Gli-1信号通路对TGF-β1诱导的人胃癌细胞上皮间质转化和侵袭的影响

目的:探讨核转录因子神经胶质瘤关联癌基因同源物1（glioma associated oncogene homolog 1,Gli-1）对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的人胃癌SGC-7901细胞发生上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用机制。方法:体外采用10 ng/ml TGF-β1对胃癌SGC-7901细胞进行处理,使用倒置显微镜观察细胞形态变化,RT-PCR和Western blot检测EMT上皮表型蛋白E-cadherin和间质表型蛋白Vimentin的表达水平;Transwell细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力变化,检测TGF-β1 对SGC-7901细胞发生EMT 的影响;同时采用RT-PCR和Western blot检测Gli-1的mRNA和蛋白表达水平。随后进一步采用Gli-1基因特异性阻断剂GANT 61阻断Gli-1表达,并使用TGF-β1（10 ng/ml）对SGC-7901细胞进行处理,RT-PCR 和Western blot检测Gli-1、E-cadherin和Vimentin mRNA 及其蛋白表达水平的改变,并使用Transwell细胞侵袭实验检测阻断Gli-1对SGC-7901细胞侵袭能力的影响。结果:TGF-β1可以诱导人胃癌SGC-7901细胞发生上皮间质转化并促进细胞侵袭。TGF-β1可以在mRNA和蛋白水平下调上皮表型蛋白E-cadherin的表达、提高Gli-1和间质表型蛋白Vimentin的表达。TGF-β1可以明显提高SGC-7901细胞侵袭,而阻断Gli-1后可以抑制TGF-β1诱导的人胃癌SGC-7901细胞上皮间质转化和细胞侵袭。结论:胃癌SGC-7901细胞中Gli-1 可能参与TGF-β1 介导的EMT 的发生,Gli-1 可能作为胃癌基因治疗中的有效靶点发挥作用。     

川陈皮素抑制胃癌SGC-7901细胞侵袭能力的机制探讨

目的:观察川陈皮素（nobiletin,Nob）对胃癌SGC-7901细胞侵袭能力的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:不同浓度的川陈皮素（0、30、60、120 mg/L）体外处理SGC-7901细胞。CCK8法检测细胞增殖能力;Transwell小室法检测细胞侵袭能力的改变;免疫印迹法检测细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT)标志物（E-cadherin、Vimentin、Fibronectin）蛋白、MMP-9、STAT3、p-STAT3蛋白表达的改变。结果:CCK8和Transwell小室法检测结果显示,与对照组（0 mg/L）比较,川陈皮素可显著抑制SGC-7901细胞的增殖和侵袭能力;免疫印迹结果显示,随着川陈皮素浓度的增加,SGC-7901细胞E-cadherin蛋白表达逐渐上调,同时Vimentin、Fibronectin蛋白的表达量降低,MMP-9蛋白表达下调,STAT3总量未发生变化,但p-STAT3表达逐渐降低。结论:川陈皮素可降低胃癌SGC-7901细胞侵袭能力,其机制可能为通过抑制STAT3通路,继而抑制EMT。     

环氧合酶-2对人SGC-7901胃癌细胞E-cadherin的表达及迁移能力的影响

目的 研究环氧合酶-2（COX-2）通过调控E-钙黏素（E-cadherin）对胃癌细胞侵袭迁移能力的影响。方法 分别应用塞来昔布（Celecoxib）及前列腺素E2(PGE2)对体外培养的人胃癌细胞SGC-7901进行干预,采用实时荧光定量反转录PCR检测COX-2、E-cadherin mRNA的表达;运用免疫荧光标记法结合激光共聚焦荧光显微镜分析E-cadherin的蛋白表达量;应用Transwell法检测细胞迁移能力的变化。结果 实时荧光定量反转录PCR检测塞来昔布明显抑制体外培养人胃癌细胞SGC-7901中COX-2 mRNA的表达（P＜0.01）,而E-cadherin mRNA的表达随着COX-2的表达下降而呈浓度与时间依赖性升高（P＜0.01）;运用PGE2干预后E-cadherin mRNA表达呈浓度与时间依赖性下降（P＜0.05或P＜0.01）。塞来昔布30 μmol/L干预人胃癌细胞SGC-7901 24、36、48 h后,激光共聚焦荧光显微镜检测E-cadherin的蛋白表达量明显升高（P＜0.05）;PGE2 1 μmol/L干预24、48 h后,E-cadherin蛋白表达量明显下降（P＜0.05）。塞来昔布组穿过Transwell小室的细胞数明显少于对照组（P＜0.01）,PGE2组穿过Transwell小室的细胞数明显高于对照组（P＜0.05）。结论 COX-2特异性抑制塞来昔布通过抑制COX-2的表达,上调E-cadherin表达量,抑制体外培养人胃癌细胞SGC-7901的迁移能力;外源性PGE2能够下调SGC-7901胃癌细胞E-cadherin表达量从而促进肿瘤细胞的迁移能力。     

