalCer-DC-CIK细胞对HepG2细胞的杀伤作用随效靶比的升高而增强,在同一效靶比时α-GalCer-DC-CIK细胞对靶细胞的杀伤作用最强(P＜0.05).结论:α-GalCer负载可促进DC成熟,α-GalCer-DC与CIK共培养能促进后者增殖和成熟,能显著增强其对肝癌细胞的杀伤活性,为DC-CIK在肿瘤免疫治疗中的应用提供了实验依据.     

脐血和不同肝癌患者CIK细胞体外增殖及杀伤活性的对照观察

【】目的 观察脐血和不同肝癌患者CIK细胞的体外增殖能力及杀伤活性的特点。方法 分别采集健康胎儿的脐带血5份(A组),接受CIK细胞治疗的合并慢性乙型肝炎的原发性肝癌患者12例(B组)和无慢性乙型肝炎的原发性肝癌患者8例(C组)。采用Ficoll两步分离法分离出单个核细胞,细胞因子诱导培养成细胞因子诱导的杀伤细胞(ClK)。流式细胞仪检测CIK细胞的免疫表型,MIT法测定其对白血病K562细胞的杀伤活性。结果 无慢性乙型肝炎的肝癌患者(C组)体外CIK细胞增殖速度与脐血相似(P > 0.05),大于B组(P<0．05)；脐血来源的CIK细胞杀伤活性均优于其他两组,差异有显著性(P<0．01)。结论 脐血来源的CIK细胞体外增殖快,杀伤活性强；合并有慢性乙型肝炎的肝癌患者CIK细胞体外增殖能力明显降低,不宜接受自体CIK细胞移植。     

健康人和肝癌患者CIK体外增殖能力及对原代肝癌细胞抗肿瘤作用的比较研究

目的探讨源自健康人和肿瘤患者的细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)体外增殖能力及对原代肝癌细胞的抗肿瘤作用的差异,进一步了解CIK的抗肿瘤作用.方法分离健康人和肝癌患者外周血单个核细胞经细胞因子激活诱导培养为CIK,流式细胞分析检测CIK免疫表型;用机械研磨法将新鲜肝癌组织标本分离成单细胞悬液;四甲基偶氮唑盐法榆测两种CI...     

IL-15上调NKG2D表达对CIK细胞杀伤活性的增强效应

目的观察IL-15对细胞因子诱导的杀伤细胞( Cytokine-induced killer cells,CIK)NKG2D受体表达及其对食管癌EC9706细胞杀伤活性的影响。方法体外分离外周血单个核细胞,分为两组。对照组：干扰素-γ、白细胞介素-2、CD3单抗诱导培养CIK细胞。IL-15组：加用IL-15培养。流式细胞仪检测细胞免疫表型及CD3+细胞、CD56+细胞表面NKG2D的表达,LDH法测定第14天细胞在效靶比20∶1、30∶1时对EC9706细胞的杀伤活性;效靶比30∶1时,观察NKG2D单抗封闭细胞表面NKG2D分子后对两组细胞杀伤活性的影响。结果随着培养时间的延长,CIK群体细胞及CD56+细胞表面NKG2D表达逐渐增强,IL-15组与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);效靶比20∶1、30∶1时,IL-15组细胞对EC9706细胞的杀伤活性均较对照组明显增强,差异均有统计学意义(P＜0.05);效靶比30∶1时NKG2D单抗封闭CIK细胞表面NKG2D分子后,对照组细胞、IL-15组细胞对EC9706细胞的杀伤活性均较阻断前明显下降,差异均有统计学意义 (P＜0.05)。结论IL-15上调CIK细胞表面NKG2D分子表达,增强CIK细胞对EC9706细胞的杀伤活性,CIK细胞通过NKG2D发挥作用。     

多种细胞因子诱导的杀伤细胞体外扩增及对骨肉瘤细胞杀伤活性的研究

目的探讨不同人群来源的多种细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine—induced killer cells,CIK）细胞增殖及细胞毒活性的作用,为CIK细胞在骨肉瘤中的过继免疫治疗提供实验依据。方法通过向健康人及骨肉瘤患者各10名男性的外周血单核细胞（PBMC）中加入IL-2、IFN-γ、IL-1及抗CD3McAb,诱导出CIK细胞,用光镜、倒置显微镜观察细胞形态,细胞记数板法计数细胞,四甲基偶氮哇盐（MAW）法检测收获细胞对相应骨肉瘤细胞的细胞毒作用。结果二组均能成功诱导出CIK细胞,其中健康人组体外增殖能力、细胞毒作用均优于骨肉瘤患者组,各组CIK细胞随效靶浓度比的递增其杀瘤活性相应增加（P〈0．05）,二组CIK细胞对骨肉瘤细胞48h杀伤率明显高于24h（P〈0．05）。结论CIK细胞的体外增殖力及对骨肉瘤细胞的杀伤活性与机体状态有关,CIK细胞对骨肉瘤细胞杀伤活性存在量效及时效关系。     

健康人和肿瘤患者CIK细胞的生物学特性比较

目的比较健康人和肿瘤患者外周血来源的CIK细胞的体外扩增速度、细胞表型和杀伤活性;观察健康人CIK细胞对裸鼠体内移植瘤的预防和治疗作用。方法常规无菌采集健康人和肿瘤患者外周血单核细胞各10份,定向诱导成CIK细胞,然后直接活细胞计数法比较两者的扩增速度;流式细胞仪检测比较两者细胞表型;MTT法比较两者对K562和LOVO细胞株的杀伤活性。取30只裸鼠分为3个组,预防组：裸鼠先尾静脉注射CIK细胞,连续5天,第6天背部皮下接种A549细胞。治疗组：裸鼠于第一天接种A549细胞,次日,分为3组,第一组局部（接种A549部位）注射CIK细胞;第二组尾静脉注射CIK细胞;第三组局部（接种A549部位）及尾静脉均注射CIK细胞,均连续治疗5天。对照组：裸鼠,第一天背部皮下接种A549细胞,第二天开始在尾静脉注射生理盐水,连续5天。四周后处死全部裸鼠,测量肿瘤大小,称重,计算肿瘤体积,抑瘤率,并做病理检查。结果健康人CIK细胞的扩增速度显著高于肿瘤患者CIK细胞（P〈0．05）;流式细胞仪检测显示健康人CIK细胞CD3^＋CD8^＋、CD3^＋CD56^＋细胞百分比显著高于患者CIK细胞（P〈0．05）;健康人CIK细胞对K562,LOVO的杀伤活性强于患者CIK细胞（P〈0．05）。对照组各裸鼠背部皮下移植瘤出现较早,并且以相近速率快速生长,体积较大;CIK细胞预防组及治疗组中局部注射组和尾静脉注射组的移植瘤出现较晚,生长较慢,体积较小,联合治疗组治疗效果更佳（P〈0．05）。结论体外实验中,健康人CIK细胞体外扩增快,CD3^＋CD8^＋、CD3^＋CD56^＋细胞比例高,对肿瘤细胞的杀伤活性强于肿瘤患者CIK细胞。动物实验中,健康人CIK细胞对裸鼠移植瘤有预防和治疗作用。     

体外扩增CIK细胞杀伤胃癌细胞SGC-7901

目的：观察CIK细胞增殖情况,了解扩增后的最佳应用时机,并观察体外对SGC-7901的杀伤作用。方法：健康人外周血单核细胞（PBMC）在体外条件下经过多种细胞因子的共同刺激诱导成CIK细胞,计数培养不同时间的CIK细胞,用流式细胞术检测CIK细胞的表型特征。用MTT法检测杀伤活性,对比CIK细胞与5-FU对SGC-7901的杀伤作用,并观察了两者联合应用的效果。结果：CIK细胞随体外培养时间的延长,数量及杀伤活性均增加。体外培养20d增殖124倍,CD3^＋、CD56^＋双阳性细胞的比例达66．1％,其后两者数量增长缓慢;体外实验显示CIK细胞对胃癌SGC-7901细胞株有明显的杀伤作用,最高杀伤效率为73．13％,其杀伤作用优于5-FU,P〈0．05。二者联合应用杀伤作用降低。结论：CIK细胞具有较强的抗胃癌细胞活性;体外培养15～20d时应用较为合适;联合应用时5-FU可降低CIK细胞的杀伤效率。     