Snail在TGF-β1诱导胃癌细胞MGC-803上皮间质转化中的作用

目的 探讨Snail在TGF-β1诱导人胃癌细胞MGC-803上皮细胞向间质细胞转化过程中的表达及其作用。方法 TGF-β1处理人胃癌细胞MGC-803不同时间(0 h,3 h,6 h,24 h,48 h,72 h),倒置显微镜观察细胞形态的变化,Western blot方法检测Snail蛋白及E-cadherin,Vimentin蛋白的表达情况,Transwell实验检测细胞侵袭能力的变化。结果 (1)随着TGF-β1作用时间的延长,MGC-803细胞形态发生变化,伪足不同程度的增多;(2)在外源性TGF-β1作用下,胃癌细胞MGC-803均不同程度地表达Snail和E-cadherin,Snail从0 h到6 h表达量增强,到6 h时达到最高。E-cadherin蛋白从0 h到6 h表达逐渐增高,6 h时最高,后续变化不明显。Vimentin蛋白6 h表达量最低,此后逐渐升高,72 h时表达量最高;(3)Transwell小室实验显示6 h时,细胞开始穿过ECM膜,随着时间的延长,穿过的细胞逐渐增多,72 h最多。结论 在TGF-β1诱导人胃癌细胞MGC-803细胞EMT的过程中,Snail蛋白起到重要作用,启动Vimentin转录表达。     

miR-138-5p通过靶向TCF3实现对胃癌细胞SGC-7901侵袭和迁移的调控

目的:探讨miR-138-5p 与T细胞因子3 基因（T cell factor 3, TCF3）的靶向关系及其对人胃癌细胞SGC-7901 侵袭和迁移能力的影响。方法：miR-138-5p 模拟物转染SGC-7901 细胞后,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miR-138-5p 和TCF3 mRNA的相对表达;生物信息学方法预测miR-138-5p 与TCF3 基因的靶向匹配关系,采用荧光素酶报告基因系统鉴定该关系。miR-138-5p 转染正常胃癌细胞和TCF3 高表达胃癌细胞后,Western blotting 检测TCF3、神经钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、锌指转录因子（Slug）和上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）的表达,Transwell 小室检测胃癌细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力。结果：miR-138-5p 过表达抑制TCF3 mRNA的表达;生物信息学软件预测显示miR-138-5p 与TCF3 mRNA有靶向结合区域,miR-138-5p mimic 降低TCF3 野生型质粒的荧光素酶活性,不影响TCF3 突变型质粒的荧光素酶活性。miR-138-5p 抑制TCF3 蛋白表达,miR-138-5p 减弱TCF3 过表达对SGC-7901 细胞侵袭和迁移能力的促进作用,同时其下调N-cadherin、Vimentin 和Slug 蛋白表达、上调E-cadherin 蛋白表达。结论：miR-138-5p 抑制胃癌细胞SGC-7901 的侵袭和迁移,与直接靶向调控TCF3 的表达有关。     