miR-15b通过下调细胞因子诱导的杀伤细胞PD-1表达抑制宫颈癌细胞增殖

目的:探讨微小RNA-15b（miR-15b）与程序性死亡蛋白-1（PD-1）在细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）抑制宫颈癌细胞增殖过程中的调控作用,并初步分析其中miR-15b与PD-1的可能作用机制。方法:采用传统方法培养CIK细胞,采用流式细胞仪检测CIK细胞免疫表型,CCK-8法检测CIK细胞对宫颈癌细胞（SiHa）增殖的影响。实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)及蛋白印迹（WB）法检测CIK细胞共培养前后SiHa细胞中miR-15b及PD-1表达水平。实验将CIK细胞共培养SiHa细胞分为3组:空白对照组（未进行任何处理）,NC组（加入miR-15b阴性对照质粒）,si-miR-15b组（加入miR-15b siRNA）。采用qRT-PCR与WB分别检测各组miR-15b及PD-1表达水平;CCK-8法检测各组SiHa细胞增殖情况。采用WB法检测细胞增殖相关蛋白增殖细胞核抗原（PCNA）及Ki67表达。结果:CIK细胞共培养组SiHa细胞增殖抑制率显著高于单纯培养SiHa细胞组（P＜0.05）;CIK细胞共培养后SiHa细胞中miR-15b表达水平显著高于单纯培养SiHa细胞组（P＜0.05）,而PD-1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）;si-miR-15b组miR-15b表达水平、SiHa细胞增殖抑制率均显著低于空白对照组、NC组（P＜0.05）,而PD-1、PCNA、Ki67蛋白表达均显著升高（P＜0.05）。结论:miR-15b可能通过下调CIK细胞上PD-1表达进而抑制宫颈癌细胞增殖。     

DC与CIK共培养对骨肉瘤细胞的杀伤作用

目的 探讨树突状细胞(dendritic cells,DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK)共培养对人骨肉瘤细胞的杀伤效应.方法 从健康志愿者中分离外周血单个核细胞,制备DC和CIK,并以5:1比例混合培养.采用CCK-8法和流式细胞术检测DC-CIK共培养...     

CIK细胞联合贝伐单抗对肝癌HepG2细胞的体内外抗瘤活性

目的:探讨细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞联合贝伐单抗(bevacizuma)对肝癌HepG2细胞的体内外抗肿瘤活性及其作用机制.方法:提取健康供血者外周血的单个核细胞(PBMC),加入多种细胞因子促进CIK细胞成熟,在流式细胞仪上进行CIK细胞的免疫表型分析.CIK细胞与贝伐单抗单独或联合作用于HepG2细胞后,利用CCK-8测定其对HepG2细胞体外增殖活性的影响;利用侵袭小室(Transwell)和划痕实验测定其对HepG2细胞侵袭迁移活性的影响;Western blotting检测HepG2细胞Akt和Erk信号通路相关蛋白磷酸化的变化.建立HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤模型,并随机分为生理盐水组、CIK组、贝伐单抗组及CIK细胞联合贝伐单抗组,给药28 d后处死裸鼠,剥取瘤体,免疫组化法检测瘤组织CD31及Ki67蛋白的表达.结果:提取健康人PBMC诱导14 d后,CIK细胞表型分析显示CD3+ CD56+细胞扩增达(36.33±2.58)％.与单独治疗组比较,联合组对HepG2细胞的抗肿瘤增殖活性显著增强(P ＜0.05);CIK细胞和贝伐单抗两药联合比单独给药组对HepG2细胞的侵袭[(75.6 ±9.53) vs (304.8 ±45.73)、(359.8 ±38.10)个,P＜0.01]和迁移[(29.35±8.14)％vs (55.07±6.27)％、(60.50±9.73)％,P＜0.05]能力的抑制更强;CIK细胞和贝伐单抗两药单独及联合都能抑制Akt和Erk的磷酸化;CIK联合贝伐单抗组可显著抑制移植瘤生长以及移植瘤组织平均血管密度和Ki67表达,与单独治疗及对照组细胞比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:CIK联合贝伐单抗在体内外对HepG2细胞增殖、侵袭、迁移均有抑制作用,且优于单独治疗组.