雷公藤内酯醇对胃癌细胞增殖、凋亡及上皮间质转化的影响

目的 探讨雷公藤内酯醇（TPL）对人胃癌细胞SGC-7901增殖、凋亡及上皮间质转化（EMT）的影响。方法 常规培养SGC-7901细胞达对数生长后,采用终浓度为12.5、25、50、100 nmol／L TPL处理SGC-7901细胞,应用四甲基偶氮唑盐比色法测定对照组及不同浓度TPL处理24、48、72和96 h的细胞增殖情况,采用流式细胞术检测不同浓度TPL处理48 h的凋亡率和细胞周期分布情况,实时荧光定量聚合酶链反应检测不同浓度TPL处理48 h的促EMT转录因子Snail1、Twist的表达情况,Western blotting检测各组处理48 h后的EMT相关标记分子（E-cadherin、N-cadherin及Vimentin）水平。结果TPL在12.5～100 nmol／L的范围内对SGC-7901细胞有增殖抑制作用,且增殖抑制率呈剂量和时间依赖性,且除24 h 12 5 nmol／L外,其余浓度及作用时间的增殖抑制率均高于对照组（P＜0.05）;与对照组相比,TPL处理48 h后的早晚期凋亡率升高、G0／G1期细胞比例及E-cadherin水平均升高,S期细胞比例、N-cadherin和Vimentin蛋白水平及Snail1和Twist mRNA水平均降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）,且呈浓度依赖性。结论TPL对胃癌细胞SGC-7901有毒性作用,不仅抑制其增殖且诱导凋亡及细胞周期G0／G1期阻滞,同时可抑制其EMT过程。     

去泛素化酶USP33对胃癌上皮细胞-间质转化的影响及对癌细胞迁移、侵袭的作用

摘 要：［目的］ 观察去泛素化酶USP33对胃癌上皮细胞-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）及细胞迁移侵袭能力的影响,并探究其作用机制。［方法］ qRT-PCR法检测胃癌上皮细胞MGC-803、SGC-7901和人胃黏膜上皮细胞GES-1中去泛素化酶USP33的表达。MGC-803和SGC-7901细胞转染USP33-siRNA沉默USP33基因表达,qRT-PCR检测沉默效率,使用转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）信号通路抑制剂SB431542处理沉默USP33后的MGC-803和SGC-7901细胞,MTT法检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,Western blot法检测细胞E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、TGF-β、Smad2和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）的表达水平。［结果］ qRT-PCR检测结果显示,与GES-1细胞比较,MGC-803、SGC-7901细胞中USP33表达水平显著性降低。MTT实验、划痕实验和Transwell实验检测结果显示,USP33基因敲低后,MGC-803、SGC-7901细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著性提高。Western blot检测结果显示,沉默USP33可使MGC-803和SGC-7901细胞E-cadherin表达降低,N-cadherin、Vimentin、TGF-β、Smad2和α-SMA表达升高,而TGF-β抑制剂SB431542则逆转了这一现象,上述指标差异均有统计学意义（P＜0.05）。［结论］ USP33能够抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭及EMT转化,沉默USP33可增加其增殖、迁移和侵袭能力并促进EMT转化过程,其作用机制与抑制TGF-β信号通路的活化有关。     

肺癌上皮间质转化后引发Nrf2介导的多药耐药的研究

目的 探讨肺癌中上皮间质转化通过Nrf2通路导致多药耐药的可能性。方法 TGF-β1诱导肺腺癌细胞发生上皮间质转化, Western blot法检测癌细胞发生上皮间质转化的标志分子和细胞核内Nrf2的表达变化;比色法测定GSH含量及GST活力的变化;MTT实验检测癌细胞发生上皮间质转化前后对顺铂耐药指数的变化。结果 TGF-β1使癌细胞发生了上皮间质转化：细胞失去极性,上皮标志分子E-cadherin表达下降,而间质标志分子Vimentin和Snail表达上升;细胞发生上皮间质转化后细胞核内Nrf2表达显著增加,GSH含量增高及GST活力增强,癌细胞对顺铂的耐药指数是原来的7.7倍。结论 肺癌上皮间质转化后可能通过Nrf2通路介导了癌细胞的多药耐药。     

肿瘤坏死因子-β1通过诱导上皮-间质转化促进人膀胱癌T24细胞株的侵袭

目的:体外实验研究TGF-β1诱导人膀胱癌细胞T24发生上皮-间质转化（EMT）的作用及其机制。方法:以人膀胱癌细胞T24作为研究对象,使用不同浓度TGF-β1干预24 h,光镜下观察T24细胞形态学变化;分别采用Real time-PCR（RT-PCR）和Western blot 法检测细胞中上皮表型蛋白E-cadherin和间质表型蛋白Vimentin mRNA 和总蛋白的表达。Transwell小室实验检测细胞的侵袭与迁移潜能。结果:TGF-β1可激活T24细胞的EMT程序,并上调Vimentin mRNA 和蛋白的表达水平和下调E-cadherin mRNA 和蛋白的表达水平。此外,TGF-β1可促进T24细胞体外侵袭潜能,而TGF-β1拮抗剂LY2109761可阻断这一过程。结论:EMT过程的激活参与了TGF-β1介导的人膀胱癌T24细胞的侵袭。     

沉默PD-L1基因表达抑制胃癌细胞黏附、迁移、侵袭及上皮间质转化

目的:初步探讨程序性死亡受体配体（programmed death-ligand 1,PD-L1）对胃癌细胞SGC7901侵袭、迁移的影响及PD-L1表达对上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响。方法:采用siRNA干扰技术,下调SGC7901细胞株中PD-L1的表达,采用RT-PCR法及Western blot法验证PD-L1的沉默,并将后续实验分为空白对照组、空载体组（siRNA-NC组）及PD-L1沉默组（siRNA-PD-L1组）。采用RT-PCR法及Western blot法分别对各组细胞EMT相关指标（E-cadherin、Vimentin、Snail）的mRNA和蛋白表达情况进行检测。利用MTT实验比较各组细胞的黏附能力,Transwell小室实验比较各组细胞的迁移能力及侵袭能力。结果:下调PD-L1表达后,siRNA-PD-L1组Vimentin及Snail 两项指标的mRNA和蛋白表达量,细胞的黏附能力、迁移能力及侵袭能力均低于空白对照组和siRNA-NC组,E-cadherin mRNA和蛋白表达量高于其他两组,差异均具有统计学意义（P＜0.001）,而空白对照组和siRNA-NC组之间上述指标的差异无统计学意义。结论:PD-L1的表达影响胃癌细胞黏附、迁移、侵袭等生物学行为,促进胃癌细胞的上皮间质转化,与胃癌的预后可能存在相关性。     

蒿甲醚对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用研究

目的:研究蒿甲醚对胃癌细胞（AGS和SGC-7901）的增殖、侵袭以及迁移的影响并探讨其分子机制。方法:分别利用MTT、集落形成试验检测胃癌细胞的活力和生长;流式细胞技术检测胃癌细胞的凋亡率;利用细胞侵袭和划痕愈合试验检测胃癌细胞的侵袭和迁移;Western blot检测相关蛋白的表达水平。结果:蒿甲醚（0~800 μmol/L）能够浓度和时间依赖性的抑制 AGS和SGC-7901细胞的增殖（P＜0.05）。集落形成试验以及流式细胞术结果显示蒿甲醚（400 和 600 μmol/L）能够抑制AGS和SGC-7901细胞的生长以及促进细胞凋亡（P＜0.05）。细胞侵袭和划痕愈合试验发现蒿甲醚（400 和 600 μmol/L）能够抑制AGS和SGC-7901细胞的侵袭和迁移（P＜0.05）。Western blot结果显示蒿甲醚(400 和 600 μmol/L)能够增加AGS和SGC-7901细胞的cleaved caspase-3,cleaved caspase-9以及Bax的蛋白水平（P＜0.05）;同时能够抑制N-cadherin 和vimentin的蛋白表达并促进E-cadherin蛋白的表达。结论:蒿甲醚可以显著抑制胃癌细胞的增殖、侵袭以及迁移,其机制可能是与促进细胞凋亡以及抑制上皮间质转化有关。     

胃癌细胞中COX-2通过NF-κB/Snail调控E-cadherin表达的机制

目的 探讨COX-2调控E-cadherin表达的相关信号通路及分子机制,揭示COX-2与胃癌侵袭转移的关系及作用机制.方法 采用不同浓度的选择性COX-2抑制剂塞来昔布干预人胃癌细胞株SGC-7901不同时间后,应用实时荧光定量RT-PCR法和Western blot法检测SGC-7901细胞中COX-2、NF-κB、Snail及E-cadherin mRNA和蛋白的表达情况.结果 随着塞来昔布作用剂量的增大和干预时间的延长,COX-2、NF-κB和Snail mRNA及蛋白的表达量均显著下降(P＜0.05),呈剂量和时间依赖性降低;E-cadherin mRNA及蛋白的表达量上升(P＜0.05),呈剂量和时间依赖性升高.采用Spearman相关分析,显示COX-2与NF-κB及COX-2与Snail蛋白表达呈正相关性(r =0.881,P＜0.01;r =0.839,P＜0.01);COX-2与E-cadherin蛋白表达呈负相关性(r=-0.814,P＜0.01).结论 COX-2可能通过NF-κB/Snail信号通路调控E-cadherin的表达,进而参与胃癌的浸润转移过程.     

奥曲肽对胃癌细胞转录活化蛋白-1的抑制作用

背景与目的:生长抑素是一种多功能神经肽,其本身及其类似物能抑制多种内分泌肿瘤及某些胃肠肿瘤的生长,但是否能抑制胃癌的生长并不清楚。因此,本研究拟探讨生长抑素类似物奥曲肽对胃癌细胞生长的影响及其机制。方法:不同浓度的奥曲肽作用于人胃癌SGC-7901细胞24h后,用免疫印迹法检测奥曲肽对SGC-7901细胞中c-Fos、ERK蛋白表达的影响。建立人胃癌细胞裸鼠原位移植瘤模型,奥曲肽治疗8周,观察奥曲肽对胃癌生长的影响;免疫组化法检测裸鼠人胃癌组织c-Fos和ERK表达的变化。在此基础上,采用EMSA技术检测奥曲肽对胃癌细胞AP-1活化的影响。结果:1×10-5mol/L奥曲肽可明显降低胃癌细胞的3H-TdR的掺入;奥曲肽能抑制人胃癌细胞裸鼠原位移植瘤的生长,抑瘤率为62.3%。SGC-7901胃癌细胞经不同浓度奥曲肽作用后,其c-Fos和ERK的表达水平均有不同程度下降;组织标本检测亦有类似变化。EMSA分析显示,胃癌细胞有基础水平的AP-1活化,20%血清能刺激AP-1的结合力,奥曲肽能抑制这种刺激作用。结论:奥曲肽通过抑制胃癌c-Fos、ERK蛋白的表达而抑制AP-1的结合活性,从而抑制胃癌的生长。     

Tumor-associated mesothelial cells are negative prognostic factors in gastric cancer and promote peritoneal dissemination of adherent gastric cancer cells by chemotaxis

Peritoneal dissemination is highly frequent in gastric cancer. Damage to human peritoneal mesothelial cell (HPMC) barriers provokes gastric cancer peritoneal dissemination (GCPD), the key events during GCPD, is characterized by fibroblastic development. In this study, we have studied the association between fibroblast activation protein (FAP) expression in peritoneum and the pathological features of the primary tumor. The clinical prognosis of gastric cancer patients was evaluated according to FAP expression. In a gastric cancer cell-HPMC co-culture system, expression of E-cadherin, α-smooth muscle actin, and FAP were evaluated by Western blotting. Gastric cancer cell migration and adhesion to HPMC were also assayed. Our results showed positive peritoneal staining of FAP in 36/86 cases (41.9 %), which was associated with a higher TNM stage in primary gastric cancer and higher incidence of GCPD (both p?<?0.05). Survival analysis showed FAP expression was an independent prognostic factor of poor survival (p?=?0.02). Peritoneum of FAP-positive expression exhibited a distinct fibrotic development and expressed higher level of the mesenchymal marker α-SMA, which was confirmed by the in vitro Western blot assay. In HPMC and gastric cancer cell adherence assay, SGC-7901 cells preferentially adhered to TA-HPMC at different cell densities (both p?<?0.05). Additionally, SGC-7901 cells were more prone to chemotaxis by FAP-expressed tumor-associated–human peritoneal mesothelial cells (TA-HPMC) compared with HPMC co-cultured with normal gastric glandular epithelial cells in a time-dependent manner (both p?<?0.05). Our study indicated a positive correlation between peritoneum FAP expression and GCPD. FAP-expressed TA-HPMC might be an important cellular component and instigator of GCPD.